Skalowalne macierze wtryskiwaczy płynowych do wirusowego targetowania nienaruszonych trójwymiarowych obwodów mózgowych

Podsumowanie

Kontrola i analiza obwodów neuronalnych in vivo zostałyby ułatwione dzięki technologii dostarczania wirusów i innych odczynników do wybranych trójwymiarowych zestawów obszarów mózgu. Prezentujemy wykonanie zindywidualizowanej macierzy wtryskiwaczy płynowych oraz dostarczanie kodowanych wirusowo sensybilizatorów optycznych, co umożliwia optyczną manipulację złożonymi obwodami mózgowymi.

Streszczenie

Nasze zrozumienie obwodów neuronalnych – tego, w jaki sposób pośredniczą one w obliczeniach służących czuciu, myśleniu, emocjom i działaniu oraz w jaki sposób ulegają one zaburzeniom w schorzeniach neurologicznych i psychiatrycznych – zostałoby znacznie ułatwione dzięki technologii szybkiego celowania w geny w obrębie złożonych trójwymiarowych obwodów neuronalnych, umożliwiając szybkie tworzenie „transgeników na poziomie obwodu”. Opracowaliśmy niedawno metody, w których wirusy kodujące białka światłoczułe mogą uwrażliwiać konkretne typy komórek na aktywację i wyciszanie w skali milisekundowej w nienaruszonym mózgu. Przedstawiamy tutaj projekt i implementację matrycy wtryskiwaczy zdolnej do dostarczania wirusów (lub innych płynów) do kilkunastu określonych punktów w obrębie trójwymiarowej struktury mózgu (Rycina. 1A, 1BUkład wtryskiwaczy składa się z jednej lub większej liczby pomp wyporowych, z których każda napędza zestaw strzykawek, z których każda jest podłączona do kapilary polimidowo-krzemionkowej poprzez złącze odporne na wysokie ciśnienie. Kapilary są dobierane pod kątem rozmiaru, a następnie wprowadzane do wybranych lokalizacji określonych poprzez niestandardowe frezowanie płytki do pozycjonowania stereotaktycznego, co umożliwia dostarczenie wirusów lub innych odczynników do pożądanego zestawu obszarów mózgu. Aby skorzystać z urządzenia, chirurg najpierw całkowicie wypełnia podsystem płynowy olejem, wypełnia kapilary wirusem od tyłu, wprowadza urządzenie do mózgu i powoli infunduje odczynniki (<0.1 microliters/min). Równoległa budowa układu wtryskiwaczy ułatwia szybkie, dokładne i solidne znakowanie całych obwodów neuronalnych ładunkami wirusowymi, takimi jak sensory optyczne, aby umożliwić aktywację światłem i wyciszanie określonych obwodów mózgowych. Wraz z innymi technologiami, takimi jak układy światłowodowe do dostarczania światła do wybranych zestawów obszarów mózgu, mamy nadzieję stworzyć zestaw narzędzi umożliwiający systematyczne badanie przyczynowych funkcji neuronalnych w nienaruszonym mózgu. Technologia ta może nie tylko otworzyć drogę do takich systematycznych podejść w neuronauce skoncentrowanej na obwodach u ssaków i ułatwić znakowanie obszarów mózgu u dużych zwierząt, takich jak naczelne niebędące ludźmi, ale może również otworzyć kliniczną ścieżkę translacyjną dla protez optycznego sterowania specyficznego dla komórek, których precyzja może umożliwić lepsze leczenie trudnych do opanowania schorzeń mózgu. Wreszcie, urządzenia opisane w niniejszym tekście mogą ułatwić precyzyjnie czasowe dostarczanie innych ładunków, takich jak komórki macierzyste i środki farmakologiczne, do struktur trójwymiarowych w sposób łatwo dostosowywalny przez użytkownika.

