Izolacja RNA z zarodków danio pręgowanego i synteza cDNA do analizy ekspresji genów

Podsumowanie

Izolacja wysokiej jakości, nienaruszonego RNA jest kluczowym krokiem w wielu protokołach laboratoryjnych. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę ekstrakcji RNA z całych embrionów zebrafish oraz syntezę cDNA do późniejszego zastosowania w różnych procedurach eksperymentalnych, w tym w analizie ekspresji genów za pomocą mikromacierzy.

Streszczenie

Wiele istotnych i złożonych procedur laboratoryjnych wymaga wysokiej jakości, nienaruszonego RNA. Degradacja próbki lub obecność zanieczyszczeń mogą prowadzić do katastrofalnych wyników w późniejszych zastosowaniach eksperymentalnych. Dlatego też niezwykle ważne jest stosowanie sprawdzonych technik z licznymi zabezpieczeniami i kontrolami jakości, aby zapewnić najwyższą jakość próbki. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisujemy protokół izolacji całkowitego RNA z całych embrionów ryby danio pręgowanego z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie denaturanta chemicznego, a następnie oczyszczania w celu usunięcia śladów DNA i zanieczyszczeń przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji RNA. Ponieważ RNA jest stosunkowo niestabilne i podatne na rozkład przez RNazy, większość protokołów oceniających ekspresję genów wykorzystuje produkt cDNA syntetyzowany bezpośrednio z matrycy RNA. Opisujemy procedurę konwersji RNA w bardziej stabilny produkt cDNA przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu. W trakcie tych procedur przeprowadzanych jest szereg kontroli jakości, aby upewnić się, że próbka nie uległa degradacji ani zanieczyszczeniu. Produktem końcowym tych protokołów jest cDNA odpowiedni do analizy mikromacierzy, RT-PCR lub długoterminowego przechowywania.

Protokół

Część 1: Izolacja całkowitego RNA przy użyciu odczynnika TRIzol

Podczas pracy z RNA bardzo ważne jest zachowanie środowiska wolnego od RNaz. Bardzo pomocne są proste środki ostrożności, takie jak przeznaczenie osobnych pipet wyłącznie do procedur z RNA oraz spryskanie obszaru roboczego odczynnikiem dekontaminującym (np. RNAse Away) przed rozpoczęciem procedury.

1. Aby uzyskać odpowiednią ilość RNA, umieść 50 embrionów zebrafish w probówce mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i usuń jak najwięcej wody za pomocą pipety.
2. Natychmiast dodaj 250 μl odczynnika TRIzol¹ do probówki z embrionami. Odczynnik TRIzol zawiera fenol i powinien być używany wyłącznie pod wyciągiem.
3. Zlizuj i zhomogenizuj embriony za pomocą tłuczka do probówek (około 20 ruchów), aż tkanka zostanie w wystarczającym stopniu rozbita.
4. Gdy komórki zostaną odpowiednio zhomogenizowane, dodaj 750 μl odczynnika TRIzol, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml.
5. Aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych, inkubuj zhomogenizowane próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Na tym etapie próbkę można zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w -80°C lub kontynuować protokół.
6. Aby kontynuować, dodaj 0,2 ml chloroformu i kołysz probówką przez 15 sekund w celu wymieszania.
7. Inkubuj próbkę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wiruj przy 12,000 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C.
8. Mieszanina rozdzieli się na dolną czerwoną fazę fenolowo-chloroformową, interfazę oraz bezbarwną górną fazę wodną. Górna faza wodna zawiera RNA. Górna warstwa powinna stanowić około 60% początkowej objętości TRIzol (około 0,6 ml). Przenieś górną warstwę wodną do nowej probówki mikrocentryfugi za pomocą pipety 1 ml, uważając, aby nie przenieść żadnej części warstwy interfazy.
9. Aby wytrącić RNA, dodaj 0,5 ml izopropanolu.
10. Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej na 10 minut, a następnie wiruj próbkę przy 12,000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. RNA utworzy żelowaty osad na dnie probówki.
11. Nie naruszając osadu, usuń nadsącz za pomocą pipety i przemyj osad w 1 ml 75% etanolu. Wymieszaj próbkę poprzez delikatne odwracanie i wiruj przy 7,500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
12. Po wirowaniu usuń etanol pipetą i pozostaw próbkę do wyschnięcia w pozycji odwróconej przez 10 minut.
13. Resuspenduj osad, dodając 100 μl wody wolnej od RNazy, i inkubuj próbkę w 55°C przez 10 minut. Zaleca się częste mieszanie na vortexie podczas inkubacji, aby wspomóc rehydratację RNA. Opcjonalnie można sprawdzić jakość i ilość próbki za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000 lub przejść bezpośrednio do następnego kroku.

