Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Podsumowanie

Transplantacja komórek u rybek zebrafish umożliwia połączenie genetyki i embriologii w celu generowania chimer specyficznych dla danej tkanki. Niniejsze wideo demonstruje transplantacje komórek na etapie gastruli, które pozwoliły naszemu laboratorium zbadać role populacji astroglialnych oraz specyficznych sygnałów prowadzących podczas formowania się spoiw w przedmózgowiu.

Streszczenie

Pewne fundamentalne pytania z zakresu biologii rozwoju można rozstrzygnąć jedynie w sytuacjach, gdy komórki zostaną umieszczone w nowym środowisku lub gdy zmodyfikowane zostaną niewielkie grupy komórek w szerszym kontekście. Obserwacja interakcji pojedynczej komórki oraz jej zachowania w unikalnym środowisku jest niezbędna do charakterystyki funkcji komórkowych. Określenie, w jaki sposób lokalna nienaturalna ekspresja specyficznego białka wpływa na komórki sąsiednie, dostarcza istotnych informacji o roli tego białka w różnych procesach rozwojowych. W naszym laboratorium wykorzystujemy model danio pręgowanego, aby w unikalny sposób łączyć podejścia genetyczne z klasycznymi technikami transplantacji w celu generowania chimer genotypowych lub fenotypowych. Badamy interakcje neuronowo-glejowe podczas formowania się komissur przedmózgowia u danio pręgowanego. Niniejszy film opisuje metodę, która pozwala naszemu zespołowi badać rolę populacji astroglialnych w poddzielu mózgu oraz rolę specyficznych sygnałów kierujących, które wpływają na aksony projekcyjne podczas przekraczania linii środkowej. Ze względu na swoją przezroczystość zarodki danio pręgowanego stanowią idealne modele dla tego typu ektopowego rozmieszczania komórek lub lokalnej nienaturalnej ekspresji genów. Śledzenie transplantowanych komórek można realizować przy użyciu barwnika witalnego lub transgenicznej linii ryb wykazującej ekspresję białka fluorescencyjnego. Prezentujemy tutaj sposób przygotowania zarodków dawców z zastosowaniem witalnego barwnika śledzącego do transplantacji, a także sposób ekstrakcji i transplantacji komórek z jednego zarodka w stadium gastruli do drugiego. Przedstawiamy dane wykazujące obecność ektopowych komórek transgenicznych GFP+ w przedmózgowiu zarodków danio pręgowanego i określamy lokalizację tych komórek względem komissur przedmózgowia. Dodatkowo prezentujemy obrazowanie w czasie rzeczywistym za pomocą konfokalnej mikroskopii skanującej laserem komórek znakowanych Alexa 594, przeszczepionych do transgenicznego zarodka gospodarza GFP+. Dane te stanowią dowód na to, że transplantacja w stadium gastruli umożliwia ukierunkowane rozmieszczenie komórek ektopowych w celu odpowiedzi na szereg pytań z zakresu biologii rozwoju.

