Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Podsumowanie

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Streszczenie

Prezentujemy nowatorską platformę w postaci wielokomorowego mikrosystemu do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań interakcji aksonalno-glejowych w OUN in vitro, umożliwiającą prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle w celu zwiększenia przepustowości. Opracowaliśmy nową metodę wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych posiadających struktury w skali mikro i makro w obrębie jednego urządzenia za pomocą pojedynczego procesu soft-litografii, co umożliwia masową produkcję przy zachowaniu dobrej powtarzalności.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury składa się z jednej komory somy dla neuronów oraz sześciu komór akson/glej dla oligodendrocytów (OLs). Komora somy i komory akson/glej są połączone macierzami mikrokanałów prowadzących aksony, które pełnią funkcję barier fizycznych ograniczających somy neuronów do komory somy, jednocześnie umożliwiając wzrost aksonów do komór akson/glej. Oligodendrocy wprowadzone do komór akson/glej mogą oddziaływać wyłącznie z aksonami, a nie z somami czy dendrytami neuronów, co umożliwia prowadzenie zlokalizowanych badań nad interakcjami akson-glej. Mikrokanały zapewniają również izolację fluidyczną między komorami, co pozwala na przeprowadzenie sześciu niezależnych eksperymentów na jednym urządzeniu w celu zwiększenia przepustowości.

Miękka litografia z wykorzystaniem poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) jest powszechnie stosowaną techniką w produkcji biomedycznych mikro urządzeń. Zbiorniki w tych urządzeniach są zazwyczaj definiowane poprzez ręczne wycinanie otworów. Mimo prostoty, słabe dopasowanie oraz czasochłonność sprawiają, że proces ten nie jest odpowiedni w przypadku konieczności wielokrotnego tworzenia dużej liczby zbiorników. Nowo opracowana metoda nie wymaga ręcznego wycinania zbiorników, co pozwala pokonać te ograniczenia. Najpierw w bloku z poli(metakrylanu metylu) (PMMA) wykonano siedem zbiorników (głębokość: 3.5 mm) przy użyciu mikrofrezarki. Następnie macierze mikrostruktur w formie grzbietów, wykonane na podłożu szklanym, zostały wytłoczone na gorąco w bloku PMMA w celu zdefiniowania mikrokanałów łączących przedziały somy i aksonu/gleby. Proces ten pozwolił na uzyskanie w ramach jednej matrycy PMMA zbiorników w skali makro (3.5 mm) oraz kanałów w skali mikro (2.5 μm). Replika z PDMS, która służyła jako matryca formy, została uzyskana metodą miękkiej litografii, a finalne urządzenie z PDMS zostało odtworzone z tej matrycy.

Pierwotne neurony od szczurów w dniach embrionalnych E16-18 wprowadzono do przedziału somy i hodowano przez dwa tygodnie. Po jednym tygodniu hodowli komórkowej aksony przeszły przez mikrokanały i utworzyły warstwę sieci składającą się wyłącznie z aksonów wewnątrz przedziałów akson/glia. Aksony rosły równomiernie przez sześć przedziałów akson/glia, a w 14. dniu in vitro do przedziałów akson/glia dodano oligodendrocy (OLs) od szczurów w dniach postnatalnych P1-2 w celu stworzenia kokultury.

Protokół

Część 1: Przygotowanie formy matki do wytworzenia wielokomorowego urządzenia do kokultury neuronów

