Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Podsumowanie

Transplantacja komórek u rybek zebrafish umożliwia połączenie genetyki i embriologii w celu generowania chimer specyficznych dla danej tkanki. Niniejsze wideo demonstruje transplantacje komórek na etapie gastruli, które pozwoliły naszemu laboratorium zbadać role populacji astroglialnych oraz specyficznych sygnałów prowadzących podczas formowania się spoiw w przedmózgowiu.

Streszczenie

Pewne fundamentalne pytania z zakresu biologii rozwoju można rozstrzygnąć jedynie w sytuacjach, gdy komórki zostaną umieszczone w nowym środowisku lub gdy zmodyfikowane zostaną niewielkie grupy komórek w szerszym kontekście. Obserwacja interakcji pojedynczej komórki oraz jej zachowania w unikalnym środowisku jest niezbędna do charakterystyki funkcji komórkowych. Określenie, w jaki sposób lokalna nienaturalna ekspresja specyficznego białka wpływa na komórki sąsiednie, dostarcza istotnych informacji o roli tego białka w różnych procesach rozwojowych. W naszym laboratorium wykorzystujemy model danio pręgowanego, aby w unikalny sposób łączyć podejścia genetyczne z klasycznymi technikami transplantacji w celu generowania chimer genotypowych lub fenotypowych. Badamy interakcje neuronowo-glejowe podczas formowania się komissur przedmózgowia u danio pręgowanego. Niniejszy film opisuje metodę, która pozwala naszemu zespołowi badać rolę populacji astroglialnych w poddzielu mózgu oraz rolę specyficznych sygnałów kierujących, które wpływają na aksony projekcyjne podczas przekraczania linii środkowej. Ze względu na swoją przezroczystość zarodki danio pręgowanego stanowią idealne modele dla tego typu ektopowego rozmieszczania komórek lub lokalnej nienaturalnej ekspresji genów. Śledzenie transplantowanych komórek można realizować przy użyciu barwnika witalnego lub transgenicznej linii ryb wykazującej ekspresję białka fluorescencyjnego. Prezentujemy tutaj sposób przygotowania zarodków dawców z zastosowaniem witalnego barwnika śledzącego do transplantacji, a także sposób ekstrakcji i transplantacji komórek z jednego zarodka w stadium gastruli do drugiego. Przedstawiamy dane wykazujące obecność ektopowych komórek transgenicznych GFP+ w przedmózgowiu zarodków danio pręgowanego i określamy lokalizację tych komórek względem komissur przedmózgowia. Dodatkowo prezentujemy obrazowanie w czasie rzeczywistym za pomocą konfokalnej mikroskopii skanującej laserem komórek znakowanych Alexa 594, przeszczepionych do transgenicznego zarodka gospodarza GFP+. Dane te stanowią dowód na to, że transplantacja w stadium gastruli umożliwia ukierunkowane rozmieszczenie komórek ektopowych w celu odpowiedzi na szereg pytań z zakresu biologii rozwoju.