Część 2: Oczyszczanie RNA przy użyciu zestawu Qiagen RNEasy Mini Kit

Zestaw Qiagen RNEasy Mini Kit² jest przydatny do usuwania zanieczyszczeń i domieszek z próbki RNA wyizolowanej innymi metodami. Do przeprowadzenia tej procedury, poza komponentami zawartymi w zestawie, potrzebne są: β-merkaptoetanol, etanol oraz woda wolna od nukleaz. Podczas tej procedury zaleca się opcjonalną obróbkę DNazą.

1. Przy pierwszym użyciu zestawu należy przygotować bufor RPE, dodając 4 objętości 100% etanolu do 1 objętości buforu RPE.
2. W dniu przeprowadzenia procedury należy przygotować świeży bufor RLT. Należy obliczyć całkowitą ilość potrzebnego buforu RLT. Na jedną próbkę wymagana jest objętość 350 μl. Aby przygotować bufor RLT, należy dodać 10 μl β-merkaptoetanolu na każdy 1 ml buforu. Czynność tę należy wykonać pod wyciągiem.
3. Do każdej próbki należy dodać 350 μl buforu RLT i 250 μl 100% etanolu. Należy dokładnie wymieszać roztwór, kilkakrotnie pipetując go w górę i w dół.
4. Próbkę, której objętość powinna wynosić około 700 μl, należy przenieść do kolumny RNEasy umieszczonej w probówce do zbierania o pojemności 2 ml i wirować przy 8,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
5. Po wirowaniu należy odrzucić filtrat i dodać 700 μl buforu RW1 do kolumny wirówki RNEasy.
6. Próbkę należy wirować przy 8,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić filtrat.
7. Obróbka nukleazą DNA za pomocą zestawu Qiagen RNAse-Free DNAse Kit: Obróbka nukleazą DNA jest opcjonalna, ale wysoce zalecana w celu uzyskania próbek najwyższej jakości.
   1. Po otrzymaniu zestawu do obróbki nukleazą DNA należy przygotować roztwór zapasowy DNAse I, dodając 550 μl wody wolnej od nukleaz do DNAse. Należy wymieszać delikatnie poprzez odwracanie probówki; nie wolno mieszać w wirówce typu vortex. Należy rozdzielić roztwór na aliquoty do probówek jednorazowych, zawierających po 10 μl roztworu zapasowego. Roztwór zapasowy można przechowywać w temperaturze -20°C do 9 miesięcy. Rozmrożone aliquoty można przechowywać w temperaturze 4°C przez 6 tygodni, jeśli jest to konieczne, jednak nie wolno ponownie zamrażać aliquotów po rozmrożeniu.
   2. Aby przygotować mieszaninę inkubacyjną DNAse I, należy dodać 70 μl buforu RDD do 10 μl roztworu zapasowego DNAse I na każdą próbkę. Należy wymieszać poprzez delikatne odwracanie i krótko wirować probówkę, aby zebrać pozostałą ciecz ze ścianek. Należy dodać 80 μl mieszaniny inkubacyjnej DNAse I bezpośrednio do kolumny wirówki RNEasy. Obróbkę nukleazą DNA należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
8. Po obróbce nukleazą DNA należy dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny wirówki i wirować przy 8,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
9. Po wirowaniu należy odrzucić filtrat i dodać 500 μl buforu RPE do kolumny wirówki. Próbkę należy inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
10. Próbkę należy wirować przy 8,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i odrzucić filtrat.
11. Po wirowaniu należy dodać 500 μl 75% etanolu do kolumny wirówki.
12. Należy powtórzyć wirowanie przy 8,000 x g, tym razem przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
13. Po wirowaniu należy odrzucić filtrat i pozostawić kolumnę do wyschnięcia na 5 minut.
14. Należy natychmiast wirować przy 8,000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie pozostałe ślady etanolu.
15. Po zakończeniu wirowania należy przenieść kolumnę wirówki do nowej probówki do zbierania o pojemności 1,5 ml i dodać 10 μl wody wolnej od nukleaz. Należy inkubować przez 1 minutę, a następnie wirować przy 10,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. RNA znajdzie się w filtracie.
16. Do kolumny wirówki należy dodać kolejne 10 μl wody wolnej od nukleaz i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Próbkę należy wirować przy 10,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
17. Po wirowaniu należy wyjąć i odrzucić kolumnę wirówki. RNA znajdzie się w filtracie.
18. Ilość i jakość RNA należy sprawdzić za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000 zgodnie z instrukcjami producenta.
19. Dodatkowo należy wykonać elektroforezę w żelu denaturującym lub użyć bioanalizatora Agilent 2100, aby sprawdzić integralność RNA.
20. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia syntezy cDNA.