Protokół

Część 1: Zarodki znakowane Alexa 594

1.1 Przygotowanie płytki i igły do mikroiniekcji

1. Przygotowanie płytek do mikroiniekcji
   1. Przygotować płytki do iniekcji zawierające od trzech do pięciu rowków o szerokości 1 mm w formie z agarozy, stosując technikę opracowaną przez Westerfield (2007) ¹. Rowki te będą ciasno utrzymywać embriony w linii, co umożliwi wydajne i systematyczne przeprowadzanie mikroiniekcji. Przed wykonaniem płytek należy wziąć trzy kapilary szklane bez włókna o średnicy 1 mm i długości 4 cali, a następnie ostrożnie przełamać je na pół. Za pomocą superglue należy przykleić dwie z tych 2-calowych kapilar obok siebie na płaskiej powierzchni. Trzecią kapilarę należy przykleić na górze tych dwóch, osadzając ją w zagłębieniu, tworząc w ten sposób piramidę z trzech kapilar. Pozostawić do wyschnięcia i powtórzyć czynność, aż do momentu przygotowania odpowiedniej liczby „form do rowków”.
   2. Wlać 20-25mL (głębokość 5mm) roztopionej 1,5% agarozy w pożywce do embrionów (EM) [5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl₂, 0.33mM MgSO₄ oraz 0.00003% błękitu metylenowego] do szalki Petriego o średnicy 100mm. Natychmiast umieścić na dnie szalki od trzech do pięciu wcześniej przygotowanych form do rowków w kształcie piramidy, upewniając się, że płaska strona formy dotyka dna szalki i jest całkowicie przykryta agarozą.
   3. Po stężeniu agarozy należy wyjąć szklane formy kapilarne. Aby to zrobić, wyciąć duży kwadrat z agarozy zawierający trzy formy kapilarne. Delikatnie oddzielić agar na obwodzie wyciętego kwadratu i go usunąć. Odwrócić kwadratowy kawałek agaru i za pomocą precyzyjnej pęsety całkowicie usunąć formy rowków. Wlać roztopioną agarozę do szalki Petriego wokół kwadratu, aby ustabilizować nowo uformowane wgłębienia. Pozostawić do stężenia. Płytki można uszczelnić folią Parafilm i przechowywać przez wiele tygodni w temperaturze 4 °C. Utylizować płytki w przypadku pojawienia się oznak wzrostu mikroorganizmów w agarze.
2. Igły do mikroiniekcji.
   1. Użyć wyciągarki kapilarnej do mikropipet, aby wykonać niezbędne igły do iniekcji z 1-mm, 4-calowych kapilar szklanych z wewnętrznym włóknem. Igły zostały wyciągnięte przy użyciu wyciągarki Micropipet Puller Flamming/Brown przy parametrach: ciepło 550, siła wyciągania 120, prędkość 200 oraz czas/opóźnienie 200.

1.2 Zbiór zarodków i konfiguracja aparatury do mikroiniekcji

1. Zapłodnione jaja zbiera się niezwłocznie po złożeniu i utrzymuje w szalce Petri wypełnionej EM. Iniekcja fluorescencyjnych dekstranów jest optymalna w stadium jednej komórki i powinna zostać zakończona do stadium 16 komórek ².
2. Za pomocą szklanej pipety z szeroką końcówką przenosi się embriony do dołków płytki do iniekcji w temperaturze pokojowej wypełnionej EM. Embriony należy delikatnie docisnąć do dna rowków za pomocą tępych pęsety. Należy odrzucić embriony, których chorion lub żółtko zostały uszkodzone.
3. Do igły do iniekcji pobiera się 1-2µl rozcieńczonego roztworu fluorescencyjnego Alexa 594 (5% wagowo w 0.2 M KCl). Należy pozwolić dekstranowi dotrzeć do końcówki igły do iniekcji drogą kapilarną dzięki wbudowanemu włóknu biegnącemu wzdłuż igły.
4. Igłę do iniekcji mocuje się w uchwycie kapilarnym mikromanipulatora stereotaktycznego.
5. Ciśnienie w mikroinjektorze ustawia się początkowo na 40-50 Psi, a czas trwania impulsu na 500msec.
6. Za pomocą pęsety delikatnie muska się końcówkę igły do iniekcji, aby przerwać uszczelnienie (optymalna średnica to 0.05-0.15mm). Korzystając ze stereomikroskopu, wydmuchuje się dekstran na mikrometr pokryty olejem mineralnym w celu kalibracji igły. Wielkość bolusa modyfikuje się poprzez regulację ciśnienia powietrza, czasu trwania impulsu oraz rozmiaru końcówki igły. Przez cały czas trwania iniekcji należy utrzymywać wielkość bolusa odpowiadającą objętości 0.8-1nl ³. Końcówki często zapychają się cząstkami żółtka; problem ten można rozwiązać poprzez regulację ciśnienia lub ponowne przerwanie końcówki igły, w przeciwnym razie należy załadować nową igłę do iniekcji.

