Sonda mikroprzepływowa: działanie i zastosowanie do miejscowej obróbki powierzchni

Summary

W tym filmie prezentujemy sondę mikroprzepływową¹ (MFP). Wyjaśniamy szczegółowo, jak zmontować urządzenie wielofunkcyjne, zamontować je na odwróconym mikroskopie i wyrównać względem powierzchni podłoża, a na koniec pokazujemy, jak używać go do obróbki powierzchni podłoża zanurzonej w roztworze buforowym.

Abstract

Urządzenia mikroprzepływowe pozwalają na przeprowadzanie testów przy użyciu niewielkich ilości próbek, a ostatnio były używane do kontrolowania mikrośrodowiska komórek. Mikrofluidyka jest powszechnie kojarzona z zamkniętymi mikrokanałami, co ogranicza jej zastosowanie do próbek, które mogą być wprowadzane i hodowane w przypadku komórek w ograniczonej objętości. Z drugiej strony, system mikropipetowania był używany do miejscowej perfuzji komórek i powierzchni, w szczególności przy użyciu konfiguracji push-pull, w których jedna pipeta działa jako źródło, a druga jako zlew, ale ograniczenie przepływu jest trudne w trzech wymiarach. Ponadto pipety są delikatne i trudne do ustawienia, dlatego są używane tylko w konfiguracji statycznej.

Sonda mikroprzepływowa (MFP) omija ograniczenia wynikające z budowy zamkniętych kanałów mikroprzepływowych i zamiast zamykać próbkę w układzie mikroprzepływowym, przepływ mikroprzepływowy może być bezpośrednio dostarczony do próbki i skanowany przez próbkę za pomocą urządzenia wielofunkcyjnego. Otwory iniekcyjne i aspiracyjne znajdują się w odległości kilkudziesięciu mikrometrów od siebie, tak że mikrostrumień wstrzyknięty do szczeliny jest ograniczony przez siły hydrodynamiczne otaczającej cieczy i całkowicie zasysany z powrotem do drugiego otworu. Mikrostrumień może być przepłukiwany po powierzchni podłoża i zapewnia precyzyjne narzędzie do miejscowego osadzania/dostarczania odczynników, które można stosować na dużych obszarach, skanując sondę po powierzchni. W tym filmie prezentujemy sondę mikroprzepływową¹ (MFP). Wyjaśniamy szczegółowo, jak zmontować urządzenie wielofunkcyjne, zamontować je na mikroskopie odwróconym i wyrównać względem powierzchni podłoża, a na koniec pokazujemy, jak go używać do obróbki powierzchni podłoża zanurzonej w buforze.

Protocol

1. Mikrofabrykacja głowicy sondy (proces nie pokazany na filmie)

1. Wafel Si²o średnicy czterech cali i grubości 525 μm z termiczną warstwą SiO2 o grubości 1 μm jest powlekany fotorezystem (PR) przez 45 s przy 4000 obr./min.
2. Wafel jest wstępnie wypiekany w temperaturze 110C przez 50 s i naświetlany przez maskę zawierającą wszystkie elementy (porty i mikrokanały) przez 5 s, wywoływany i płukany w DI.
3. Odkryty SiO2 wytrawia się w roztworze kwasu fluorowodorowego (BHF) w stosunku 1:7 w ciągu ≈15 min (odwilżenie podłoża, na którym wytrawiono SiO2, wskazuje na zakończenie wytrawiania). Do spopielania lub usuwania pozostałego PR używa się osocza O2 lub acetonu.
4. Druga warstwa PR jest powlekana wirowo z prędkością 1500 obr./min przez 45 s, uzyskując grubą warstwę wierzchnią o grubości ≈10 μm [31]. Wzór SiO2 pod tą warstwą PR jest nadal widoczny i służy do wyrównania płytki z drugą maską zawierającą tylko porty.
5. Po naświetleniu i wywołaniu PR wafel jest płukany, suszony i wypiekany w temperaturze 95C przez 20 minut.
6. Wafel Si jest mocowany do płytki nośnej za pomocą stopionego białego wosku w celu ochrony uchwytu.
7. DRIE z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP) służy do przenoszenia wzorców PR i osadzonego SiO2 do topografii płytek w trzyetapowym procesie:
   1. DRIE, aby przekształcić porty o głębokości ≈500 μm w Si (wzór zdefiniowany przez gruby PR).
   2. Bez rozładowywania wafla z maszyny DRIE, PR jest wydrapywany za pomocą plazmy.
   3. Odsłonięty wzór SiO2 działa jak maska dla drugiego procesu wytrawiania na sucho, tworząc kanały o głębokości 50 μm i otwierając porty napełniania i odpowietrzania przez płytkę. Po rozładowaniu wafel podporowy odłącza się pod strumieniem ciepłej wody. Zmikroobrabiana płytka jest następnie czyszczona acetonem, etanolem i DI.
8. Poszczególne żetony MFP są krojone w kostkę.
9. Blok interfejsu PDMS jest wytwarzany przez odlewanie do mikroformy składającej się z dwóch strukturalnych elementów z poli(metakrylanu metylu) (PMMA), polerowanej stalowej płyty tworzącej dno i dwóch kapilar (każda włożona do jednego z dwóch przelotek - otworów dostępowych - w stalowej płycie) służących jako uchwyty zastępcze dla otworów połączeniowych płynów. PDMS utwardza się w piecu w temperaturze 60C przez co najmniej 1 godzinę.
10. Blok PDMS jest połączony z pokrojonym w kostkę krzemowym chipem MFP poprzez aktywację obu części w plazmie powietrznej przy 1 mbar przez 24 s przy 230 W i połączenie ich ze sobą za pomocą domowej roboty mechanicznego wspomagania wyrównywania.
11. Montaż pozostawia się do sklejenia w piekarniku o temperaturze 60C na minimum 1 godzinę

