Sonda mikroprzepływowa: zasada działania i zastosowanie w lokalnej obróbce powierzchni

Podsumowanie

W tym filmie prezentujemy mikrofluidyczną sondę¹ (MFP). Szczegółowo wyjaśniamy, jak złożyć MFP, zamontować ją na mikroskopie odwróconym i wycentrować względem powierzchni podłoża, a na koniec pokazujemy, jak wykorzystać ją do obróbki powierzchni podłoża zanurzonego w roztworze buforowym.

Streszczenie

Urządzenia mikroprzepływowe umożliwiają przeprowadzanie analiz z wykorzystaniem minimalnych ilości próbek i w ostatnim czasie były stosowane do kontrolowania mikrośrodowiska komórek. Mikroprzepływy są zazwyczaj kojarzone z zamkniętymi mikrokanałami, co ogranicza ich zastosowanie do próbek, które można wprowadzić, a w przypadku komórek – hodować w ograniczonej objętości. Z kolei systemy mikro-pipetowania były wykorzystywane do lokalnej perfuzji komórek i powierzchni, w szczególności przy użyciu układów typu push-pull, w których jedna pipeta pełni rolę źródła, a druga odpływu, jednak ograniczenie przepływu w trzech wymiarach jest trudne do osiągnięcia. Co więcej, pipety są delikatne i trudne do precyzyjnego ustawienia, przez co są stosowane wyłącznie w konfiguracji statycznej.

Sonda mikrofluidyczna (MFP) omija ograniczenia wynikające z konstrukcji zamkniętych kanałów mikrofluidycznych i zamiast zamykać próbkę w systemie mikrofluidycznym, pozwala na bezpośrednie dostarczanie przepływu mikrofluidycznego na próbkę oraz skanowanie próbki za pomocą MFP. Otwory wtryskowe i ssące znajdują się w odległości kilkudziesięciu mikrometrów od siebie, dzięki czemu mikrostrumień wtryskiwany w szczelinę jest ograniczony siłami hydrodynamicznymi otaczającego płynu i w całości zasysany z powrotem przez drugi otwór. Mikrostrumień może być przemieszczany po powierzchni podłoża, stanowiąc precyzyjne narzędzie do lokalnej depozycji/dostarczania odczynników, które można stosować na dużych obszarach poprzez skanowanie powierzchni sondą. W tym filmie prezentujemy sondę mikrofluidyczną¹ (MFP). Szczegółowo wyjaśniamy, jak złożyć MFP, zamontować ją na mikroskopie odwróconym i wyrównać ją względem powierzchni podłoża, a na koniec pokazujemy, jak użyć jej do obróbki powierzchni podłoża zanurzonego w buforze.

Protokół

1. Mikrowytwarzanie głowicy sondy (proces nie pokazany na filmie)

1. Wafer Si² o średnicy czterech cali i grubości 525 μm, z warstwą termiczną SiO2 o grubości 1 μm, zostaje pokryty fotorezystem (PR) metodą spin-coatingu przez 45 s przy 4000 rpm.
2. Wafer jest wstępnie wypalany w temperaturze 110C przez 50 s, a następnie naświetlany przez maskę zawierającą wszystkie elementy (porty i mikrokanały) przez 5 s, wywoływany i płukany w wodzie DI.
3. Nieosłonięty SiO2 jest trawiony w roztworze buforowanego kwasu fluorowodorowego (BHF) w stosunku 1:7 przez ≈15 min (zakończenie trawienia sygnalizuje utrata zwilżalności podłoża w miejscach, gdzie SiO2 został wytrawiony). Do usuwania pozostałego PR stosuje się plazmę O2 lub aceton.
4. Druga warstwa PR jest nakładana metodą spin-coatingu przy 1500 rpm przez 45 s, co pozwala uzyskać grubą warstwę wierzchnią o grubości ≈10 μm [31]. Wzór SiO2 pod tą warstwą PR pozostaje widoczny i służy do wyrównania wafera z drugą maską zawierającą wyłącznie porty.
5. Po naświetleniu i wywołaniu PR, wafer jest płukany, suszony i wypalany po procesie w temperaturze 95C przez 20 min.
6. Wafer Si jest przytwierdzony do wafera wspierającego za pomocą stopionego białego wosku w celu ochrony uchwytu.
7. Do przeniesienia wzorów PR i osadzonego SiO2 na topografię wafera stosuje się trawienie reaktywne z jonizacją głęboką (ICP DRIE) w procesie trzystopniowym:
   1. DRIE w celu wykonania portów o głębokości ≈500μm w Si (wzór zdefiniowany przez grubą warstwę PR).
   2. Bez wyjmowania wafera z urządzenia DRIE, PR jest usuwany za pomocą plazmy.
   3. Odsłonięty wzór SiO2 służy jako maska dla drugiego procesu trawienia suchego, w wyniku którego powstają kanały o głębokości 50 μm oraz otwory w waferze dla portów napełniających i odpowietrzających. Po wyjęciu z urządzenia, wafer wspierający jest oddzielany pod strumieniem ciepłej wody. Następnie mikroobrobiony wafer jest czyszczony acetonem, etanolem i wodą DI.
8. Pojedyncze chipy MFP są wycinane.
9. Blok interfejsowy z PDMS jest wytwarzany poprzez odlewanie w mikromformie składającej się z dwóch ustrukturyzowanych elementów z poli(metakrylanu metylu) (PMMA), polerowanej stalowej płyty tworzącej dno oraz dwóch kapilar (każda włożona w jeden z dwóch otworów dostępowych w stalowej płycie), które służą jako wypełniacze dla otworów połączeń fluidycznych. PDMS jest utwardzany w piecu w temperaturze 60C przez co najmniej 1 h.
10. Blok PDMS jest łączony z wyciętym krzemowym chipem MFP poprzez aktywację obu części w plazmie powietrznej przy ciśnieniu 1 mbar przez 24 s przy mocy 230W, a następnie połączenie obu części przy użyciu własnoręcznie wykonanego przyrządu do wyrównywania mechanicznego.
11. Zestaw jest pozostawiany do związania w piecu w temperaturze 60C przez minimum 1 godzinę.