1.3 Mikroiniekcje fluorescencyjnego barwnika Alexa 594

1. Pod dużym powiększeniem, zaczynając od jednego końca rynienki, płynnie przebij chorion i błonę komórkową embrionów, aby dostać się do żółtka. Wstrzyknij roztwór dekstranu tuż pod komórkę. Należy upewnić się, że igła do iniekcji jest wyjmowana tym samym płynnym ruchem, którym wprowadzano ją do embrionu. Przesuń szalkę Petriego, aby ustawić kolejny embrion w linii, i kontynuuj iniekcje wzdłuż rynienki. Okresowo sprawdzaj ciśnienie oraz wielkość bolusa. Należy uważać, aby nie przesuwać ani nie zginać igły podczas jej przebywania w embrionie, ponieważ może to doprowadzić do śmiertelnego uszkodzenia embrionu i/lub złamania igły.
2. Delikatnie wypchnij embriony z rynienek za pomocą pęsety. Przenieś je do szalki Petriego wypełnionej pożywką Pen/Step EM z antybiotykiem, zgodnie z opisem u Nusslein-Volhard i Dahm (2002) (1ml 6,5M CaCl₂, 1ml 3,5M NaHCO₃, 25ml 20x EM oraz 10ml roztworu stokowego 60mg/ml penicyliny i 100mg/ml streptomycyny) w celu przygotowania do późniejszych transplantacji. Inkubuj embriony w temperaturze 28,5 °C i monitoruj obecność niezapłodnionych jaj lub śmierć embrionów.

Część 2: Transplantacje w stadium gastruli

2.1 Usuwanie chorionów i przygotowanie płytki do transplantacji

1. Przygotowanie płytek do usuwania otoczek. Zdechorionowane zarodki, które nie zakończyły epiboli, wymagają płytki z miękkim dnem, aby zapobiec przyleganiu i rozdarciu żółtka o plastik. Dzień przed transplantacją, używając wcześniej opisanego 1,5% roztworu agarozy, przygotuj płytki do usuwania otoczek, wlewając 5-10 mL stopionej agarozy do szalki Petriego o średnicy 100 mm. Do amortyzacji zarodków podczas usuwania otoczek wystarczy cienka warstwa agarozy (2-3 mm). Pozostaw do ostygnięcia.
2. Płytki do transplantacji. Specjalistyczne płytki z oddzielnymi wgłębieniami należy przygotować zgodnie z opisem w ⁴. Wlej 30 ml 1,5% roztworu agarozy do szalki Petriego o średnicy 100 mm i włóż formę do wgłębień transplantacyjnych. Forma powinna zawierać 104 trójkątne zagłębienia, z których każde składa się z trzech boków pod kątem 90 stopni i jednego boku pod kątem 45 stopni. Wgłębienia są zaprojektowane tak, aby pomieścić dwa zarodki obok siebie (Rys. 1A, fioletowa ramka). Należy zadbać o to, aby pod formą nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Pozostaw agarozę do stwardnienia. Po usunięciu formy odsłoni się zagłębienie zawierające kwadratowe dołki ze skośną krawędzią.