2. Montaż urządzenia wielofunkcyjnego

1. Gazoszczelne szklane strzykawki są napełniane odpowiednimi odczynnikami za pomocą plastikowych strzykawek i igieł, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Zazwyczaj do wstrzykiwań używamy strzykawki o pojemności 1-10 mikrolitrów, a do aspiracji strzykawki o 5-10 razy większej objętości.
2. Strzykawki są podłączone do rurki kapilarnej za pomocą złączek Nanotight o małej objętości martwej.
3. Kapilary są wypełniane i sprawdzane pod mikroskopem pod kątem pęcherzyków.
4. Chip MFP jest wstępnie wypełniony roztworem buforowym, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków podczas łączenia naczyń włosowatych.
5. Kapilary są wpięte w element przyłączeniowy PDMS w głowicy sondy

3. Konfiguracja urządzenia wielofunkcyjnego

1. Głowica sondy jest zaciśnięta w uchwycie sondy i zamontowana na stacji pomiarowej na szczycie odwróconego mikroskopu
2. Strzykawki są umieszczane w precyzyjnych pompach strzykawkowych.
3. Podłoże, takie jak szklane szkiełko, jest wkładane do domowego uchwytu, który jest przymocowany do stolika mikroskopu.
4. Równoległość mezy MFP i podłoża jest regulowana za pomocą pary goniometrów, obserwując pierścienie Newtona (prążki interferencyjne), które pojawiają się, gdy MFP styka się z podłożem. Punkt styku i częstotliwość pierścieni służą jako wskazanie nachylenia. Gdy urządzenie wielofunkcyjne jest wyrównane z powierzchnią, pojedynczy pierścień przenikający rozciąga się na całej powierzchni. Środek ten służy również do kalibracji separacji między urządzeniem wielofunkcyjnym a substratem.
5. Szczelina między urządzeniem wielofunkcyjnym a podłożem ma kluczowe znaczenie dla procesów modelowania powierzchni. Ponieważ podłoże jest przetwarzane poprzez skanowanie go pod urządzeniem wielofunkcyjnym, wyrównanie poziome musi być regulowane z precyzją mikrometryczną i odbywa się za pomocą trzypunktowego wspornika utworzonego przez trzy mikrometryczne.

4. Działanie urządzenia wielofunkcyjnego

1. Dozowanie jest kontrolowane za pomocą oprogramowania LabView. Praca urządzenia jest wizualizowana wzrokowo oraz za pomocą kamery CCD. Stosunek wtrysku do aspiracji waha się od 1:3 do 1:10, w zależności od dyfuzyjności odczynnika z otaczającym buforem i pożądanego geometrycznego wzoru przepływu.
2.  Aby sprawdzić, czy strzykawka aspiracyjna działa prawidłowo i czy nie ma pęcherzyków powietrza, należy najpierw wstrzyknąć płyn za pomocą strzykawki aspiracyjnej przed rozpoczęciem prawidłowego zasysania.
3. Rozpocząć wstrzykiwanie cieczy i monitorować przepływ oraz zatrzymywanie kulek lub fluorescencyjnego barwnika znacznikowego.
4. Użyj sondy do konkretnego zastosowania, tj. skanuj powierzchnię w celu przetworzenia w celu osadzenia, wytrawienia lub barwienia powierzchni lub komórek.

Discussion

Sonda mikroprzepływowa (MFP) jest wszechstronna, ponieważ jest (i) mobilna, (ii) przystosowana do użytku z różnymi rodzajami odczynników i substratów oraz może być (iii) obsługiwana na dużych obszarach.

Niechciane pęcherzyki mogą prowadzić do zakłócenia przepływu Aby uniknąć pęcherzyków, wszystkie elementy muszą być wypełnione płynami przed montażem.  Odstęp między sondą a powierzchnią wynosi zaledwie kilka mikrometrów, ale mesa ma kilkaset mikrometrów szerokości, a odległości w granicach cen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
złącza mikroprzepływowe	Upchurch Scientific	Złączki i tuleje
2-składnikowy dozownik ręczny	Conprotec Inc.	DM400	Do dozowania i mieszania mieszaniny PDMS
LabVIEW	National Instruments	Version 8.0
Mechaniczny piec konwekcyjny	VWR international	1330FM
Szklane strzykawki	Hamilton Co
Rurki kapilarne	Polymicro Technologies
Komora plazmowa	Tegal Corporation	Plasmaline 415
Mikroskop odwrócony	Nikon Instruments	TE2000-E
Pompy strzykawkowe	Cetoni	neMESYS
Sylgard 184	Ellsworth Kleje	184 Sil Elast Kit
Aparat fotograficzny	Fotometria	QuantEM 512SC
Stolik
mikroskopowy Uchwyt sondy mikroprzepływowej goniometry	Melles Griot	07GON504
Stolik liniowy	Stosowane oprzyrządowanie naukowe	LS-50	Do sterowania z MFP Ręczny
stolik liniowy	Newport Corp.	Seria 443-4	Do sterowania osiami x i y stolika mikroskopu wielofunkcyjnego
	Stosowane oprzyrządowanie naukowe	PZ-2000	Ze sterowaniem x, y i z