Protokół

1. Konstrukcja zacisku stereotaktycznego

1. Zacisk stereotaktyczny służy do mocowania zestawu injektorów do stereotaksu, tak aby injektory były równoległe do ramienia stereotaktycznego.
2. Każde laboratorium potrzebuje tylko jednego zacisku, chyba że przewiduje się, że więcej niż jedna operacja może odbywać się jednocześnie. W takim przypadku należy wykonać tyle sztuk, ile wynosi przewidywana maksymalna liczba jednoczesnych operacji. Można również wykonać dodatkowy egzemplarz na wypadek uszkodzenia pierwszego.
3. Aby wykonać zacisk stereotaktyczny, najpierw stalową kaniulę o średnicy zewnętrznej (OD) 1,5 mm należy przyciąć do długości 2 cali, a jeden z końców oszlifować narzędziem typu Dremel, aż będzie płaski.
4. Następnie z płytki prototypowej PCB należy wyciąć mały kawałek (około 0,5 x 0,5 cm), który posłuży jako odstępnik.
5. Używając wycinarki laserowej, aby zapewnić, że wszystkie cięcia są prostopadłe do powierzchni materiału, z arkusza akrylowego o grubości 1/8" należy wyciąć dwa identyczne prostokąty (1/2" x 3/8"), z których każdy posiada dwa okrągłe otwory w przeciwległych narożnikach. Pierwszy otwór ma średnicę 1,5 mm i jest na tyle duży, aby ciasno trzymać metalową kaniulę. Drugi otwór ma średnicę 1/16" (Rysunek 1C).
6. Metalową kaniulę wkłada się do otworu 1,5 mm w jednym prostokącie, a następnie przez otwór 1,5 mm w drugim. Dolny koniec kaniuli należy wyrównać z dolną powierzchnią dolnego prostokąta, nadając konstrukcji kształt kija hokejowego.
7. Trzymając odstępnik ciasno między dwoma prostokątami, strukturę tę skleja się za pomocą kleju na gorąco wokół kaniuli i otworów 1,5 mm, uważając, aby nie przykleić odstępnika do prostokątów. Plastelina może być pomocna w utrzymaniu elementów razem podczas tego procesu.
8. Po wyschnięciu kleju, od górnej strony prostokątów do otworu 1/16" wprowadza się śrubę 1-72. Następnie na koniec śruby 1-72 nakręca się nakrętkę sześciokątną 1-72 i dokręca ją. Śruba i nakrętka służą do utrzymania zacisku w całości.
9. Aby przymocować nakrętkę sześciokątną do dolnej powierzchni dolnego prostokąta, wokół krawędzi nakrętki nanosi się niewielkie ilości 5-minutowej żywicy epoksydowej, nie dopuszczając do dostania się żywicy do gwintów nakrętki lub śruby. Usuwa się wszelką plastelinę i sprawdza, czy odstępnik może być mocno utrzymywany na miejscu poprzez dokręcenie śruby.

2. Przygotowanie systemu do spersonalizowanego układu wtryskiwaczy: pompa Hamiltona i stereotaks

1. System matrycy injektorów można dostosować do niemal dowolnego zestawu współrzędnych w mózgu.
2. Użytkownik najpierw lokalizuje współrzędne wybranych miejsc iniekcji w atlasie mózgu myszy (lub innego gatunku), przeliczając je na odpowiednie współrzędne używane przez stereotaks (w tym przypadku współrzędne X, Y i Z). Liczba miejsc iniekcji (trzy na rycinach 1A i 1B) będzie w dalszej części określana jako k.
3. k strzykawek Hamiltona o pojemności 10 μl umieszcza się w pompie strzykawkowej do iniekcji/wycofywania, takiej jak ta firmy Harvard Apparatus.
4. Następnie do igły każdej strzykawki Hamiltona bezpiecznie mocuje się 3-stopowe odcinki rurki polietylenowej.
5. Na wolny koniec każdego odcinka rurki polietylenowej nasuwa się tuleję rurki F-252 firmy Upchurch Scientific i mocuje ją do adaptera rurki P-627 za pomocą dołączonej nakrętki i pierścienia zaciskowego, również firmy Upchurch Scientific.