2.2 Przygotowanie zarodków i aparatury do transplantacji

1. Pozycjonowanie embrionów dawcy i biorcy
   1. Należy monitorować rozwój biorców i dawców, aby utrzymać pary o zbliżonym wieku. W tym celu embriony można hodować w różnych temperaturach (25-31 °C), aby odpowiednio spowolnić lub przyspieszyć rozwój.
   2. Zarówno embriony biorcy, jak i dawcy powinny zostać poddane ręcznej dechorionacji na płytce do dechorionacji powlekonej agarem na 1 godzinę przed osiągnięciem pożądanego wieku. W przypadku transplantacji na etapie gastruli czynność ta musi zostać zakończona do 5hpf.
   3. Przed etapem tarczy (shield stage), w 5,5hpf, embriony biorcy i dawcy przenosi się na płytkę do transplantacji wypełnioną pożywką EM z antybiotykiem. Embriony umieszcza się w poszczególnych studzienkach o średnicy 1 mm za pomocą pipety szklanej. Przykład wygląda następująco: pierwszy rząd jest wypełniony embrionami dawcy (łącznie 18, dwa embriony na studzienkę), a dwa kolejne rzędy są wypełnione embrionami biorcy (jeden embrion na studzienkę, 9 embrionów na rząd).
2. Przygotowanie aparatury do transplantacji
   1. Transplantacje przeprowadza się przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego Zeiss Lumar, który posiada w pełni zautomatyzowaną regulację zoomu i ostrości sterowaną joystickiem. Choć transplantacje można przeprowadzać bez tej automatyzacji mikroskopu, znacznie zwiększa ona łatwość i wydajność pracy, zwłaszcza gdy planowana jest duża liczba transplantacji.
   2. Ustaw urządzenie Eppendorf AirTram na środkową pozycję skali. Podłącz dren AirTram (Rys. 1A, czerwona ramka) do uchwytu kapilarnego i zamocuj uchwyt w automatycznym mikromanipulatorze Eppendorf (Rys. 1A). Mikromanipulator ten jest w pełni zautomatyzowany i sterowany joystickiem. Ponownie, automatyzacja ta nie jest całkowicie niezbędna, ale znacząco poprawia zdolność do nawigowania igłą wokół i wewnątrz embrionu. Alternatywnie wielu badaczy preferuje OilTram , który ma zapewniać płynniejszą kontrolę nad pobieraniem komórek; jednak w naszym przypadku AirTram nie sprawił żadnych trudności.
   3. Użyte kapilary to sterylne końcówki Eppendorf TransferTips (ES) z otworem skośnym o rozmiarze 15 m na końcówce i kątem zgięcia 20 stopni w odległości 1 mm od końcówki (Rys. 1A zielona ramka).

2.3 Przeszczepy komórek w stadium gastruli

1. W 6. godzinie po zapłodnieniu (hpf), używając mikromanipulatora, delikatnie dotknij zarodka końcówką kapilary, aby obrócić go do pozycji umożliwiającej ekstrakcję komórek, tak aby linia środkowa oraz tarcza były widoczne i znajdowały się naprzeciwko końcówki kapilary. Zaspiruj niewielką ilość medium EM do kapilary, aby zapobiec możliwości kontaktu komórek z powierzchnią styku powietrza i wody, co mogłoby doprowadzić do ich uszkodzenia.
2. Zgodnie z mapą losów komórek danio pręgowanego, celowanie w komórki przedmózgowia wymaga transplantacji komórek w linii środkowej dokładnie pomiędzy biegunem zwierzęcym a tarczą ⁵. Delikatnie przebij ektodermę zarodków dawców (zarodków wstrzykniętych rhodaminą lub transgenicznych GFP) w tym miejscu. Warstwa komórek między ektodermą a znajdującym się pod nią żółtkiem w gastruli jest cienka; należy zatem zachować ostrożność, aby nie przebić żółtka, gdyż często prowadzi to do śmierci zarodka w ciągu kilku godzin. Używając urządzenia AirTram, powoli zasysaj komórki do kapilary. Przez cały czas zachowuj widoczność poziomu wody. Lekkie poruszanie końcówką kapilary wewnątrz dawcy pomoże w rozluźnieniu kontaktów międzykomórkowych. Przed wyjęciem kapilary z zarodka dawcy należy wyekstrahować około 10-50 komórek.
3. Wyjmij kapilarę z dawcy, w analogiczny sposób ustaw zarodek biorcy, a następnie przebij go i wprowadź komórki dokładnie w to samo miejsce między biegunem zwierzęcym a tarczą zarodków biorców.
4. Po transplantacji zarodki dawcy i biorcy należy wyjąć z dołków, rozdzielić i delikatnie umieścić na pokrytej agarem szalce Petriego wypełnionej medium EM z antybiotykiem. Pozostawienie zarodków w dołkach do transplantacji zwiększa śmiertelność. Inkubuj zarodki w temperaturze 28.5 °C.