Część 3: Synteza cDNA przy użyciu systemu Invitrogen SuperScript First-Strand System

RNA jest podatne na rozszczepianie przez RNazy, co prowadzi do jego degradacji. W związku z tym opracowano wiele protokołów ekspresji genów wykorzystujących bardziej stabilny produkt cDNA, który został zsyntetyzowany bezpośrednio z RNA. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy syntezę pierwszej nici cDNA z wykorzystaniem systemu Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis System³. Każda reakcja syntezy cDNA może pomieścić do 5 μg RNA.

1. Przed rozpoczęciem procedury wymieszać i krótko odwirować każdy z komponentów.
2. Przygotować mieszaninę RNA/starter w sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 ml zgodnie z Tabelą 1.
3. Inkubować próbkę w temperaturze 65°C przez 5 minut.
4. Bezzwłocznie przenieść próbkę do zawiesiny lodowej na 10 minut.
5. Podczas chłodzenia próbki przygotować master mix z komponentami wymienionymi w Tabeli 2. Objętości podano na 1 reakcję. Dostosować objętości do całkowitej liczby reakcji.
6. Po schłodzeniu dodać 9 μl przygotowanego w kroku 5 master mixu do każdej mieszaniny RNA/starter. Delikatnie wymieszać i zebrać zawartość poprzez krótkie wirowanie. Całkowita objętość każdej próbki powinna wynosić 19 μl.
7. Inkubować próbkę w temperaturze 42°C przez 2 minuty w termocyklerze.
8. Dodać 1 μl (50 jednostek) SuperScript II RT do każdej probówki, wymieszać i inkubować w temperaturze 42°C przez 60 minut w termocyklerze.
9. Zatrzymać reakcję w temperaturze 70°C przez 15 minut, a następnie schłodzić próbkę do 4°C. Termocykler można zaprogramować dla kroków 8 i 9.
10. Po osiągnięciu przez próbkę temperatury 4°C przenieść reakcję do łaźni lodowej.
11. W warunkach chłodzenia na lodzie dodać 1 μl RNAse H do każdej probówki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37°C. Całkowita objętość wynosi teraz 21 μl. Dodanie RNAse H do próbki spowoduje degradację matrycy RNA i pozostawi jedynie jednoniciowy produkt cDNA.