3. Konstrukcja dostosowanego układu wtryskiwaczy

1. Każda matryca wstrzykiwaczy jest dostosowana do zestawu współrzędnych wybranych przez użytkownika. Jednakże, w przypadku zestawów współrzędnych różniących się jedynie przesunięciem i/lub obrotem, można zastosować tę samą matrycę wstrzykiwaczy.
2. Biorąc pod uwagę wyłącznie względne współrzędne X i Y miejsc wstrzykiwania, w płytce prototypowej PCB o grubości 1/32" wierci się k otworów z zachowaniem tych samych względnych odstępów. Otwory te są wiercone przy użyciu mini-frezarki Modela oraz wiertła o średnicy .011" z firmy Mcmaster-Carr. Należy pamiętać o zastosowaniu wolnej prędkości wiercenia (prędkość Z), aby uniknąć złamania lub zużycia wiertła. Przed zdjęciem płytki z frezarki, wokół małych otworów wierci się prostokąt, używając większego wiertła o średnicy 1/32", aby uniknąć zużycia mniejszego wiertła. Kod dla mini-frezarki można łatwo wygenerować za pomocą programu MATLAB; przykładowy kod znajduje się w następujących plikach:
   1. generate.m - kod MATLAB do generowania kodu Modela z pożądanych współrzędnych
   2. holes_ex.rml - kod Modela do wiercenia wzoru pierścieniowego (osiem otworów) w płytce prototypowej
   3. outline_ex.rml - kod Modela do wiercenia prostokąta wokół otworów
3. Kapilary z topionego szkła kwarcowego o średnicy zewnętrznej (OD) 245 μm i średnicy wewnętrznej (ID) 100 μm, dostępne w firmie Polymicro Technologies, są cięte na k odcinków o długości 3 cali. Stanowią one poszczególne wstrzykiwacze. Przez każdy z otworów przebija się jednorazowy odcinek kapilary, aby usunąć zanieczyszczenia bez zatykania właściwych wstrzykiwaczy. Następnie wstrzykiwacze wprowadza się do połowy w każdy otwór, tak aby były mocno osadzone i równoległe względem siebie. Wstrzykiwacze są przyklejane do płytki żywicą epoksydową, tworząc strukturę matrycy wstrzykiwaczy. Pozostaje jedynie przycięcie wstrzykiwaczy do odpowiedniej długości.
4. Matrycę wstrzykiwaczy mocuje się do zacisku stereotaksycznego, umieszczając jeden róg płytki prototypowej pomiędzy akrylowymi prostokątami, a następnie dokręcając śrubę zacisku stereotaksycznego. Następnie metalową kaniulę zacisku mocuje się do aparatu stereotaksycznego za pomocą mechanizmu mocującego aparatu.
5. Wszystkie poniższe czynności wykonuje się pod mikroskopem. W przypadku jednego z zewnętrznych wstrzykiwaczy (czyli takiego, do którego można podejść od boku krawędzią prostą, nie uderzając w żadne z pozostałych wstrzykiwaczy), końcówkę wystającą poza dół płytki prototypowej odcina się nożyczkami. W przypadku wstrzykiwań do kory odpowiednio jest, gdy wstrzykiwacz wystaje około 5mm ponad powierzchnię płytki prototypowej. W przypadku głębszych wstrzykiwań wartość tę można zwiększyć o odpowiadający przyrost głębokości. Końcówkę wyrównuje się narzędziem Dremel. Końcówki wstrzykiwaczy można również szlifować pod kątem jako dodatkową ostrożność przed zapchaniem, jeśli precyzja głębokości jest mniej istotna.
6. Następnie w zasięgu ramienia stereotaksycznego wybiera się stabilny punkt odniesienia i przesuwa matrycę wstrzykiwaczy tak, aby wyrównana końcówka zewnętrznego wstrzykiwacza znajdowała się w tym punkcie odniesienia.
7. Wybiera się drugi wstrzykiwacz wraz z jego odpowiednimi współrzędnymi. Bierze się pod uwagę względną różnicę wysokości (kierunek z) pomiędzy współrzędnymi pierwszego i drugiego wstrzykiwacza. Matrycę wstrzykiwaczy przesuwa się wzdłuż osi Z o tę względną odległość. Drugi wstrzykiwacz jest przycinany i wyrównywany narzędziem Dremel do odpowiedniej długości, tak aby końcówka drugiego wstrzykiwacza była teraz płaska i znajdowała się na wysokości punktu odniesienia. Matrycę wstrzykiwaczy można przesuwać w kierunkach X i Y, aby ułatwić porównanie końcówki wstrzykiwacza z punktem odniesienia.
8. Proces przycinania jest powtarzany dla pozostałych wstrzykiwaczy.