2.4 Wizualizacja i obrazowanie embrionów

1. Montowanie zarodków utrwalonych i żywych.
   1. Zarodki gospodarze pochodzące z zarodków transgenicznych wstrzykniętych GFP lub Rodaminą można wizualizować i obrazować na żywo lub jako zarodki utrwalone. Przedstawiamy tutaj przykłady obu opcji obrazowania. Zarodki utrwalone uśmiercono w 30hpf, stosując 4% paraformaldehyd w 0,1M buforze fosforanowym (PB) przez noc w 4 °C ¹.
   2. Przepłukać zarodki 2x, a następnie przemyć 3 x 5 minut w 0,1M PB.
   3. W przedstawionym przykładzie utrwalone gospodarze zostały poddane immunoznakowaniu wszystkich aksonów przeciwciałami skierowanymi przeciwko acetylowanej tubulinie (α-AT), zgodnie z wcześniejszym opisem ⁶.
   4. Umieścić zarodki w 75% glicerolu, pozostawić w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać w 4 °C.
   5. Przygotować szkiełko do zamontowania dwóch zarodków. Wyznaczyć na szkiełku dwa kwadratowe obrysy z wazeliny, odpowiadające kształtowi wewnętrznemu i średnicy kwadratowego szkiełka nakrywkowego.
   6. Usunąć żółtko z zarodka, a w celu uzyskania widoku frontalnego przedmózgowia, wyciąć przedmózgowie, wykonując cięcie prostopadle przez śródmózgowie. Umieścić tę tkankę z minimalną ilością glicerolu w zagłębieniu z wazeliny. Zorientować tkankę w odpowiedniej pozycji i nałożyć szkiełko nakrywkowe na preparat.
   7. Żywe preparaty zamontowano w 0,75% roztworze agarozy przygotowanym w 4% roztworze trikainy (w EM) na szalkach hodowlanych z szklanym dnem. Przed zestaleniem się agarozy zarodek jest manipulowany igłą wolframową w celu jego prawidłowej orientacji do obrazowania. W naszej analizie przedmózgowie zorientowaliśmy bezpośrednio przylegać do szkiełka nakrywkowego.
2. Obrazowanie
   1. Zarówno utrwalone, jak i żywe gospodarze były obrazowane przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP5. Nabyto stosy Z (Z-Stacks), a przetwarzanie obrazów 3- lub 4-wymiarowych wykonano za pomocą oprogramowania Volocity.

Wyniki:

Aby zbadać rolę komórek astroglialnych w przedmózgowiu, konieczna jest zarówno wizualizacja tych komórek, jak i skierowanie różnych manipulacji genetycznych do małych klastrów komórek diencefalonu i telencefalonu. W celu wygenerowania tego typu embrionów chimerycznych, w których część populacji astroglialnej w obrębie embrionu różni się pod względem genotypu lub fenotypu, zastosowano wieloaspektowe podejście łączące wykorzystanie embrionów transgenicznych GFP, które znakują astroglię, z transplantacją komórek na etapie gastruli. Aby precyzyjnie skierować klony do diencefalonu, wykorzystano mapę losów gastruli danio pręgowanego w celu selektywnego wyekstrahowania komórek z linii środkowej w odległości równoodległej od bieguna zwierzęcego i tarczy ⁵ (Ryc. 1B). Wyekstrahowane komórki tg[gfap:gfp] przeszczepiono następnie w to samo miejsce w gastruli gospodarza typu dzikiego, którą następnie hodowano do 30 hpf i poddano immunoznakowaniu wszystkich aksonów (α-acetylowana tubulina) jako punktów odniesienia dla anatomii przedmózgowia. Jak pokazano w przykładzie, obrazowanie konfokalne jednego embrionu gospodarza ujawnia izolowane komórki GFP+ w całym telencefalonie i diencefalonie (Ryc. 2A). Pełną morfologię tych komórek GFP+ można zaobserwować w tym badaniu klonalnym, które wykazuje, że większość z tych komórek przyjmuje charakterystyczną morfologię gleju radialnego, gdzie soma znajduje się obok strefy komorowej, a duża stopka końcowa zamyka wypustkę radialną na powierzchni pialnej (Ryc. 2A, wstawka). Renderowanie trójwymiarowe stosu Z zebranych przekrojów optycznych wyraźnie pokazało położenie tych komórek względem znakowanych aksonów (Film 1).