Część 4: Izolacja i precypitacja cDNA

1. Do izolacji produktu cDNA należy użyć probówki z żelem do rozdziału faz (phase lock gel) o pojemności 1,5 ml. Przygotuj probówkę z żelem do rozdziału faz o pojemności 1,5 ml poprzez wirowanie przy 12 000 x g przez 2 minuty. Żel powinien całkowicie osiąść na dnie probówki.
2. Do probówki z żelem do rozdziału faz dodaj 81,5 μl fenolu (nasyconego Trisem, buforowanego do pH 8,0), 81,5 μl chloroformu z alkoholem izoamylowym w stosunku 24:1 oraz próbkę (21 μl). Wymieszaj kilka razy, delikatnie odwracając probówkę.
3. Wirować próbkę przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. cDNA powinno znajdować się w górnej fazie wodnej. Przenieś górną fazę do czystej probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 ml. Objętość całkowita powinna wynosić około 20 μl.
5. Dodaj 1/10 objętości 3 M NaOAc, pH 5,2 i delikatnie wymieszaj. Na przykład, jeśli objętość górnej fazy wodnej wynosiła 20 μl, należy dodać 2 μl 3 M NaOAc, pH 5,2.
6. Dodaj 7 μl glikogenu w stężeniu 5 mg/ml i delikatnie wymieszaj.
7. Dodaj 1,5-krotną objętość izopropanolu i delikatnie wymieszaj. Zazwyczaj jest to około 30 μl izopropanolu.
8. Inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie wirować przy 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
9. Na dnie probówki powinien utworzyć się niewielki osad cDNA. Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety.
10. Dodaj 500 μl 70% etanolu i wymieszaj poprzez odwracanie probówki.
11. Wirować próbkę przy 12 000 x g przez 5 minut.
12. Po wirowaniu usuń nadsącz pipetą i powtórz przemywanie 70% etanolem oraz wirowanie (kroki 10 i 11).
13. Po wirowaniu usuń nadsącz pipetą. Jeśli na ściankach probówki pozostał płyn, można go zebrać poprzez krótkie wirowanie. Usuń nadmiar płynu i pozostaw osad do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
14. Dodaj 20 μl wody wolnej od nukleaz, aby rehydratować osad. Przechowuj próbkę w temperaturze 55°C przez 5 minut w celu rehydratacji osadu.
15. Ilość i jakość produktu cDNA sprawdza się następnie za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000 zgodnie z instrukcjami producenta. cDNA można przechowywać w temperaturze -20°C.

Reprezentatywne wyniki

Po oczyszczaniu RNA z 50 embrionów danio pręgowanego można uzyskać około 15 μg wysokiej jakości całkowitego RNA. Do oceny jakości całkowitego RNA można wykorzystać spektrofotometr, elektroforezę w żelu oraz analizator Agilent 2100 Bioanalyzer. Spektrofotometr NanoDrop ND-1000 może służyć do oceny absorbancji przy 260 nm w porównaniu do absorbancji przy 280 nm (Rycina 1). Stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ pozwala wykryć obecność zanieczyszczeń oraz dostarcza dowodów na możliwą degradację. Stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ w zakresie 1,9-2,0 uznaje się za akceptowalny. Ponadto wysoce zaleca się przeprowadzenie elektroforezy w żelu denaturującym do RNA w celu oceny jego integralności. Nitki RNA rozdzielą się na podstawie wielkości, przy czym krótsze fragmenty będą migrować dalej w głąb żelu. Próbka niedegradowana pojawi się jako rozmycie z dwoma wyraźnymi prążkami. Rozmycie wynika z obecności populacji nici mRNA o różnych rozmiarach, a prążki odpowiadają rRNA 28S i 18S. Prążek 28S powinien być około dwukrotnie bardziej intensywny niż prążek 18S (Rycina 2). Alternatywnie, integralność całkowitego RNA można ocenić za pomocą analizatora Agilent 2100 bioanalyzer. Oczekuje się dwóch wyraźnych pików reprezentujących rRNA 28S i 18S (Rycina 3). Pik 28S powinien być większy od piku 18S, a pole powierzchni pod pikami powinno wynosić w przybliżeniu 2:1. W próbkach zdegradowanych dwa wyraźne piki nie będą widoczne. Próbki RNA wykazujące degradację nie powinny być wykorzystywane w kolejnych procedurach eksperymentalnych.