4. Montaż całego układu

1. Do tej części wymagane są zacisk stereotaktyczny oraz spersonalizowany zestaw injektorów, które zostały już wcześniej przygotowane.
2. Tylny koniec każdego injektora (koniec nieprzycięty) wprowadza się do niebieskiej tulei rurki F-240, a następnie, używając nakrętki P-235 i pierścienia P-200 firmy Upchurch Scientific, mocuje go do gwintowanego adaptera połączonego z pompą Hamilton za pomocą rurek polietylenowych. Szczegóły można znaleźć w instrukcjach producenta.
3. Za pomocą igły 27G do tylnej części strzykawek Hamilton wstrzykuje się olej silikonowy w taki sposób, aby cały układ – od strzykawki Hamilton do końcówki injektora – był całkowicie wypełniony, bez żadnych pęcherzyków powietrza.
4. Podczas ponownego umieszczania strzykawek Hamilton w pompie Hamilton należy zachować w nich jak największą objętość oleju silikonowego.
5. Jeśli eksperyment wymaga większej liczby strzykawek, niż przewidziano w pompie (w tym przypadku dwie), można zastosować małe elementy plastikowe (np. nasadki do igieł) jako dystanse, aby utrzymać strzykawki równolegle względem siebie i zapewnić, że wszystkie elementy będą pchane przez pompę w tym samym stopniu. Alternatywnie można zakupić u dostawcy Harvard Apparatus zestaw rozszerzeń do wielu racków, który pozwala na jednoczesne umieszczenie do 10 strzykawek.

5. Iniekcje/operacja

1. Proces wstrzykiwania za pomocą injektora równoległego jest bardzo podobny do wstrzykiwania za pomocą pojedynczej pipety.
2. Niezbędne jest stosowanie wolnych prędkości napełniania/infuzji przez cały ten proces, ponieważ szybkie pompowanie może obciążyć połączenie między rurką dużą a małą. Zalecana maksymalna prędkość: 2 μl/min podczas ładowania wirusa oraz 0,1 μl/min podczas infuzji wirusa.
3. Zanarkonizowaną mysz umieszcza się w stereotaksie, gdzie pozostaje ona pod narkozą przez cały czas trwania eksperymentu.
4. Przygotowuje się mysz zgodnie z potrzebami. Na przykład za pomocą skalpela wykonuje się pojedyncze cięcie wzdłuż linii środkowej skóry, od miejsca między oczami do miejsca między uszami. Skórę odciąga się, aby odsłonić czaszkę, a następnie usuwa powięź. Do stereotaksu mocuje się dociąganą pipetę szklaną. Pozycje uchwytów usznych reguluje się do momentu, aż bregma i lambda znajdą się na tej samej wysokości, a linia łącząca je będzie równoległa do osi Y stereotaksu. Osie stereotaksu orientuje się zgodnie z układem współrzędnych, w którym obliczono współrzędne wstrzykiwania. Zeruje się stereotaks z końcówką pipety szklanej na bregmie, a następnie końcówkę ustawia się nieco powyżej czaszki na współrzędnych X i Y jednego z miejsc wstrzykiwania.
5. Za pomocą wiertarki stomatologicznej ostrożnie usuwa się kość czaszki pod końcówką, aż pozostanie niezwykle cienka warstwa kości. Pipetę szklaną można opuszczać i podnosić, aby sprawdzić, czy wiercony otwór jest wycentrowany w prawidłowej pozycji. Za pomocą igły 30 G delikatnie usuwa się mały fragment warstwy kości w odpowiednich współrzędnych X i Y, aby odsłonić oponę twardą. Otwór ten powinien być na tyle duży, aby zmieścił się w nim jeden z injektorów (szerokość 0,25 mm). Schemat przedstawiono na Ryc. 1D. W ten sposób w czaszce, na współrzędnych X i Y odpowiadających każdemu miejscu wstrzykiwania, wykonuje się małe otwory o szerokości 0,25 mm.
6. Pipetę szklaną utylizuje się w pojemniku na odpady ostre, a dostosowany zestaw injektorów mocuje się do stereotaksu za pomocą zacisku stereotaksycznego.
7. Aby prawidłowo ustawić kąt zestawu injektorów, wybiera się dwa zewnętrzne injektory do kalibracji względem danego punktu odniesienia w następujący sposób: po dopasowaniu jednego z injektorów do punktu odniesienia, określa się względne odległości X i Y między miejscami wstrzykiwania względem tego injektora i jednego innego. Osie stereotaksu reguluje się tak, aby cały zestaw injektorów został przesunięty w kierunkach X i Y o te względne odległości. Jeśli drugi injektor nie jest teraz wyrównany z punktem odniesienia, poluzowuje się i obraca metalową kaniulę. Proces ten powtarza się iteracyjnie, aż zestaw injektorów zostanie ustawiony pod prawidłowym kątem.
8. Przed napełnieniem injektorów wirusem, wypełnia się je olejem silikonowym, aż strzykawki osiągną poziom 2 μl (lub więcej). Tworzy to strefę buforową, dzięki której wszelkie pęcherzyki powietrza lub zatory w końcówce można łatwo usunąć, przesuwając olej do przodu za pomocą pompy Hamiltona, bez konieczności ponownego napełniania całego systemu olejem silikonowym od strony tylnej strzykawek, jak opisano wcześniej.
9. Na czaszkę nakłada się sterylny kawałek Parafilmu, a injektory delikatnie opuszcza się na Parafilm. W przypadku współrzędnych o znacznie zróżnicowanej głębokości, ładowanie może ułatwić specjalnie wyfrezowany element (np. obiekt w kształcie schodów).
10. Kolejne kroki zakładają załadowanie 1 μl wirusa w każdym miejscu (następujące ilości należy zmniejszyć, jeśli pożądane są mniejsze objętości). Aby zagwarantować wstrzyknięcie >1 μl wirusa w każdym miejscu, 1,5 μl wirusa nanosi się pipetą na Parafilm lub „schody” przy końcówce każdego injektora.
11. Przy prędkości napełniania pompy Hamiltona ustawionej na 1 μl/min, do każdego injektora zasysa się 1,2 μl wirusa.
12. Końcówkę najdłuższego injektora zeruje się na bregmie, a następnie zestaw injektorów przesuwa się na współrzędne X i Y tego injektora. Jeśli problemem są zatory, np. w przypadku wielu głębokich celów: nawet przed wprowadzeniem końcówek injektorów do mózgu, zaleca się czasami uruchomienie infuzji z pompy, aż wirus zacznie wypływać ze wszystkich końcówek injektorów. Usuwa to pęcherzyki powietrza z końcówek injektorów i zapewnia brak zatorów. W przypadku zatoru pompę Hamiltona ustawia się na krótki impuls infuzji z wyższą prędkością 2 μl/min, aby delikatnie udrożnić zator.
13. Zestaw injektorów opuszcza się następnie przez małe otwory wykonane igłami 30 G do odpowiedniej głębokości Z.
14. Przez każdy injektor wstrzykuje się 1 μl wirusa z prędkością 0,1 μl/min.
15. Po wstrzyknięciu pozostawia się preparat na 30 minut.
16. Po powolnym wyjęciu zestawu injektorów z mózgu, pompę Hamiltona ustawia się na infuzję z tą samą prędkością 0,1 μl/min, aby sprawdzić, czy w każdym injektorze nie wystąpiły zatory.
17. Następnie injektory czyści się poprzez napełnienie i infuzję 1,5 μl etanolu z prędkością 2 μl/min.
18. Na koniec injektory ponownie napełnia się olejem silikonowym, aby zachować 2 μl strefy buforowej w każdej strzykawce Hamiltona.
19. Wszystkie urządzenia należy wysterylizować przed i po procedurze, zgodnie z protokołami bezpieczeństwa biologicznego i wykorzystania zwierząt obowiązującymi w danej instytucji.