Innym powszechnie stosowanym podejściem do wizualizacji przeszczepionych komórek jest wstępna mikroiniekcja fluorescencyjnego barwnika linii komórkowej, takiego jak Alexa 594, do żółtka zarodka typu dzikiego lub transgenicznego GFP w stadium jednej komórki. Jako przykład wykonaliśmy iniekcję Alexa 594 do zarodków typu dzikiego w stadium jednej komórki. Pozwolono im rozwijać się do stadium gastruli z tarczą, a następnie przeprowadzono ukierunkowany przeszczep do przedmózgowia, tak jak opisano powyżej, jednak w tym przypadku przeszczepiono je do transgenicznej gastruli gospodarza tg[gfap:nuc-gfp] . Obrazowanie grzbietowej części telencefalonu za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej z laserem wykazało obecność fluorescencyjnych czerwonych skupisk komórek donora wśród jąder GFP+ w obrębie przedmózgowia (Rys. 2B). Następnie przeanalizowano ten organizm gospodarza, zbierając serie obrazów Z (Z-stacks) co trzy minuty przez dwie godziny przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserem. Czterowymiarowa wizualizacja tego filmu poklatkowego z wykorzystaniem oprogramowania Volocity (Improvision) pokazuje dynamiczne ruchy komórkowe błon komórkowych zabarwionych rhodaminą oraz jąder GFP+ (Film 2).

Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.
Rysunek 1: Aparatura do transplantacji i schemat metod eksperymentalnych. A) Aparatura użyta do przeprowadzania transplantacji w stadium gastruli. Do wykonania tych transplantacji użyto fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego Zeiss Lumar. Posiada on sterowany joystickiem układ ostrzenia i zoom (czerwone koło po lewej). Do manipulowania pozycją kapilary użyto urządzenia Transferman NK, które również jest sterowane joystickiem (czerwone koło po prawej). Podczas przygotowania 60-80 embrionów umieszcza się w oddzielnych dołkach agarowych, wcześniej wykonanych w szalce Petriego 100mm za pomocą plastikowej formy (ramka z fioletowym obrysem). Kapilara do transplantacji (TransferTip) firmy Eppendorf posiada otwór o średnicy wewnętrznej 15μm i końcówkę pod kątem 20 stopni (ramka z zielonym obrysem). Aspiracja komórek jest kontrolowana za pomocą urządzenia AirTram firmy Eppendorf (ramka z czerwonym obrysem). B) Ilustracja procedury transplantacji w stadium gastruli z embrionów dawcy do embrionów biorcy. Komórki są pobierane z embrionów tg[gfap:GFP] (pokazane tutaj) lub z embrionów dawców wstrzykniętych Alexa 594 (zgodnie z opisem w protokole). Komórki są usuwane z linii środkowej w połowie drogi między tarczą a biegunem zwierzęcym, a następnie transplantowane do tego samego obszaru embrionów biorców. Organizmy biorcy są utrwalane i obrazowane przy użyciu skaningowej mikroskopii konfokalnej.

Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.
Rycina 2. Przykład transplantacji na etapie gastruli w obrębie przedmózgowia danio pręgowanego. A) Widok frontalny embrionów gospodarzy typu dzikiego z transplantowanymi komórkami tg[gfap:gfp] w dwużełaczach i telencefalonie przedmózgowia danio pręgowanego. Aksony są znakowane na czerwono (przeciwciało przeciwko α-acetylowanej tubulinie), a transplantowane komórki na zielono (endogenna ekspresja GFP). Embriony są w 30 hpf. Wstawka przedstawia morfologię gleju radialnego komórek GFP+. B) Widok grzbietowy telencefalonu żywego embrionu gospodarza tg[gfap:nuc-GFP] z transplantowanymi komórkami fluorescencyjnymi z rodamyną (czerwone). Jądra embrionów gospodarzy są znakowane na zielono (GFP). Linia przerywana wyznacza przednią powierzchnię przedmózgowia. Linia ciągła wskazuje strefę komorową. Pasek skali wynosi 10μm.