2. Montaż urządzenia MFP

1. Szklane strzykawki gazoszczelne napełnia się odpowiednimi odczynnikami za pomocą plastikowych strzykawek i igieł, aby upewnić się, że nie ma w nich pęcherzyków powietrza. Zazwyczaj do wtryskiwania stosujemy strzykawkę o objętości 1 -10 µL, a do aspiracji strzykawkę o objętości 5-10 razy większej.
2. Strzykawki są łączone z kapilarami za pomocą złączy Nanotight o niskiej objętości martwej.
3. Kapilary są napełniane, a następnie pod mikroskopem sprawdzane pod kątem obecności pęcherzyków.
4. Chip MFP jest wstępnie napełniany roztworem buforu, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza podczas podłączania kapilar.
5. Kapilary są wkładane do elementu połączeniowego z PDMS w głowicy sondy.

3. Konfiguracja MFP

1. Głowicę sondy zaciskamy w uchwycie sondy i montujemy na stacji sondowania umieszczonej na mikroskopie odwróconym
2. Strzykawki umieszczamy w precyzyjnych pompach strzykawkowych.
3. Podłoże, takie jak szkiełko przedmiotowe, wkładamy do wykonanego własnoręcznie uchwytu przymocowanego do stolika mikroskopu.
4. Równoległość plateau MFP i podłoża regulujemy za pomocą pary goniometrów, obserwując pierścienie Newtona (prążki interferencyjne), które pojawiają się w momencie zetknięcia MFP z podłożem. Punkt styku oraz częstotliwość pierścieni służą jako wskaźnik pochylenia. Gdy MFP jest wyrównany z powierzchnią, pojedynczy pierścień interferencyjny rozciąga się nad całą powierzchnią. Pomiar ten służy również do kalibracji odstępu między MFP a podłożem.
5. Przerwa między MFP a podłożem jest krytyczna dla procesów wzorkowania powierzchni. Ponieważ podłoże jest obrabiane poprzez skanowanie go pod MFP, wyrównanie poziome musi być dostrojone z mikrometryczną precyzją, co osiąga się za pomocą trójpunktowego wsparcia utworzonego przez trzy śruby mikrometryczne.

4. Obsługa MFP

1. Dozowanie jest kontrolowane za pomocą oprogramowania LabView. Praca urządzenia jest wizualizowana bezpośrednio oraz przy użyciu kamery CCD. Stosunek wstrzykiwania do aspiracji waha się od 1:3 do 1:10, w zależności od dyfuzyjności odczynnika w otaczającym buforze oraz pożądanego geometrycznego wzoru przepływu.
2.  Aby sprawdzić prawidłowe działanie strzykawki aspiracyjnej oraz obecność pęcherzyków powietrza, przed rozpoczęciem właściwej aspiracji należy najpierw wstrzyknąć ciecz za pomocą strzykawki aspiracyjnej.
3. Rozpocząć wstrzykiwanie cieczy i monitorować przepływ oraz ograniczenie kulek lub fluorescencyjnego barwnika śledzącego.
4. Użyć sondy do konkretnej aplikacji, np. przeskanować powierzchnię w celu przeprowadzenia procesu osadzania, trawienia lub barwienia powierzchni bądź komórek.

Dyskusja

Sonda mikrofluidyczna (MFP) jest wszechstronna, ponieważ jest (i) mobilna, (ii) możliwa do dostosowania do różnych rodzajów odczynników i podłoży oraz (iii) może być obsługiwana na dużych obszarach.

Niepożądane pęcherzyki powietrza mogą prowadzić do zaburzeń przepływu. Aby ich uniknąć, wszystkie komponenty muszą zostać wypełnione cieczami przed montażem.  Przerwa między sondą a powierzchnią wynosi zaledwie kilka mikrometrów, podczas gdy platforma (mesa) ma szerokość kilkuset mikrometrów,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
złącza mikrofluidyczne	Upchurch Scientific	złączki i tulejki Micro- oraz Nano-tight
dwuskładnikowy dozownik ręczny	Conprotec Inc.	DM400	Do dozowania i mieszania mieszaniny PDMS
LabVIEW	National Instruments	Wersja 8.0
piec z wymuszonym obiegiem powietrza	VWR international	1330FM
strzykawki szklane	Hamilton Co
kapilary	Polymicro Technologies
komora plazmowa	Tegal Corporation	Plasmaline 415
mikroskop odwrócony	Nikon Instruments	TE2000-E
pompy strzykawkowe	Cetoni	neMESYS
Sylgard 184	Ellsworth Adhesives	184 Sil Elast Kit
kamera	Photometrics	QuantEM 512SC
stół mikroskopowy
goniometry do uchwytów sond mikrofluidycznych	Melles Griot	07GON504
przesuw linearny	Applied Scientific Instrumentation	LS-50	Do kontroli osi z MFP
ręczny przesuw linearny	Newport Corp.	Seria 443-4	Do kontroli osi x i y MFP
stół mikroskopowy	Applied Scientific Instrumentation	PZ-2000	Z kontrolą osi x, y i z