6. Reprezentatywne wyniki

Równoległy układ wstrzykiwaczy przyspiesza zabieg mniej więcej o współczynnik równy liczbie wstrzykiwaczy, nie licząc czasu przygotowania i rekonwalescencji, choć poszczególne czasy będą zależeć od umiejętności operatora. W przypadku wstrzyknięcia 1 µL zazwyczaj obserwowaliśmy ekspresję lentiwirusa w sferze o średnicy około 1 mm (Rys. 1E). Precyzja wstrzykiwania była taka, że zmienność w pozycjonowaniu końcówki z próby na próbę wynosiła około 45 µm (odchylenie standardowe odległości od pozycji końcówki do zamierzonej pozycji końcówki).

Rycina 1. Projekt, implementacja i zastosowanie równoległego układu wstrzykiwaczy wirusów. A, schemat systemu równoległego układu wstrzykiwaczy, przedstawiający konfigurację potrójnego wstrzykiwacza do trzech jednoczesnych iniekcji. B, fotografia potrójnego równoległego układu wstrzykiwaczy zgodnie ze schematem w punkcie A. C, zacisk stereotaksyczny, przedstawiony w rzucie z góry. D, ilustracja techniki wydajnego, minimalizującego uszkodzenia otwierania otworów w czaszce w celu wprowadzenia wstrzykiwacza do mózgu: za pomocą wiertarki stomatologicznej należy zredukować grubość czaszki do ~50 mikronów, a następnie użyć czubka ostrej igły, aby wykonać małą kraniotomię. E, obraz fluorescencyjny przedstawiający komórki znakowane channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP w trzech obszarach kory mysiej, zgodnie z celowaniem potrójnego układu wstrzykiwaczy pokazanego w B.