1. Pierwszym krokiem wytwarzania matrycy PMMA jest wykonanie komór o głębokości 3,5 mm. Jedna komora ciała neuronu (soma) oraz sześć komór aksonowo-glejowych zostają zdefiniowane na bloku PMMA przy użyciu mikrofrezarki (MDX-40, Roland lub jakiejkolwiek innej frezarki CNC). Następnie matryca PMMA jest poddawana sonikacji w alkoholu izopropylowym przez 10 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń.
2. Układy struktur grzbietowych o wysokości 2,5 μm są formowane na szkiełku przedmiotowym o wymiarach 50,8 mm x 50,8 mm za pomocą standardowego procesu fotolitografii, a następnie poddawane trawieniu mokremu szkła.
   Najpierw układ struktur grzbietowych jest formowany na oczyszczonym podłożu szklanym z dodatnim fotorezystem S1818 za pomocą fotolitografii. S1818 jest nanoszony na podłoże metodą spin-coatingu (4000 rpm), poddawany wstępnemu wygrzewaniu (soft bake) w temperaturze 110°C przez 5 min, a następnie naświetlany światłem UV (84 mJ/cm²) przy użyciu wyrównywacza masek, po czym następuje wywoływanie fotorezystu w MF319 przez 40 sekund. Następnie podłoże szklane z naniesionym wzorem fotorezystu jest zanurzane w buforowanym trawaczu tlenków (BOE) w temperaturze pokojowej przez 6-7 minut, aby uzyskać struktury grzbietowe o wysokości 2,5 μm. Na koniec warstwa fotorezystu jest usuwana za pomocą acetonu i alkoholu izopropylowego, a następnie dokładnie płukana w wodzie dejonizowanej (DI).
3. Podłoże szklane z mikrostrukturami grzbietowymi jest poddawane tłoczeniu na gorąco przeciwko matrycy PMMA w celu przeniesienia wzorów.
   Najpierw matryca PMMA i podłoża szklane są ręcznie wyrównywane i umieszczane w prasie termicznej. Następnie temperatura jest podnoszona do 115 °C. Po osiągnięciu pożądanej temperatury przykłada się nacisk 0,5 tony przez 5 minut. Po 5 minutach temperatura jest obniżana do 40 °C, a ciśnienie zwalniane. Matryca PMMA jest następnie wycinana w blok o rozmiarze 50,8 mm x 50,8 mm.
4. Prepolimer PDMS (Sylgard 184) jest mieszany z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1.
5. Matryca PMMA jest umieszczana w kasecie, a mieszanina PDMS jest wlewana na wierzch matrycy PMMA w celu wykonania matrycy PDMS. Jest ona następnie umieszczana w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej. Wlany na matrycę PMMA PDMS jest odgazowywany przez 15 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza powstałych podczas procesu mieszania PDMS.
6. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków PDMS jest umieszczany w wypoziomowanym piekarniku w temperaturze 85 °C na jedną godzinę w celu polimeryzacji.
7. Po całkowitym utwardzeniu PDMS, matryca PDMS jest oddzielana od matrycy PMMA i umieszczana w eksykatorze z 2-3 kroplami trichlorosilanu, a następnie poddawana próżni przez 15 minut w celu naniesienia powłoki parowej na powierzchnię matrycy PDMS. Powłoka z trichlorosilanu ułatwia oddzielenie końcowych urządzeń PDMS do kokultury neuronów od matrycy PDMS. Po nałożeniu powłoki matryca PDMS jest krótko płukana alkoholem izopropylowym w celu usunięcia nadmiaru trichlorosilanu, a następnie suszona gazem N₂.

Część 2: Replikacja urządzenia do hodowli neuronów

1. Prepolimer PDMS (Sylgard 184) miesza się z czynnikiem sieciującym w stosunku masowym 10:1.
2. Mieszaninę PDMS wlewa się na matrycę PDMS, a następnie odgazowuje w deskryptorze podłączonym do pompy próżniowej przez 15 minut. Ważne jest, aby nie wlewać zbyt dużej ilości PDMS, tak aby struktura PDMS o wysokości 3,5 mm na matrycy nie została całkowicie zanurzona.
3. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza PDMS umieszcza się w wypoziomowanym piekarniku o temperaturze 85 °C na jedną godzinę w celu polimeryzacji.
4. Po godzinie PDMS wyjmuje się z piekarnika i pozostawia do ostygnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie urządzenia do hodowli neuronów z PDMS delikatnie odkleja się od matrycy PDMS. Odklejone urządzenia PDMS owija się parafilmem, aby chronić je przed kurzem lub zanieczyszczeniami.
5. Urządzenia PDMS owinięte parafilmem tnie się na pojedyncze elementy za pomocą wiertarki stołowej wyposażonej w ostrze.

Część 3: Montaż urządzenia

1. Urządzenie PDMS do hodowli neuronów umieszcza się w oczyszczaczu plazmowym i poddaje działaniu plazmy powietrznej przez 90 sekund, aby uczynić powierzchnię urządzenia PDMS hydrofilową. Obróbka plazmą ułatwi wypełnienie mikrokanałów pożywką hodowlaną po montażu na podłożu pokrytym poli-d-lizyną.
2. Urządzenia poddane działaniu plazmy zanurza się następnie w 70 % etanolu na 30 minut w celu sterylizacji, a następnie przenosi do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza.
3. Zsterylizowane urządzenia wyjmuje się z 70 % etanolu i osusza gazem N₂ filtrowanym przez filtr Millipore. Osuszone urządzenia kładzie się na polistyrenowej płytce hodowlanej z 6 dołkami pokrytej poli-d-lizyną i delikatnie dociska, aby zapewnić szczelne połączenie między podłożem a urządzeniem.
4. Następnie do komory somy wlewa się pożywkę hodowlaną, a po niej do sześciu komór akson/gleby. Po dodaniu pożywki do komory somy zaleca się odczekać 1-2 minuty przed wypełnieniem komór akson/gleby, aby upewnić się, że w mikrokanałach nie pozostały pęcherzyki powietrza.
5. Urządzenia wypełnione pożywką hodowlaną inkubuje się w temperaturze 37 °C przez noc, aby wypłukać ewentualne zanieczyszczenia lub toksyczne pozostałości.