Protokół

Część 1: Zarodki znakowane Alexa 594

1.1 Przygotowanie płytki i igły do mikroiniekcji

1. Przygotowanie płytek do mikroiniekcji
   1. Przygotować płytki do iniekcji zawierające od trzech do pięciu rynien o szerokości 1 mm w formie agarozy, stosując metodę Westerfield, 2007 ¹. Rynnie te pozwolą na ciasne ułożenie embrionów w linii, co zapewni wydajne i systematyczne przeprowadzanie mikroiniekcji. Przed przygotowaniem płytek należy wziąć trzy kapilary szklane bez włókna o średnicy 1 mm i długości 4 cali, a następnie ostrożnie przełamać je na pół. Za pomocą superkleju przykleić dwie z tych kapilar o długości 2 cali obok siebie na płaskiej powierzchni. Trzecią kapilarę przykleić na górze, w zagłębieniu między dwiema pierwszymi, tworząc kształt piramidy z trzech kapilar. Pozostawić do wyschnięcia i powtórzyć czynność, aż do uzyskania odpowiedniej liczby „form rynien”.
   2. Wlać 20-25mL (głębokość 5mm) roztopionej 1,5% agarozy w medium dla embrionów (EM) [5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl₂, 0.33mM MgSO₄ oraz 0.00003% błękitu metylenowego] do szalki Petriego o średnicy 100mm. Natychmiast umieścić trzy do pięciu wcześniej przygotowanych form rynien w kształcie piramidy na dnie płytki, upewniając się, że płaska strona formy dotyka dna szalki i jest całkowicie przykryta agarozą.
   3. Po zestaleniu agarozy należy wyjąć szklane formy kapilarne. Aby to zrobić, wyciąć duży kwadrat agarozy zawierający trzy formy kapilarne. Delikatnie oddzielić agar na obwodzie wyciętego kwadratu i go usunąć. Odwrócić kwadratowy kawałek agaru i za pomocą precyzyjnej pęsety całkowicie usunąć formy rynien. Wlać roztopioną agarozę do szalki Petriego wokół kwadratu, aby utrzymać nowo uformowane otwory na miejscu. Pozostawić do zastygnięcia. Płytki można uszczelnić Parafilmem i przechowywać przez wiele tygodni w temperaturze 4 °C. W przypadku zauważenia jakiegokolwiek wzrostu w agarze płytki należy wyrzucić.
2. Igły do mikroiniekcji.
   1. Użyć wyciągacza kapilar do mikropipet, aby przygotować niezbędne igły iniekcyjne z kapilar szklanych o średnicy 1 mm i długości 4 cali z wewnętrznym włóknem. Igły były wyciągane przy użyciu wyciągacza Micropipet Puller Flamming/Brown przy ustawieniach: temperatura 550, siła wyciągania 120, prędkość 200 oraz czas/opóźnienie 200.

1.2 Zbiór embrionów i przygotowanie aparatury do mikroiniekcji

1. Zapłodnione jaja zbiera się natychmiast po zniesieniu i utrzymuje w szalce Petri wypełnionej EM. Wstrzykiwanie fluorescencyjnych dekstranów jest optymalne w stadium jednej komórki i powinno zostać zakończone do stadium 16 komórek ².
2. Za pomocą szklanej pipety z szeroką końcówką przenosi się embriony do dołków płytki do mikroiniekcji w temperaturze pokojowej, wypełnionej EM. Następnie delikatnie dociska się embriony do dna rowków za pomocą pęsety stępionej. Embriony, których chorion lub żółtko uległy uszkodzeniu, należy odrzucić.
3. Do igły iniekcyjnej wprowadza się 1-2µl rozcieńczonego roztworu fluorescencyjnego Alexa 594 (5% wagowo w 0.2 M KCl). Należy poczekać, aż dekstran dotrze do końcówki igły dzięki działaniu kapilarnemu, możliwemu dzięki wbudowanemu włóknu biegnącemu wzdłuż igły iniekcyjnej.
4. Igłę iniekcyjną mocuje się w uchwycie kapilarnym mikromanipulatora stereotaktycznego.
5. Ciśnienie w mikroinjektorze ustawia się początkowo na 40-50 Psi, przy czasie trwania impulsu 500msec.
6. Za pomocą pęsety delikatnie muska się końcówkę igły iniekcyjnej, aby przełamać uszczelnienie (optymalna średnica to 0.05-0.15mm). Korzystając ze stereomikroskopu, aplikuje się dekstran na mikrometr pokryty olejem mineralnym w celu skalibrowania igły. Wielkość bolusa modyfikuje się poprzez regulację ciśnienia powietrza, czasu trwania impulsu oraz rozmiaru końcówki igły. Przez cały czas trwania iniekcji należy utrzymywać wielkość bolusa odpowiadającą objętości 0.8-1nl ³. Końcówki często zatykają się cząstkami żółtka; regulacja ciśnienia lub przełamanie końcówki igły może pomóc w rozwiązaniu problemu, w przeciwnym razie należy wprowadzić nową igłę iniekcyjną.

