Opisujemy szybką i skuteczną metodę oczyszczania mitochondriów z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta umożliwia wysokowydajną izolację czystych mitochondriów, które są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami i zachowują swoją integralność strukturalną oraz funkcjonalną po oczyszczeniu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oczyszczanie mitochondriów z komórek drożdży
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitochondria są głównym miejscem produkcji ATP podczas metabolizmu tlenowego w eukariotycznych komórkach niezdolnych do fotosyntezy1Te złożone organelle odgrywają również kluczowe role w apoptotycznej śmierci komórki2, przeżywalność komórek3, rozwój ssaków4, rozwój i funkcje neuronów4, sygnalizacja wewnątrzkomórkowa5, oraz regulację długowieczności6Nasze zrozumienie tych złożonych procesów biologicznych kontrolowanych przez mitochondria opiera się na rzetelnych metodach oceny ich morfologii, składu białkowego i lipidowego, integralności ich DNA oraz licznych funkcji życiowych. Drożdże pączkująceSaccharomyces cerevisiae, genetycznie i biochemicznie manipulowalny jednokomórkowy eukariot z adnotowanym genomem i dobrze zdefiniowanym proteomem, stanowi cenny model do badania molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw kluczowych funkcji biologicznych mitochondriów. W tego typu badaniach kluczowe jest uzyskanie wysokiej czystości mitochondriów. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy opis szybkiej i skutecznej metody oczyszczania mitochondriów drożdży. Metoda ta umożliwia izolację wysokiej czystości mitochondriów, które są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami i zachowują swoją integralność strukturalną oraz funkcjonalną po oczyszczeniu. Mitochondria oczyszczone tą metodą nadają się do bezzakomórkowej rekonstrukcji kluczowych procesów mitochondrialnych i mogą być wykorzystywane do analizy struktury i funkcji mitochondriów, proteomu i lipidomu mitochondrialnego oraz mitochondrialnego DNA.
Protokół
Materiały i metody
Szczepy drożdży i warunki hodowli
Szczep typu dzikiego BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) hodowano w bogatym medium YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptony, 2% glukozy). Komórki hodowano w temperaturze 30°C w kolbach Erlenmeyera przy wytrząsaniu obrotowym z prędkością 200 rpm, zachowując stosunek objętości kolby do objętości medium wynoszący 5:1.
Izolacja surowej frakcji mitochondrialnej
- Hodować 1 L kultury szczepu typu dzikiego BY4742 przez 48 h.
- Przelać kulturę do 500-ml probówek wirówkowych Nalgene. Zbilansować obciążenie i zebrać komórki poprzez wirowanie przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
- Odlać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 250 ml dH2O. Odwirować komórki przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
- Odlać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 250 ml dH2O. Odwirować komórki przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
- Wyznaczyć masę mokrą osadu komórkowego.
- Resuspendować osad komórkowy w buforze DTT [2 ml buforu/g (masa mokra) komórek].
- Przenieść zawiesinę komórkową do 50-ml plastikowych probówek Falcon.
- Rotować probówki z prędkością 70 rpm w inkubatorze wytrząsowym przez 20 min w temperaturze 30°C.
- Zebrać komórki poprzez wirowanie przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
- Resuspendować osad komórkowy w buforze z Zymolyase bez Zymolyase [7 ml buforu/g (masa mokra) komórek].
- Odwirować komórki przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
- Resuspendować osad komórkowy w buforze z Zymolyase bez Zymolyase [7 ml buforu/g (masa mokra) komórek].
- Przenieść zawiesinę komórkową do kolby szklanej.
- Dodać proszek Zymolyase-100T [1 mg Zymolyase-100T/g (masa mokra) komórek] do zawiesiny komórkowej.
- Rotować kolbę z zawiesiną komórkową z prędkością 70 rpm w inkubatorze wytrząsowym przez 30 min w temperaturze 30°C.
- Przenieść sferoplasty powstałe w wyniku trawienia ściany komórkowej za pomocą Zymolyase-100T do 50-ml plastikowych probówek wirówkowych.
- Odwirować sferoplasty przez 8 min przy 2200 x g w temperaturze 4°C.
**Wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać w temperaturze 4°C lub w lodzie. Zawiesiny sferoplastów należy traktować ostrożnie, używając pipet z odciętymi końcówkami, aby uniknąć uszkodzenia organelli.**
- Resuspenduj osad sferoplastów w lodowatym buforze do homogenizacji [6,5 ml buforu/g (masy mokrej) komórek].
- Odwiruj sferoplasty przez 8 min przy 2200 x g w temperaturze 4°C.
- Resuspenduj osad sferoplastów w lodowatym buforze do homogenizacji [6,5 ml buforu/g (masy mokrej) komórek].
- Przenieś komórki do schłodzonego na lodzie szklanego homogenizatora.
- Używając dopasowanego tłuczka, homogenizuj komórki, wykonując 15 ruchów tłuczkiem.
- Dodaj 1 objętość lodowatego buforu do homogenizacji.