Dyskusja

W ostatnich latach szereg genetycznie kodowanych sensybilizatorów optycznych umożliwiło aktywację i wyciszanie neuronów in vivo w sposób precyzyjny czasowo, w odpowiedzi na krótkie impulsy światła (np. ^{1,4,5,6,7,8,11}). Kluczową metodą sensybilizacji neuronów na światło w mózgu ssaków jest wykorzystanie wirusów, takich jak lentiwirusy i wirusy adeno-zależne (AAV), które mogą w bezpieczny i trwały sposób dostarczać geny kodujące opsyny do mózgów zwierząt, od myszy po małpy (np. ^2,9,10). Wirusy pozwalają na szybszą realizację badań niż transgenika, zwłaszcza w przypadku organizmów, które nie są modelami genetycznymi, takich jak szczury i małpy, a w przypadku opsyn mogą zapewnić wysoki poziom ekspresji, który mógłby być nieosiągalny w scenariuszach transgenicznych. Przedstawiamy tutaj równoległą macierz wstrzykiwaczy zdolną do szybkiego tworzenia tzw. „transgeniki na poziomie obwodów”, co umożliwia celowanie wirusowe w całe trójwymiarowe struktury mózgu za pomocą jednego genu w ramach jednego kroku chirurgicznego. Macierz wstrzykiwaczy składa się z jednej lub więcej pomp przemieszczeniowych, z których każda napędza zestaw strzykawek, a każda z nich doprowadza ciecz do kapilary z poliimidu/stopionego krzemionki za pomocą złącza odpornego na wysokie ciśnienie. Kapilary są dobierane pod kątem rozmiaru, a następnie wprowadzane w pożądane miejsca określone przez specjalnie frezowaną płytkę do pozycjonowania stereotaktycznego, co pozwala na dostarczenie wirusów lub innych odczynników do wybranej grupy obszarów mózgu. Aby użyć urządzenia, chirurg najpierw całkowicie wypełnia podsystem płynowy olejem, wstecznie wypełnia kapilary wirusem, wprowadza urządzenie do mózgu, a następnie powoli infunduje odczynniki (<0.1 μL/min).

Technologia ta umożliwi przeprowadzenie szerokiej gamy nowych rodzajów eksperymentów, takich jak wyłączanie struktur o złożonym kształcie (np. hipokampa) w skali milisekundowej w precyzyjnie określonych momentach podczas zachowania, czasowo precyzyjna inaktywacja struktur obustronnych, które mogą działać redundantly (np. lewego i prawego ciała migdałowatego), a także perturbacja wielu oddzielnych obszarów mózgu (np. wymuszanie pracy dwóch połączonych obszarów w przeciwfazie w celu zbadania, w jaki sposób synchronizacja międzyobszarowa zależy od aktywności w każdym z tych obszarów, lub stymulowanie wejść do danego obszaru przy jednoczesnym wyciszaniu części celów, aby zrozumieć, które z nich są kluczowe dla pośredniczenia w efektach tych wejść). W przypadku dużych mózgów, takich jak u naczelnych, w których niedawno wykazaliśmy optyczną, specyficzną dla typu komórek aktywację neuronalną³, perturbacja aktywności w obszarze istotnym dla zachowania może wymagać znakowania wirusowego dużych i złożonych struktur. Zauważamy, że równoległe układy injektorów mogą być wykorzystane do podawania niemal każdego ładunku – leków, neuromodulatorów, neuroprzekaźników, a nawet komórek – w złożonych wzorach 3D w mózgu, w sposób czasowo precyzyjny. Wreszcie, z punktu widzenia translacyjnego, możliwe jest szybkie projektowanie i wytwarzanie spersonalizowanych dla pacjenta urządzeń do terapii genowej lub dostarczania leków, dopasowanych do indywidualnej geometrii mózgu, co może wesprzeć nowe metody leczenia różnych patologii, potencjalnie poprzez zastosowanie cząsteczek sterowanych optycznie.