Część 4: Ładowanie komórek i kokultura neuronów z oligodendrocytami

1. Pierwszego dnia hodowli komórkowej pierwotne neurony przedmózgowia szczurów z 16-18 dnia embrionalnego są wprowadzane do komory somy z gęstością powierzchniową 500 cells/mm². Przed załadunkiem komórek należy odessać pipetą podłoża hodowlane z komory somy oraz z komór aksonów/gleju. Następnie do komory somy, w okolice wlotów mikrokanałów, wprowadza się 38500 komórek rozcieńczonych w 40 μl pożywki hodowlanej. Ważne jest, aby nie dotykać urządzenia PDMS podczas załadunku komórek, ponieważ może to naruszyć uszczelnienie między urządzeniem a podłożem.
2. Urządzenia z załadowanymi komórkami inkubuje się przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby zwiększyć adhezję komórek do podłoża. Po inkubacji wszystkie komory wypełnia się pożywką hodowlaną.
3. Komórki hoduje się w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5 % CO₂, wymieniając jedynie połowę pożywki hodowlanej co 3-4 dni.
4. Po 14 dniach hodowli neuronów in vitro, do komór aksonów/gleju dodaje się oligodendrocyty w celu stworzenia kokultury. Oligodendrocyty, wyizolowane z półkul mózgowych szczurów Sprague-Dawley w 1-2 dobie po urodzeniu, dodaje się do każdej komory aksonów/gleju z gęstością powierzchniową 1000 cells/mm². Przed załadunkiem komórek odsysa się pipetą około 60 % pożywki hodowlanej z komór. Należy zachować ostrożność, aby nie dotknąć dolnego podłoża, ponieważ może to uszkodzić uformowaną na nim sieć aksonalną. Następnie do komór aksonów/gleju dodaje się 6700 komórek oligodendrocytów rozcieńczonych w 5 μl pożywki hodowlanej. Komórki inkubuje się przez 1 godzinę, a następnie komory wypełnia się pożywką hodowlaną.
5. Komórki hoduje się w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5 % CO₂, wymieniając jedynie połowę pożywki hodowlanej co 3-4 dni przez kolejne dwa tygodnie.

Część 5: Reprezentatywne wyniki:

Przy prawidłowym przeprowadzeniu eksperymentów komórki neuronów umieszczone w przedziale soma lokalizują się blisko wlotów mikrokanałów, a warstwa aksonalna zaczyna formować się w przedziałach akson/glia po 1 tygodniu hodowli. Agregacja komórek neuronów w przedziale soma może wskazywać na brak zdrowotności komórek. Podczas wprowadzania oligodendrocytów po dwóch tygodniach hodowli neuronów, przedziały akson/glia powinny być pokryte gęstą warstwą aksonów, a oligodendrocyty powinny zostać załadowane na wierzch warstwy aksonalnej.

Rycina 1. Schematyczne ilustracje wysokoprzepustowej mikrofluidycznej wieloprzedziałowej platformy do kokultury neuronów OUN. Widok w przekroju pokazujący izolację aksonów od ciał neuronów (soma) i dendrytów, a także izolację fluidyczną między przedziałami przy minimalnej różnicy poziomów cieczy. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.

Rycina 2. Kroki wytwarzania i montażu wielokomorowego mikrofluidycznego urządzenia do kokultury z PDMS. Każde urządzenie pasuje do jednego dołka konwencjonalnej polistyrenowej płytki hodowlanej z 6 dołkami. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

Dyskusja

Opracowaliśmy wielokomorową platformę do kokultury w celu badania oddziaływań akson-glej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) ssaków. Aksony OUN zostały pomyślnie odizolowane od ciał komórek neuronalnych i dendrytów, a oligodendrocyty pomyślnie poddano kokulturze wewnątrz urządzenia. Gęstość neuronów może być dostosowana do zastosowania, jednak zbyt niskie lub zbyt wysokie stężenie może prowadzić do obumarcia komórek. Ważne jest również, aby wymieniać tylko połowę pożywki hodowlanej, aby nie uszkodzić komórek lub warstwy...