Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Podsumowanie

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Streszczenie

Prezentujemy nowatorską platformę w postaci wielokomorowego mikrosystemu do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań interakcji aksonalno-glejowych w OUN in vitro, umożliwiającą prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle w celu zwiększenia przepustowości. Opracowaliśmy nową metodę wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych posiadających struktury w skali mikro i makro w obrębie jednego urządzenia za pomocą pojedynczego procesu soft-litografii, co umożliwia masową produkcję przy zachowaniu dobrej powtarzalności.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury składa się z jednej komory somy dla neuronów oraz sześciu komór akson/glej dla oligodendrocytów (OLs). Komora somy i komory akson/glej są połączone macierzami mikrokanałów prowadzących aksony, które pełnią funkcję barier fizycznych ograniczających somy neuronów do komory somy, jednocześnie umożliwiając wzrost aksonów do komór akson/glej. Oligodendrocy wprowadzone do komór akson/glej mogą oddziaływać wyłącznie z aksonami, a nie z somami czy dendrytami neuronów, co umożliwia prowadzenie zlokalizowanych badań nad interakcjami akson-glej. Mikrokanały zapewniają również izolację fluidyczną między komorami, co pozwala na przeprowadzenie sześciu niezależnych eksperymentów na jednym urządzeniu w celu zwiększenia przepustowości.

Miękka litografia z wykorzystaniem poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) jest powszechnie stosowaną techniką w produkcji biomedycznych mikro urządzeń. Zbiorniki w tych urządzeniach są zazwyczaj definiowane poprzez ręczne wycinanie otworów. Mimo prostoty, słabe dopasowanie oraz czasochłonność sprawiają, że proces ten nie jest odpowiedni w przypadku konieczności wielokrotnego tworzenia dużej liczby zbiorników. Nowo opracowana metoda nie wymaga ręcznego wycinania zbiorników, co pozwala pokonać te ograniczenia. Najpierw w bloku z poli(metakrylanu metylu) (PMMA) wykonano siedem zbiorników (głębokość: 3.5 mm) przy użyciu mikrofrezarki. Następnie macierze mikrostruktur w formie grzbietów, wykonane na podłożu szklanym, zostały wytłoczone na gorąco w bloku PMMA w celu zdefiniowania mikrokanałów łączących przedziały somy i aksonu/gleby. Proces ten pozwolił na uzyskanie w ramach jednej matrycy PMMA zbiorników w skali makro (3.5 mm) oraz kanałów w skali mikro (2.5 μm). Replika z PDMS, która służyła jako matryca formy, została uzyskana metodą miękkiej litografii, a finalne urządzenie z PDMS zostało odtworzone z tej matrycy.

Pierwotne neurony od szczurów w dniach embrionalnych E16-18 wprowadzono do przedziału somy i hodowano przez dwa tygodnie. Po jednym tygodniu hodowli komórkowej aksony przeszły przez mikrokanały i utworzyły warstwę sieci składającą się wyłącznie z aksonów wewnątrz przedziałów akson/glia. Aksony rosły równomiernie przez sześć przedziałów akson/glia, a w 14. dniu in vitro do przedziałów akson/glia dodano oligodendrocy (OLs) od szczurów w dniach postnatalnych P1-2 w celu stworzenia kokultury.

Protokół

Część 1: Przygotowanie formy matki do wytwarzania wielokomorowego urządzenia do kokultury neuronów