1.3 Mikrowstrzyknięcia fluorescencyjnego Alexa 594

1. Przy dużym powiększeniu, zaczynając od jednego końca rynienki, płynnie przebij chorion i błonę komórkową embrionów, aby dotrzeć do żółtka. Wstrzyknij roztwór dekstranu bezpośrednio pod komórką. Należy upewnić się, że igła jest wycofana tym samym płynnym ruchem, którym wprowadzono ją do embrionu. Przesuń płytkę Petri, aby ustawić kolejny embrion w linii, i kontynuuj wstrzykiwanie wzdłuż rynienki. Okresowo sprawdzaj ciśnienie oraz wielkość podawanego bolusa. Należy uważać, aby nie przesuwać ani nie wyginać igły podczas gdy znajduje się ona w embrionie, ponieważ może to doprowadzić do śmierci embrionu i/lub złamania igły.
2. Delikatnie wypchnij embriony z rynienek za pomocą pęsety. Przenieś je do płytki Petri wypełnionej antybiotykiem Pen/Step EM zgodnie z opisem w Nusslein-Volhard and Dahm (2002) (1ml 6.5M CaCl₂, 1ml 3.5M NaHCO₃, 25ml 20x EM oraz 10ml roztworu zapasowego 60mg/ml penicyliny i 100mg/ml streptomycyny) w celu przygotowania do późniejszych transplantacji. Inkubuj embriony w temperaturze 28.5 °C i monitoruj obecność niezapłodnionych jaj lub śmierć embrionów.

Część 2: Transplantacje w stadium gastruli

2.1 Dechorionowanie i przygotowanie płytki do transplantacji

1. Przygotowanie płytek do usuwania otoczek. Zdechorionowane embriony, które nie ukończyły epiboli, wymagają płytki z miękkim dnem, aby żółtko nie przywarło do plastiku i nie uległo rozerwaniu. Dzień przed transplantacją, używając wcześniej opisanego 1,5% roztworu agarozy, przygotuj płytki do usuwania otoczek, wlewając 5-10 mL stopionej agarozy do szalki Petriego o średnicy 100 mm. Do amortyzacji embrionów podczas usuwania otoczek wystarczy cienka warstwa agarozy (2-3 mm). Pozostaw do ostygnięcia.
2. Płytki do transplantacji. Należy przygotować specjalistyczne płytki z oddzielnymi dołkami zgodnie z opisem w ⁴. Wlej 30 ml 1,5% roztworu agarozy do szalki Petriego o średnicy 100 mm i włóż formę do dołków transplantacyjnych. Forma powinna zawierać 104 trójkątne zagłębienia, z których każde składa się z trzech boków pod kątem 90 stopni i jednego boku pod kątem 45 stopni. Dołki są zaprojektowane tak, aby pomieścić dwa embriony obok siebie (Rys. 1A, fioletowa ramka). Należy zadbać o to, aby pod formą nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Pozostaw agarozę do stwardnienia. Po usunięciu formy odsłoni się zagłębienie zawierające kwadratowe dołki ze skośną krawędzią.

