Oczyszczanie mitochondriów z komórek drożdży

Podsumowanie

Opisujemy szybką i skuteczną metodę oczyszczania mitochondriów z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta umożliwia wysokowydajną izolację czystych mitochondriów, które są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami i zachowują swoją integralność strukturalną oraz funkcjonalną po oczyszczeniu.

Streszczenie

Mitochondria są głównym miejscem produkcji ATP podczas metabolizmu tlenowego w eukariotycznych komórkach niezdolnych do fotosyntezy¹Te złożone organelle odgrywają również kluczowe role w apoptotycznej śmierci komórki², przeżywalność komórek³, rozwój ssaków⁴, rozwój i funkcje neuronów⁴, sygnalizacja wewnątrzkomórkowa⁵, oraz regulację długowieczności⁶Nasze zrozumienie tych złożonych procesów biologicznych kontrolowanych przez mitochondria opiera się na rzetelnych metodach oceny ich morfologii, składu białkowego i lipidowego, integralności ich DNA oraz licznych funkcji życiowych. Drożdże pączkująceSaccharomyces cerevisiae, genetycznie i biochemicznie manipulowalny jednokomórkowy eukariot z adnotowanym genomem i dobrze zdefiniowanym proteomem, stanowi cenny model do badania molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw kluczowych funkcji biologicznych mitochondriów. W tego typu badaniach kluczowe jest uzyskanie wysokiej czystości mitochondriów. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy opis szybkiej i skutecznej metody oczyszczania mitochondriów drożdży. Metoda ta umożliwia izolację wysokiej czystości mitochondriów, które są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami i zachowują swoją integralność strukturalną oraz funkcjonalną po oczyszczeniu. Mitochondria oczyszczone tą metodą nadają się do bezzakomórkowej rekonstrukcji kluczowych procesów mitochondrialnych i mogą być wykorzystywane do analizy struktury i funkcji mitochondriów, proteomu i lipidomu mitochondrialnego oraz mitochondrialnego DNA.

Protokół

Materiały i metody

Szczepy drożdży i warunki hodowli

Szczep typu dzikiego BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) hodowano w bogatym medium YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptony, 2% glukozy). Komórki hodowano w temperaturze 30°C w kolbach Erlenmeyera przy wytrząsaniu obrotowym z prędkością 200 rpm, zachowując stosunek objętości kolby do objętości medium wynoszący 5:1.

Izolacja surowej frakcji mitochondrialnej

1. Hodować 1 L kultury szczepu typu dzikiego BY4742 przez 48 h.
2. Przelać kulturę do 500-ml probówek wirówkowych Nalgene. Zbilansować obciążenie i zebrać....

Dyskusja

Metoda ta umożliwia wysokowydajną izolację czystych mitochondriów z komórek drożdży. Mitochondria oczyszczone tą metodą są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami i zachowują swoją integralność strukturalną oraz funkcjonalną po oczyszczeniu. Opisana metoda pozwala na uzyskanie mitochondriów odpowiednich do bezkomórkowej rekonstytucji kluczowych procesów mitochondrialnych. Te wysokiej czystości mitochondria mogą być również wykorzystywane do analizy struktury i funkcji mitochondriów, proteomu i lipidomu mito.......