Film 1. Relacje między ektopowo znakowanymi komórkami gleju radialnego w obrębie komisur przedmózgowia. Komórki z zarodka w stadium gastruli tg[gfap:GFP] zostały przeszczepione do linii typu dzikiego, nieposiadającej transgenu GFP. Zebrano stos obrazów Z (Z-Stack) za pomocą konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego, a następnie przetworzono je w celu renderowania 3D przy użyciu oprogramowania Volocity. Początkowo obraz przedstawia widok czołowy przedmózgowia danio pręgowanego w 30hpf, będący lustrzanym odbiciem poziomym w stosunku do Ryciny 2B. Widoczne są aksony (α-acetylowana tubulina, czerwony) w obrębie komisury przedniej (AC, góra) oraz komisury pozawzrokowej (POC, dół). Zielone komórki to przeszczepione komórki GFP+, które zakorzeniły się w przedmózgowiu i wykształciły wyraźną morfologię gleju radialnego. W miarę trwania filmu uwaga skupia się na dwóch komórkach gleju radialnego posiadających wypustki końcowe kontaktujące się z POC. Kliknij tutaj, aby pobrać Film 1.

Film 2. Obrazowanie timelapse przeszczepionych komórek znakowanych Alexa 594 w przedmózgowiu. Komórki z gastruli, do której uprzednio wstrzyknięto Alexa 594, przeszczepiono do embrionów transgenicznych tg[gfap:nuc-gfp] . Film ten przedstawia projekcję 3D serii czasowej z 2h, w której stosy Z (Z-stacks) były pobierane co 5 minut. Stosy Z zostały zarejestrowane za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego, a renderingi 4D wykonano przy użyciu oprogramowania Volocity . Przeszczepione komórki są znakowane Alexa 594 (czerwony), a jądra GFP+ są zielone. Podczas odtwarzania tego timelapse'u obraz 4D rozpoczyna się od widoku grzbietowego przedmózgowia w 30hpf i będzie obracał się wokół osi X, ponieważ wyraźny ruch jest wykrywany w błonach komórkowych wszystkich przeszczepionych komórek, a także w jądrach GFP+. Kliknij tutaj, aby pobrać Film 2.

Dyskusja

Generowanie embrionów chimerycznych jest potężnym narzędziem pozwalającym na rozwiązanie wielu problemów badawczych w kilku systemach modelowych, mianowicie u muszki owocówki (D.melanogaster), niconia (C.elegans), danio pręgowanego (D.rerio) oraz myszy (M.musculus). Twierdzimy, że system modelowy danio pręgowanego jest wyjątkowo odpowiedni do generowania chimer w sposób stosunkowo łatwy, szybki i wszechstronny. Danio pręgowany jest kręgowcem, który rozwija się poza organizmem matki, co czyni go znacznie bardziej dostępnym w porównaniu z modelem mysim. Ryby te są również znacznie większe od muszek lub nicieni, co upraszcza manipulacje embriologiczne, takie jak transplantacja komórek. Ponadto możliwość połączenia procedur transplantacji komórek z technikami transgeniczno-genetycznymi umożliwia szeroki wachlarz możliwych eksperymentów, w których funkcję genów można manipulować w sposób zlokalizowany i tkankowo specyficzny. Na przykład małe klony komórek GFP+ lub znakowanych rodaminą umożliwiają charakteryzację pełnej morfologii komórek, która często ulega zatraceniu w homozygotycznym donnorze transgenicznym lub której nie można zwizualizować ze względu na różnicowe znakowanie subkomórkowe przy użyciu powszechnych przeciwciał. Co więcej, dzięki zastosowaniu komórek znakowanych transgenicznie lub wypełnionych barwnikiem fluorescencyjnym, możemy śledzić komórki donora w żywym embrionie danio pręgowanego w czasie. Obrazowanie poklatkowe pojedynczych komórek zapewnia nową metodę analizy zachowania komórkowego w kontekście całego organizmu.