2.2 Przygotowanie zarodków i aparatury do transplantacji

1. Pozycjonowanie embrionów dawcy i biorcy
   1. Należy monitorować rozwój biorców i dawców, aby utrzymać pary w zbliżonym wieku. W tym celu embriony można hodować w różnych temperaturach (25-31 °C), aby odpowiednio spowolnić lub przyspieszyć rozwój.
   2. Zarówno embriony biorcy, jak i dawcy powinny zostać poddane ręcznej dechorionacji na płytce do dechorionacji pokrytej agarem na 1 godzinę przed osiągnięciem pożądanego wieku. W przypadku przeszczepów w stadium gastruli czynność tę należy zakończyć do 5hpf.
   3. Przed stadium tarczy, w 5,5hpf, embriony biorcy i dawcy umieszcza się na płytce do przeszczepów wypełnionej antybiotykiem EM. Embriony przenosi się do poszczególnych studzienek o średnicy 1 mm za pomocą szklanej pipety. Przykład wygląda następująco: pierwszy rząd wypełnia się embrionami dawcy (łącznie 18, dwa embriony na studzienkę), a dwa kolejne rzędy embrionami biorcy (jeden embrion na studzienkę, 9 embrionów na rząd).
2. Przygotowanie aparatu do przeszczepów
   1. Przeszczepy wykonuje się na fluorescencyjnym stereomikroskopie Zeiss Lumar, który posiada w pełni zautomatyzowaną regulację zoomu i ostrości sterowaną joystickiem. Choć przeszczepy można wykonać bez tej automatyzacji mikroskopu, znacznie zwiększa ona łatwość i wydajność pracy, zwłaszcza gdy planowana jest duża liczba przeszczepów.
   2. Ustaw urządzenie Eppendorf AirTram w pozycji środkowej swojej skali. Podłącz rurkę AirTram (Rys. 1A, czerwona ramka) do uchwytu kapilarnego i zamocuj uchwyt w automatycznym mikromanipulatorze Eppendorf (Rys. 1A). Ten mikromanipulator jest w pełni zautomatyzowany i sterowany joystickiem. Ponownie, automatyzacja ta nie jest całkowicie niezbędna, ale znacząco poprawia zdolność nawigowania igłą wokół i wewnątrz embrionu. Alternatywnie wielu badaczy preferuje OilTram , który ma oferować płynniejszą kontrolę nad pobieraniem komórek; my jednak nie mieliśmy żadnych trudności z AirTram.
   3. Użyte kapilary to sterylne końcówki Eppendorf TransferTips (ES) , które posiadają ścięte otwarcie o rozmiarze 15 m na końcówce oraz kąt zgięcia 20 stopni w odległości 1 mm od końcówki (Rys. 1A zielona ramka).

2.3 Przeszczepy komórek w stadium gastruli

1. W 6. godzinie rozwoju (6hpf), używając mikromanipulatora, delikatnie dotknij zarodka końcówką kapilary, aby obrócić go do pozycji umożliwiającej ekstrakcję komórek, tak aby linia środkowa i tarcza były widoczne i znajdowały się naprzeciwko końcówki kapilary. Zaspiruj niewielką ilość EM do kapilary, aby zapobiec możliwości kontaktu komórek z powierzchnią styku powietrza i wody, co mogłoby doprowadzić do ich uszkodzenia.
2. Zgodnie z mapą losów komórek danio pręgowanego, celowanie w komórki przedmózgowia wymaga transplantacji komórek w linii środkowej dokładnie pomiędzy biegunem zwierzęcym a tarczą ⁵. Delikatnie przebij ektodermę zarodków dawców (zarodków wstrzykniętych rodaminą lub transgenicznych GFP) w tym miejscu. Warstwa komórek między ektodermą a znajdującym się pod nią żółtkiem w gastruli jest cienka; należy zatem zachować ostrożność, aby nie przebić żółtka, ponieważ często prowadzi to do śmierci w ciągu kilku godzin. Używając AirTram, powoli zasysaj komórki do kapilary. Zawsze utrzymuj widoczność linii wody. Delikatne poruszanie końcówką wewnątrz dawcy pomoże poluzować kontakty międzykomórkowe. Przed wyjęciem kapilary z zarodka dawcy należy wyekstrahować około 10-50 komórek.
3. Wyjmij kapilarę z dawcy, w podobny sposób zorientuj biorcę, a następnie przebij i wprowadź komórki dokładnie w to samo miejsce pomiędzy biegunem zwierzęcym a tarczą zarodków biorców.
4. Po transplantacji zarodki dawcy i biorcy są usuwane z dołków, rozdzielane i delikatnie przenoszone na pokrytą agarem szalkę Petriego wypełnioną EM z antybiotykiem. Pozostawienie zarodków w dołkach do transplantacji zwiększa śmiertelność. Inkubuj zarodki w temperaturze 28.5 °C.