1. Pierwszym krokiem wytwarzania matrycy z PMMA jest wykonanie komór o głębokości 3,5 mm. Jedna komora ciała komórkowego (soma) oraz sześć komór aksonowych/glejowych zostają zdefiniowane na bloku PMMA przy użyciu mikrofrezarki (MDX-40, Roland lub dowolnej innej frezarki CNC). Następnie matryca z PMMA jest poddawana sonikacji w alkoholu izopropylowym przez 10 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń.
2. Układy struktur grzebieniowych o wysokości 2,5 μm są formowane na szkiełku obiektowym o wymiarach 50,8 mm x 50,8 mm za pomocą standardowego procesu fotolitografii, a następnie poddawane trawieniu mokremu szkła.
   Najpierw układ struktur grzebieniowych jest formowany na oczyszczonym podłożu szklanym z użyciem pozytywnego fotorezystu S1818 w procesie fotolitografii. S1818 jest nanoszony metodą spin-coatingu na podłoże (4000 rpm), poddawany wstępnemu wygrzewaniu w temperaturze 110°C przez 5 min, a następnie naświetlany światłem UV (84 mJ/cm²) przy użyciu urządzenia do maskowania, po czym następuje wywoływanie fotorezystu w roztworze MF319 przez 40 sekund. Następnie podłoże szklane z naniesionym fotorezystem jest zanurzane w buforowanym trawaczu tlenków (BOE) w temperaturze pokojowej przez 6-7 minut w celu uzyskania struktur grzebieniowych o wysokości 2,5 μm. Na koniec warstwa fotorezystu jest usuwana za pomocą acetonu i alkoholu izopropylowego, a następnie dokładnie płukana w wodzie dejonizowanej (DI).
3. Podłoże szklane z mikrostrukturami grzebieniowymi jest poddawane wytłaczaniu na gorąco przeciwko matrycy z PMMA w celu przeniesienia wzorów.
   Najpierw matryca z PMMA i podłoża szklane są ręcznie wyrównywane i umieszczane w prasie termicznej. Następnie temperatura jest podnoszona do 115 °C. Po osiągnięciu pożądanej temperatury przykłada się nacisk 0,5 tony przez 5 minut. Po 5 minutach temperatura jest obniżana do 40 °C, a nacisk zwalniany. Matryca z PMMA jest następnie wycinana w blok o wymiarach 50,8 mm x 50,8 mm.
4. Prepolimer PDMS (Sylgard 184) jest mieszany z czynnikiem sieciującym w stosunku masowym 10: 1.
5. Matryca z PMMA jest umieszczana w kasecie, a na jej wierzch wlewa się mieszaninę PDMS w celu wytworzenia formy z PDMS. Następnie jest ona umieszczana w desykanatorze podłączonym do pompy próżniowej. PDMS wylany na matrycę z PMMA jest odgazowywany przez 15 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza powstałe podczas procesu mieszania PDMS.
6. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza, PDMS jest umieszczany w wypoziomowanym piekarniku w temperaturze 85 °C na jedną godzinę w celu polimeryzacji.
7. Po całkowitym utwardzeniu PDMS, forma z PDMS jest oddzielana od matrycy z PMMA i umieszczana w desykatorze z 2-3 kroplami trichlorosilanu, a następnie poddawana próżni przez 15 minut w celu pokrycia powierzchni formy z PDMS warstwą parową. Powłoka z trichlorosilanu ułatwia uwalnianie gotowych urządzeń do kokultury neuronów z PDMS z formy z PDMS. Po pokryciu forma z PDMS jest krótko płukana alkoholem izopropylowym w celu usunięcia nadmiaru trichlorosilanu i suszona gazem N₂.

Część 2: Replika urządzenia do hodowli neuronów

1. Prepolimer PDMS (Sylgard 184) miesza się z utwardzaczem w stosunku masowym 10: 1.
2. Mieszaninę PDMS wlewa się na matrycę PDMS, a następnie odgazowuje w deskrypatorze podłączonym do pompy próżniowej przez 15 minut. Należy uważać, aby nie wlać zbyt dużej ilości PDMS, tak aby struktura PDMS o wysokości 3,5 mm na matrycy nie została całkowicie zanurzona.
3. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza, PDMS umieszcza się w wypoziomowanym piekarniku w temperaturze 85 °C na jedną godzinę w celu polimeryzacji.
4. Po godzinie PDMS wyjmuje się z piekarnika i pozostawia do ostygnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie urządzenia do hodowli neuronów z PDMS delikatnie odrywa się od matrycy PDMS. Odseparowane urządzenia PDMS owija się parafilmem, aby chronić je przed kurzem i zanieczyszczeniami.
5. Urządzenia PDMS owinięte parafilmem tnie się na pojedyncze elementy za pomocą wiertarki stołowej wyposażonej w ostrze.

Część 3: Montaż urządzenia

1. Urządzenie do hodowli neuronów z PDMS umieszcza się w czyszczarce plazmowej i poddaje działaniu plazmy powietrznej przez 90 sekund, aby powierzchnia urządzenia z PDMS stała się hydrofilowa. Ta obróbka plazmowa ułatwi wypełnienie mikrokanałów pożywką hodowlaną po montażu na podłożu pokrytym poli-d-lizyną.
2. Urządzenia poddane działaniu plazmy zanurza się następnie w 70 % etanolu na 30 minut w celu sterylizacji, a następnie przenosi do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza.
3. Zesterylizowane urządzenia wyjmuje się z 70 % etanolu i osusza gazem N₂ filtrowanym przez filtr Millipore. Osuszone urządzenia umieszcza się na polistyrenowej 6-dołkowej płytce hodowlanej pokrytej poli-d-lizyną i wywiera lekki nacisk, aby zapewnić szczelne połączenie między podłożem a urządzeniem.
4. Następnie do komory somy wlewa się pożywkę hodowlaną, a w kolejnym kroku wypełnia sześć komór aksonów/gleju. Zaleca się odczekać 1-2 minuty po dodaniu pożywki do komory somy przed wypełnieniem komór aksonów/gleju, aby upewnić się, że w mikrokanałach nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza.
5. Urządzenia wypełnione pożywką hodowlaną inkubuje się w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc w celu wypłukania ewentualnych zanieczyszczeń lub toksycznych pozostałości.