Układy wstrzykiwaczy zostały zaprojektowane w celu zapewnienia wysokiej precyzji, zarówno przestrzennej, jak i wolumetrycznej. W kierunkach X i Y osiągnięto to poprzez wiercenie bardzo precyzyjnie rozmieszczonych otworów za pomocą niedrogiego mini-frezera, przy czym otwory są na tyle małe, aby ściśle dopasować wstrzykiwacze, co gwarantuje ich wzajemną równoległość oraz precyzyjne rozmieszczenie. W kierunku Z wstrzykiwacze są przycinane przy użyciu aparatu stereotaksycznego, co pozwala na uzyskanie poziomu precyzji odpowiadającego samej operacji stereotaksycznej. Precyzja wolumetryczna wynika z dokładności pompy Hamiltona oraz zastosowania złączy o niemal zerowej objętości martwej, zaadaptowanych z dziedziny wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Wstrzykiwacze wykonane są z kapilar z topionego szkła krzemowego, które są wystarczająco wytrzymałe i sztywne, aby zachować precyzyjny kształt i odstępy pod wpływem ciśnienia, bez konieczności stosowania grubych ścianek typowych dla alternatyw, takich jak kaniule stalowe. Można łatwo wprowadzić niewielkie modyfikacje, aby dostosować równoległy układ wstrzykiwaczy do różnych eksperymentów. Na przykład, jeśli wymagana jest mniejsza objętość wirusa lub gęstsze rozmieszczenie, można zastosować cieńsze kapilary wraz z odpowiadającym im mniejszym wiertłem. Przyszłe urządzenia mogą wykorzystywać kanały i pompy mikroprzepływowe w celu zwiększenia liczby równoległych wstrzykiwaczy oraz zminimalizowania rozmiarów (co być może umożliwi montaż takich urządzeń na głowach zwierząt poruszających się swobodnie).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narzędzie Dremel	Narzędzie	Dremel	3956-02
Wytryskacz laserowy	Narzędzie	Universal Laser Systems	VLS2.30
Pistolet z klejem na gorąco	Narzędzie	Stanley Bostitch	GR20
Pompa strzykawkowa do wstrzykiwania i wycofywania (pompa Hamiltona)	Narzędzie	Harvard Apparatus	702001
10 μstrzykawki Hamiltona	Narzędzie	Hamilton Co	701N	Wymagana jedna sztuka na każde miejsce wstrzyknięcia
Stereotaksja myszy	Narzędzie	Stoelting Co.	51725D
Model mini-młyna	Narzędzie	Roland	MDX-15
0.011" średnica wiertła do mini frezarki	Narzędzie	McMaster-Carr	8915A12
1/32" średnica wiertła do mini-frezarki	Narzędzie	McMaster-Carr	8848A35
Wiertarka stomatologiczna wysokobiegowa	Narzędzie	Ryś	333
Akcesoria do wiertarki stomatologicznej	Narzędzie	Testy Pearsona	F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38
kaniula ze stali nierdzewnej o średnicy zewnętrznej (OD) 1,5 mm	Materiały	Small Parts, Inc.	HTX-15R
śruba maszynowa z łbem szczelinowym do opraw 1-72	Materiały	Small Parts, Inc.	MX-0172B
nakrętka sześciokątna 1-72	Materiały	Small Parts, Inc.	HNX-0172
płytka prototypowa PCB, 1/32" gruby	Materiały	Digi-Key	PC57-T-ND
Arkusz akrylowy, 1/8" gruby	Materiały	McMaster-Carr	8560K239
Złącza HPLC	Materiały	Upchurch Scientific	F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (niektóre z nich można kupić w opakowaniach po 10 sztuk; należy po prostu dodać an ‘Proszę wprowadzić tekst źródłowy do tłumaczenia.’ do końca numeru katalogowego)	Wymagany jeden na wtrysk na każdy punkt, z wyjątkiem F-252, P-627 i P-235, które mogą być użyte ponownie
Kapilara z topionego kwarcu, średnica zewnętrzna: 245 μm, ID: 100 μm	Materiały	Polymicro Technologies	2000022-10M
5-minutowa żywica epoksydowa ogólnego przeznaczenia	Materiały	Permatex	84101	5-minutowa uniwersalna żywica epoksydowa
Przewód polietylenowy 0,066 x 0,095 cala	Materiały	VWR international	63018-827