2.4 Wizualizacja i obrazowanie embrionów

1. Montowanie embrionów utrwalonych i żywych.
   1. Embriony gospodarza pochodzące z embrionów transgenicznych GFP lub wstrzykniętych Rhodaminą mogą być wizualizowane i obrazowane na żywo lub jako embriony utrwalone. Przedstawiamy tutaj przykłady obu opcji obrazowania. Embriony utrwalone zostały poddane utrwaleniu w 30hpf przy użyciu 4% paraformaldehydu w 0,1M buforze fosforanowym (PB) przez noc w temperaturze 4 °C ¹.
   2. Opłukać embriony 2x, a następnie przemyć 3 x 5 minut w 0,1M PB.
   3. W przedstawionym przykładzie utrwalone gospodarze zostały poddane immunoznakowaniu wszystkich aksonów przeciwciałami skierowanymi przeciwko acetylowanej tubulinie (α-AT), zgodnie z wcześniejszym opisem ⁶.
   4. Umieścić embriony w 75% glicerolu, pozostawić w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać w 4 °C.
   5. Przygotować preparat do zamontowania dwóch embrionów. Stworzyć na szkiełku dwa kwadratowe obrysy z wazeliny, które odpowiadają kształtowi i średnicy wewnętrznej kwadratowego szkiełka nakrywkowego.
   6. Usunąć żółtko z embrionu, a w celu uzyskania widoku frontalnego przedmózgu, wyciąć przedmózg, przecinając prostopadle przez śródmózg. Umieścić tę tkankę z minimalną ilością glicerolu w studzience z wazeliny. Zorientować tkankę w odpowiedniej pozycji i przykryć preparat szkiełkiem nakrywkowym.
   7. Żywe okazy zamontowano w 0,75% roztworze agarozy sporządzonym w 4% roztworze Tricaine (w EM) na szalkach hodowlanych z przeszklonym dnem. Przed zastygnięciem agarozy embrion jest manipulowany za pomocą igły wolframowej w celu jego prawidłowej orientacji do obrazowania. W naszej analizie zorientowaliśmy przedmózg bezpośrednio przylegać do szkiełka nakrywkowego.
2. Obrazowanie
   1. Zarówno utrwalone, jak i żywe gospodarze były obrazowane przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego Leica SP5. Wykonano stosy Z-Stacks, a przetwarzanie obrazów 3- lub 4-wymiarowych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Volocity.

Wyniki:

Aby zbadać rolę komórek astroglialnych w przedmózgowiu, konieczne jest zarówno zwizualizowanie tych komórek, jak i skierowanie różnych manipulacji genetycznych do małych skupisk komórek diencefalonu i telencefalonu. W celu wytworzenia tego typu embrionów chimerycznych, w których część populacji astroglialnej wewnątrz embrionu różni się pod względem genotypu lub fenotypu, zastosowaliśmy wieloaspektowe podejście łączące użycie embrionów transgenicznych GFP, które znakują astroglię, z transplantacją komórek na etapie gastruli. Aby precyzyjnie skierować nasze klony do diencefalonu, wykorzystaliśmy mapę losów gastruli danio pręgowanego, aby selektywnie wyekstrahować komórki z linii środkowej, w odległości równoodległej od bieguna zwierzęcego i tarczy ⁵ (Rys. 1B). Wyekstrahowane komórki tg[gfap:gfp] przeszczepiono następnie w to samo miejsce w gastruli gospodarza typu dzikiego, którą następnie hodowano do 30 hpf i poddano immunoznakowaniu wszystkich aksonów (α-Acetylated Tubulin) jako punktów odniesienia dla anatomii przedmózgowia. Jak pokazano na przykładzie, obrazowanie konfokalne jednego embrionu gospodarza ujawnia odizolowane komórki GFP+ w całym telencefalonie i diencefalonie (Rys. 2A). Pełna morfologia tych komórek GFP+ może być zaobserwowana w tym badaniu klonalnym, wykazując, że większość z tych komórek przyjmuje charakterystyczną morfologię gleju radialnego, w której soma znajduje się sąsiadując z strefą komorową, a duża stopka końcowa zamyka wypustkę radialną na powierzchni oponowej (Rys. 2A, wstawka). Trójwymiarowe renderowanie stosu Z tych zebranych przekrojów optycznych wyraźnie pokazało położenie tych komórek względem znakowanych aksonów (Film 1).