- Przenieś zhomogenizowane sferoplasty do plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
- Odwiruj nieuszkodzone komórki, jądra i duże resztki komórkowe przez 5 min przy 1500 x g w temperaturze 4°C.
- Odwiruj otrzymany nadsącz przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze 4°C.
- Odwiruj otrzymany nadsącz przez 15 min przy 12000 x g w temperaturze 4°C.
- Zlej nadsącz i resuspenduj osad w lodowatym buforze do homogenizacji [6,5 ml buforu/g (masy mokrej) komórek].
- Odwiruj przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze 4°C.
- Odwiruj otrzymany nadsącz przez 15 min przy 12000 x g w temperaturze 4°C.
- Zlej nadsącz i resuspenduj osad w 3 ml lodowatego buforu do SEM.
**Choć zawiesina ta jest wzbogacona w mitochondria, zawiera ona również inne organelle, takie jak retikulum endoplazmatyczne (mikrosomy), aparat Golgiego i wakuole. Aby uzyskać czyste mitochondria, tę surową frakcję mitochondrialną można poddać dalszemu frakcjonowaniu, zgodnie z opisem poniżej.**
Oczyszczanie mitochondriów pozbawionych zanieczyszczeń innymi organellami
- Do probówki wirówki Beckman Ultra-Clear nalać 1,5 ml schłodzonej do temperatury lodu 60% (w/v) sacharozy w buforze EM.
- Na 60% (w/v) sacharozę nanieść warstwowo 4 ml 32%, 1,5 ml 23% oraz 1,5 ml 15% sacharozy (wszystkie stężenia wt/v w buforze EM).
- Na wierzch 15% (w/v) sacharozy nanieść 3 ml surowej frakcji mitochondrialnej w buforze SEM.
- Wirować w rotorze z ruchomymi koszyczkami Beckman SW41 Ti przez 1 h przy 134000 x g (33000 rpm) w temperaturze 4°C.
- Nienaruszone mitochondria tworzą brązowy prążek na granicy faz 60%/32% sacharozy.
- Ostrożnie usuwać sacharozę, aż do osiągnięcia prążka mitochondrialnego.
- Pobrać prążek mitochondrialny za pomocą pipety z odciętą końcówką i przenieść go do probówki wirówki Beckman przeznaczonej dla rotora MLS-5.
- Wypełnić probówkę buforem SEM.
- Utrącić czyste mitochondria poprzez wirowanie w rotorze MLS-5 przez 30 min przy 10000 x g (31000 rpm) w temperaturze 4°C.
- Odlać nadosad za pomocą pipety.
- Czyste mitochondria wykorzystać do analizy funkcji mitochondrialnych, proteomu i lipidomu mitochondrialnego oraz mitochondrialnego DNA.
Odczynniki
- Bufor DTT [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9.4), 10 mM ditiotreitol] (na 15 ml)
- 1,5 ml buforu 1 M Tris/H2SO4 (pH 9.4)
- 150 μl 1 M DTT
- Dopełnić objętość do 15 ml
- Bufor z zymolazą [20 mM fosforan potasu (pH 7.4), 1,2 M sorbitol] (na 100 ml)
- 2 ml buforu 1 M fosforan potasu (pH 7.4)
- 60 ml 2 M sorbitolu
- Dopełnić objętość do 100 ml
- Bufor do homogenizacji [10 mM Tris/HCl (pH 7.4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w/v) BSA] (na 250 ml]
- 2,5 ml buforu 1 M Tris/HCl (pH 7.4)
- 75 ml 2 M sorbitolu
- 500 μl 500 mM EDTA
- 0,5 g BSA
- Dopełnić objętość do 250 ml
- Bufor do SEM [10 mM MOPS/KOH (pH 7.2), 250 mM sacharoza, 1 mM EDTA] (na 250 ml)
- 2,5 ml buforu 1 M MOPS/KOH (pH 7.2)
- 31,25 ml 2 M sacharozy
- 500 μl 500 mM EDTA
- Dopełnić objętość do 250 ml
- Bufor do EM [10 mM MOPS/KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA] (na 250 ml)
- 2,5 ml buforu 1 M MOPS/KOH (pH 7.2)
- 500 μl 500 mM EDTA
- Dopełnić objętość do 250 ml
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda ta umożliwia wysokowydajną izolację czystych mitochondriów z komórek drożdży. Mitochondria oczyszczone tą metodą są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami i zachowują swoją integralność strukturalną oraz funkcjonalną po oczyszczeniu. Opisana metoda pozwala na uzyskanie mitochondriów odpowiednich do bezkomórkowej rekonstytucji kluczowych procesów mitochondrialnych. Te wysokiej czystości mitochondria mogą być również wykorzystywane do analizy struktury i funkcji mitochondriów, proteomu i lipidomu mito...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez granty z CIHR oraz NSERC w Kanadzie. V.I.T. jest Nowym Badaczem CIHR oraz Katedrą Badawczą Uniwersytetu Concordia w zakresie genomiki, biologii komórki i starzenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Voet, D., Voet, J. G. Biochemistry. , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).
- Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &, Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120, 483-495 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