W naszym laboratorium łączymy również stosowanie transgenicznych linii indukowanych szokiem termicznym z transplantacjami komórek, dzięki czemu określone sygnały prowadzenia aksonów mogą być błędnie ekspresowane w komórkach dawcy po podwyższeniu temperatury inkubacji (dane nie pokazane). Technika ta jest niezwykle potężnym i bezpośrednim podejściem do lokalnej, specyficznej przestrzennie i czasowo błędnej ekspresji interesującego białka, co pozwala nam zaobserwować, w jaki sposób konkretne białko wpływa na rozwój. W naszym przypadku technika ta może poszerzyć wiedzę na temat funkcji sygnałów prowadzenia Slit-Robo w pozycjonowaniu komisur i komórek glejowych w linii środkowej ⁵.

Inne podejścia do lokalnej nadekspresji genów, takie jak ogniskowe odblokowywanie promieniami UV (uncaging) czy narzędzia do lokalnego szoku termicznego (laser lub lutownica), oferują alternatywne sposoby manipulowania ekspresją genów i markerów w niewielkiej grupie komórek ^7-9; jednak transplantacja komórek tworzy końcowe środowisko analizy wolne od jakichkolwiek urazów wywołanych przez UV, laser lub ciepło, co czyni transplantację komórek bardziej kontrolowanym podejściem eksperymentalnym. Podsumowując, stwierdziliśmy, że procedury transplantacji komórek stanowią kluczowy element naszych badań nad biologią rozwoju układu nerwowego. Generowanie klonów komórek o różnych właściwościach jest krytycznym narzędziem dla biologa rozwojowego w odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące zachowań komórek, funkcji genów oraz autonomii komórkowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego	Narzędzie	Fisher Scientific	08-757-13	100 x 15 mm
Płytki hodowlane z szklanym dnem	Narzędzie	MatTek Corp.	P35G-1.5-2.0-C	35 x 15mm, No 1.5, niepowlekane, naświetlane gamma
Szklane pipety Pasteura o szerokim wlocie	Narzędzie	Fisher Scientific	63A-53-WT
Szklane kapilary włókniste do form rynnowych (bez włókna) i igły do iniekcji (z włóknem)	Narzędzie	World Precision Instruments, Inc.	1B150F-4	4 in. (100 mm), 1.5 / 0.84 OD/ID (mm)
Kapilary transplantacyjne (TransferTip)	Narzędzie	Eppendorf	83000122-8	Typ IV, sterylne, wewn. 15μm; wygięcie 20 stopni
Forma transplantacyjna	Narzędzie	Adaptive Science Tools	PT-1	150 trójkątnych zagłębień do utrzymania poszczególnych embrionów
Agaroza, Typ I	Odczynnik	Sigma-Aldrich	A6013-250G	1.5% agarozy przygotowanej w EM
(Antybiotyki) Pożywka dla embrionów (Embryo Medium)	Odczynnik			Patrz Westerfield, 2007
Bufor fosforanowy	Odczynnik			Patrz Westerfield, 2007
Pincety Watchmana	Narzędzie	Fine Science Tools		końcówka 100+mm (tępa), końcówka 50mm
Dekstran z rodamyną B	Barwnik do śledzenia linii komórkowych	Molecular Probes, Life Technologies	D1824	MW 10 000 Da, utrwalany lizyną, czerwony (590nm) barwnik fluorescencyjny wzbudzany światłem zielonym (570nm)
Mikroskop sekcyjny	Mikroskop	Olympus Corporation	SZX7
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy	Mikroskop	Carl Zeiss, Inc.	Lumar	W pełni zautomatyzowany, sterowany joystickiem (Sycop)
Aparat transplantacyjny	Narzędzie	Eppendorf	AirTram
Automatyczny mikromanipulator	Narzędzie	Eppendorf	TransferMan NK2	Sterowany joystickiem
Mikromanipulator	Narzędzie	Applied Scientific Instrumentation	00-42-101-0000	MM33 Prawy
Mikroinjektor z jednostką przeciwciśnienia (BPU)	Narzędzie	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-2 BPU
Wytciągacz mikropipet Flaming/Brown	Narzędzie	Sutter Instrument Co.	Model P97	Program: Heat 550; Velocity 200; Time/Delay 200; Pull force 120.