Inną powszechnie stosowaną metodą wizualizacji przeszczepionych komórek jest wstępna mikroiniekcja fluorescencyjnego barwnika linii komórkowej, takiego jak Alexa 594, do żółtka embrionu typu dzikiego lub transgenicznego GFP w stadium jednej komórki. Jako przykład wstrzyknęliśmy Alexa 594 do embrionów typu dzikiego w stadium jednej komórki. Pozwoliliśmy im rozwijać się do stadium gastruli z tarczą embrionalną, a następnie przeprowadziliśmy celowaną transplantację do przedmózgowia, jak wspomniano powyżej, jednak w tym przypadku przeszczepiono je do transgenicznych gastrul gospodarza tg[gfap:nuc-gfp]. Obrazowanie grzbietowej części telencefalonu za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej z laserem wykazało obecność czerwonych fluorescencyjnych skupisk komórek dawcy wśród jąder GFP+ w przedmózgowiu (Rys. 2B). Dalszą analizę tego gospodarza przeprowadzono poprzez zbieranie stosów Z-stack co trzy minuty w ciągu dwóch godzin za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserem. Czterowymiarowe renderowanie tego zapisu timelapse przy użyciu oprogramowania Volocity (Improvision) pokazuje dynamiczne ruchy komórkowe błon komórkowych zabarwionych rhodaminą oraz jąder GFP+ (Film 2).

Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.
Rycina 1: Aparatura do transplantacji i schemat metod eksperymentalnych. A) Aparatura wykorzystana do przeprowadzania transplantacji na etapie gastruli. Do wykonania tych transplantacji użyto fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego Zeiss Lumar. Posiada on sterowaną joystickiem funkcję ostrzenia i zoomu (czerwone koło po lewej). Do manipulowania pozycją kapilary, również sterowanej joystickiem, użyto urządzenia Transferman NK (czerwone koło po prawej). Podczas przygotowania 60–80 embrionów umieszcza się w oddzielnych dołkach agarowych, wykonanych wcześniej w szalce Petriego 100 mm za pomocą plastikowej formy (ramka fioletowa). Kapilara transplantacyjna (TransferTip) firmy Eppendorf posiada otwór o średnicy wewnętrznej 15 μm i końcówkę pod kątem 20 stopni (ramka zielona). Aspiracja komórek jest kontrolowana za pomocą urządzenia AirTram firmy Eppendorf (ramka czerwona). B) Ilustracja procedury transplantacji na etapie gastruli z embrionów dawcy do embrionów biorcy. Komórki są pobierane z embrionów tg[gfap:GFP] (pokazane tutaj) lub embrionów dawców wstrzykniętych Alexa 594 (zgodnie z opisem w protokole). Komórki są usuwane z linii środkowej w połowie drogi między tarczą a biegunem zwierzęcym, a następnie transplantowane do tego samego regionu embrionów biorców. Organizmy biorcy są utrwalane i obrazowane przy użyciu konfokalnej mikroskopii skaningowej.

Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.
Rycina 2. Przykład przeszczepów na etapie gastruli w przedmózgowiu ryby danio. A) Widok frontalny embrionów gospodarzy typu dzikiego z przeszczepionymi komórkami tg[gfap:gfp] w zmóżdżku i telencefalonie przedmózgowia ryby danio. Aksony są znakowane na czerwono (przeciwciało przeciwko α-acetylowanej tubulinie), a przeszczepione komórki na zielono (endogenna ekspresja GFP). Embriony w 30 hpf. Wstawka przedstawia morfologię gleju radialnego komórek GFP+. B) Widok grzbietowy telencefalonu żywego embrionu gospodarza tg[gfap:nuc-GFP] z fluorescencyjnie znakowanymi rodaminą przeszczepionymi komórkami (czerwone). Jądra embrionów gospodarzy są znakowane na zielono (GFP). Linia przerywana obrysowuje przednią powierzchnię przedmózgowia. Linia ciągła wskazuje strefę komorową. Pasek skali: 10μm.