Do oceny jakości produktu cDNA można wykorzystać analizę spektrofotometryczną (Rysunek 4). Stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ powinien wynosić około 1,8. W naszym laboratorium reakcje cDNA z użyciem 5 μg całkowitego RNA rutynowo dają 1-2 μg produktu cDNA.

Rycina 1. Widmo NanoDrop próbki RNA. Po oczyszczaniu RNA ilość i jakość RNA można ocenić za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000. Z 50 embrionów danio pręgowanego rutynowo uzyskuje się około 15 μg wysokiej jakości całkowitego RNA z stosunkiem A₂₆₀/A₂₈₀ w granicach 1,9-2,0.

Rysunek 2. Denaturujący żel do RNA. W celu oceny integralności izolowanego całkowitego RNA można przeprowadzić elektroforezę na żelu denaturującym. Oczekiwanym wynikiem jest rozmaz z dwoma jasnymi prążkami odpowiadającymi rRNA 28S i 18S. Prążek 28S powinien być około dwukrotnie bardziej intensywny niż prążek 18S.

Rycina 3. Profil próbki RNA z bioanalizatora. W celu oceny integralności wyizolowanego całkowitego RNA próbki można przeanalizować za pomocą bioanalizatora Agilent 2100. Powinny być widoczne dwa wyraźne piki odpowiadające rRNA 28S i 18S. Pik 28S powinien być większy od piku 18S, a stosunek pól pod pikami powinien wynosić w przybliżeniu 2:1.

Rycina 4. Widmo NanoDrop próbki cDNA. Analiza spektrofotometryczna z użyciem NanoDrop ND-1000 może służyć do oceny ilości i jakości produktu cDNA. Stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ powinien wynosić około 1,8. Reakcje cDNA z użyciem 5 ug całkowitego RNA rutynowo dają w naszym laboratorium 1-2 ug cDNA.

Tabela 1. Składniki dodawane do mieszanin RNA/starterów w kroku 2 syntezy cDNA.

Składnik	Objętość
Całkowite RNA (do 5 μg)	10 μl
10 mM mieszanina dNTP	1 μl
Oligo(dT)12-18 (0.5 μg/ μl)	1 μl
Woda traktowana DEPC	n μl
Objętość całkowita	10 μl

Tabela 2. Mieszanina reakcyjna dla etapu 5 syntezy cDNA. Podane objętości dotyczą jednej reakcji. Należy zwiększyć objętości każdego składnika zgodnie z całkowitą liczbą reakcji.

Składnik	Objętość
10X RT Buffer	2 μl
25 mM MgCl2	4 μl
0.1 mM DTT	2 μl
RNAseOUT	1 μl

Dyskusja

Kruchość cząsteczki RNA jest najważniejszym aspektem, o którym należy pamiętać przez cały czas trwania niniejszego protokołu. Należy zawsze używać sterylnego sprzętu wolnego od RNaz w strefie laboratorium wolnej od RNaz. Pomocne jest wyznaczenie części laboratorium przeznaczonej wyłącznie do procedur z udziałem RNA. Obszar ten powinien być często spryskiwany produktem usuwającym RNazy, takim jak RNAse Away. Próbki RNA należy zawsze obsługiwać w rękawiczkach i przechowywać w lodzie, aby zapobiec ich degradacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glikogen (5 mg/ml)	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
Moździerzyki do probówek do mikrowirówek	VWR international	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1,5 ml	Eppendorf	2302800
Fenol, nasycony Trisem	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
Zestaw DNazy wolnej od RNaz	Qiagen	79254
Zestaw RNEasy Mini Kit	Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026