Część 4: Ładowanie komórek i kokultura neuronów z oligodendrocytami

1. Pierwszego dnia hodowli komórkowej pierwotne neurony przedmózgia szczurów z 16-18 dnia embrionalnego są wprowadzane do komory somy z gęstością powierzchniową 500 cells/mm². Przed wprowadzeniem komórek za pomocą pipety odsysa się pożywkę z komory somy oraz z komór aksonu/gleju. Następnie 38500 komórek, rozcieńczonych w 40 μl pożywki hodowlanej, wprowadza się do komory somy w okolicy wlotów mikrokanałów. Ważne jest, aby nie dotykać urządzenia PDMS podczas wprowadzania komórek, ponieważ może to naruszyć uszczelnienie między urządzeniem a podłożem.
2. Urządzenia z wprowadzonymi komórkami inkubuje się przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby zwiększyć adhezję komórek do podłoża. Po inkubacji wszystkie komory wypełnia się pożywką hodowlaną.
3. Komórki hoduje się w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżoną atmosferą zawierającą 5 % CO₂, wymieniając jedynie połowę pożywki hodowlanej co 3-4 dni.
4. Po 14 dniach hodowli neuronów in vitro do komór aksonu/gleju dodaje się oligodendrocyty w celu stworzenia kokultury. Oligodendrocyty, wyizolowane z półkul mózgowych szczurów Sprague-Dawley w 1-2 dniu postnatalnym, dodaje się do każdej komory aksonu/gleju z gęstością powierzchniową 1000 cells/mm². Przed wprowadzeniem komórek za pomocą pipety odsysa się około 60 % pożywki z komór. Należy zachować ostrożność, aby nie dotknąć dolnego podłoża, gdyż może to uszkodzić sieć aksonalną utworzoną na podłożu. Następnie 6700 komórek oligodendrocytów, rozcieńczonych w 5 μl pożywki hodowlanej, dodaje się do komór aksonu/gleju. Komórki inkubuje się przez 1 godzinę, a następnie komory wypełnia się pożywką hodowlaną.
5. Komórki hoduje się w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżoną atmosferą zawierającą 5 % CO₂, wymieniając jedynie połowę pożywki hodowlanej co 3-4 dni przez kolejne dwa tygodnie.

Część 5: Reprezentatywne wyniki:

Przy prawidłowym przeprowadzeniu eksperymentów komórki neuronów załadowane do przedziału somy lokalizują się w pobliżu wlotów mikrokanałów, a po 1 tygodniu hodowli w przedziałach akson/gleba zaczyna tworzyć się warstwa aksonalna. Agregacja komórek neuronów w przedziale somy może świadczyć o tym, że komórki nie są zdrowe. Podczas ładowania oligodendrocytów po dwóch tygodniach hodowli neuronów przedziały akson/gleba powinny być pokryte gęstą warstwą aksonów, a oligodendrocy powinny zostać załadowane na wierzch warstwy aksonalnej.

Rycina 1. Schematy wysokoprzepustowej mikrofluidycznej wielokomorowej platformy do kokultury neuronów OUN. Widok w przekroju przedstawiający izolację aksonów od somy neuronalnej i dendrytów, a także izolację fluidyczną między komorami przy minimalnej różnicy poziomów cieczy. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.

Rycina 2. Etapy wytwarzania i montażu wielokomorowego mikrofluidycznego urządzenia do kokultury z PDMS. Każde urządzenie pasuje do jednego dołka konwencjonalnej polistyrenowej płytki hodowlanej z 6 dołkami. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

Dyskusja

Opracowaliśmy wielokomorową platformę do kokultury w celu badania oddziaływań akson-glej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) ssaków. Aksony OUN zostały pomyślnie odizolowane od ciał komórek neuronalnych i dendrytów, a oligodendrocyty pomyślnie poddano kokulturze wewnątrz urządzenia. Gęstość neuronów może być dostosowana do zastosowania, jednak zbyt niskie lub zbyt wysokie stężenie może prowadzić do obumarcia komórek. Ważne jest również, aby wymieniać tylko połowę pożywki hodowlanej, aby nie uszkodzić komórek lub warstwy...