Film 1. Relacja między ektopowo znakowanymi komórkami glei radialnej a komisurami przedmózgowia. Komórki z zarodka tg[gfap:GFP] na etapie gastruli przeszczepiono do linii dzikiej typu nie-GFP. Wykonano Laser Scanning Confocal Z-Stack, a następnie przetworzono go w celu renderingu 3D przy użyciu oprogramowania Volocity. Początkowo obraz przedstawia widok frontalny przedmózgowia danio pręgowanego w 30hpf, który został odwrócony poziomo w stosunku do Rysunku 2B. Widoczne są aksony (α-acetylowana tubulina, czerwony) w obrębie komisury przedniej (AC, góra) oraz komisury pozawzrokowej (POC, dół). Zielone komórki to GFP+ komórki przeszczepione, które zakorzeniły się w przedmózgowiu i wykształciły wyraźną morfologię glei radialnej. W miarę postępu filmu nacisk zostaje położony na dwie komórki glei radialnej posiadające wypustki końcowe kontaktujące się z POC. Kliknij tutaj, aby pobrać Film 1.

Film 2. Obrazowanie timelapse przeszczepionych komórek znakowanych Alexa 594 w przedmózgowiu. Komórki z gastruli, w którą uprzednio wstrzyknięto Alexa 594, przeszczepiono do embrionów transgenicznych tg[gfap:nuc-gfp] . Film ten przedstawia projekcję 3D serii czasowej z 2h, w której stosy Z (Z-stacks) były pobierane co 5 minut. Stosy Z gromadzono za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego z laserem, a renderowanie 4D wykonano przy użyciu oprogramowania Volocity . Przeszczepione komórki są znakowane Alexa 594 (kolor czerwony), a jądra GFP+ są zielone. W trakcie trwania tego timelapse'u obraz 4D rozpoczyna się od widoku grzbietowego przedmózgowia w 30hpf i będzie obracać się wokół osi X, ponieważ wyraźny ruch jest wykrywany w błonach komórkowych wszystkich przeszczepionych komórek, a także w jądrach GFP+. Kliknij tutaj, aby pobrać Film 2.

Dyskusja

Generowanie embrionów chimerycznych jest potężnym narzędziem pozwalającym na rozwiązanie wielu problemów badawczych w kilku systemach modelowych, mianowicie u muszki owocówki (D.melanogaster), niconia (C.elegans), danio pręgowanego (D.rerio) oraz myszy (M.musculus). Twierdzimy, że system modelowy danio pręgowanego jest wyjątkowo odpowiedni do generowania chimer w sposób stosunkowo łatwy, szybki i wszechstronny. Danio pręgowany jest kręgowcem, który rozwija się poza organizmem matki, co czyni go znacznie bardziej dostępnym w porównaniu z modelem mysim. Ryby te są również znacznie większe od muszek lub nicieni, co upraszcza manipulacje embriologiczne, takie jak transplantacja komórek. Ponadto możliwość połączenia procedur transplantacji komórek z technikami transgeniczno-genetycznymi umożliwia szeroki wachlarz możliwych eksperymentów, w których funkcję genów można manipulować w sposób zlokalizowany i tkankowo specyficzny. Na przykład małe klony komórek GFP+ lub znakowanych rodaminą umożliwiają charakteryzację pełnej morfologii komórek, która często ulega zatraceniu w homozygotycznym donnorze transgenicznym lub której nie można zwizualizować ze względu na różnicowe znakowanie subkomórkowe przy użyciu powszechnych przeciwciał. Co więcej, dzięki zastosowaniu komórek znakowanych transgenicznie lub wypełnionych barwnikiem fluorescencyjnym, możemy śledzić komórki donora w żywym embrionie danio pręgowanego w czasie. Obrazowanie poklatkowe pojedynczych komórek zapewnia nową metodę analizy zachowania komórkowego w kontekście całego organizmu.

W naszym laboratorium łączymy również stosowanie transgenicznych linii indukowanych szokiem termicznym z transplantacjami komórek, dzięki czemu określone sygnały prowadzenia aksonów mogą być błędnie ekspresowane w komórkach dawcy po podwyższeniu temperatury inkubacji (dane nie pokazane). Technika ta jest niezwykle potężnym i bezpośrednim podejściem do lokalnej, specyficznej przestrzennie i czasowo błędnej ekspresji interesującego białka, co pozwala nam zaobserwować, w jaki sposób konkretne białko wpływa na rozwój. W naszym przypadku technika ta może poszerzyć wiedzę na temat funkcji sygnałów prowadzenia Slit-Robo w pozycjonowaniu komisur i komórek glejowych w linii środkowej ⁵.

Inne podejścia do lokalnej nadekspresji genów, takie jak ogniskowe odblokowywanie promieniami UV (uncaging) czy narzędzia do lokalnego szoku termicznego (laser lub lutownica), oferują alternatywne sposoby manipulowania ekspresją genów i markerów w niewielkiej grupie komórek ^7-9; jednak transplantacja komórek tworzy końcowe środowisko analizy wolne od jakichkolwiek urazów wywołanych przez UV, laser lub ciepło, co czyni transplantację komórek bardziej kontrolowanym podejściem eksperymentalnym. Podsumowując, stwierdziliśmy, że procedury transplantacji komórek stanowią kluczowy element naszych badań nad biologią rozwoju układu nerwowego. Generowanie klonów komórek o różnych właściwościach jest krytycznym narzędziem dla biologa rozwojowego w odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące zachowań komórek, funkcji genów oraz autonomii komórkowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego	Narzędzie	Fisher Scientific	08-757-13	100 x 15 mm
Płytki hodowlane z szklanym dnem	Narzędzie	MatTek Corp.	P35G-1.5-2.0-C	35 x 15mm, No 1.5, niepowlekane, naświetlane gamma
Szklane pipety Pasteura o szerokim wlocie	Narzędzie	Fisher Scientific	63A-53-WT
Szklane kapilary włókniste do form rynnowych (bez włókna) i igły do iniekcji (z włóknem)	Narzędzie	World Precision Instruments, Inc.	1B150F-4	4 in. (100 mm), 1.5 / 0.84 OD/ID (mm)
Kapilary transplantacyjne (TransferTip)	Narzędzie	Eppendorf	83000122-8	Typ IV, sterylne, wewn. 15μm; wygięcie 20 stopni
Forma transplantacyjna	Narzędzie	Adaptive Science Tools	PT-1	150 trójkątnych zagłębień do utrzymania poszczególnych embrionów
Agaroza, Typ I	Odczynnik	Sigma-Aldrich	A6013-250G	1.5% agarozy przygotowanej w EM
(Antybiotyki) Pożywka dla embrionów (Embryo Medium)	Odczynnik			Patrz Westerfield, 2007
Bufor fosforanowy	Odczynnik			Patrz Westerfield, 2007
Pincety Watchmana	Narzędzie	Fine Science Tools		końcówka 100+mm (tępa), końcówka 50mm
Dekstran z rodamyną B	Barwnik do śledzenia linii komórkowych	Molecular Probes, Life Technologies	D1824	MW 10 000 Da, utrwalany lizyną, czerwony (590nm) barwnik fluorescencyjny wzbudzany światłem zielonym (570nm)
Mikroskop sekcyjny	Mikroskop	Olympus Corporation	SZX7
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy	Mikroskop	Carl Zeiss, Inc.	Lumar	W pełni zautomatyzowany, sterowany joystickiem (Sycop)
Aparat transplantacyjny	Narzędzie	Eppendorf	AirTram
Automatyczny mikromanipulator	Narzędzie	Eppendorf	TransferMan NK2	Sterowany joystickiem
Mikromanipulator	Narzędzie	Applied Scientific Instrumentation	00-42-101-0000	MM33 Prawy
Mikroinjektor z jednostką przeciwciśnienia (BPU)	Narzędzie	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-2 BPU
Wytciągacz mikropipet Flaming/Brown	Narzędzie	Sutter Instrument Co.	Model P97	Program: Heat 550; Velocity 200; Time/Delay 200; Pull force 120.