Artykuł metodologiczny

Produkcja lentiwirusów

DOI:

10.3791/1499

⸱

2 października 2009

 , 
1Diabetes Center, University of California, San Francisco - UCSF

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wytworzyć lentiwirusy, wektory DNA są transfekowane do ludzkich 293 komórek. Po zbiorach i zagęszczeniu supernatantu, miano wirusa określa się przez ekspresję fluorescencji za pomocą cytometru przepływowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Interferencja RNA (RNAi) to system wyciszania genów w żywych komórkach. W RNAi geny homologiczne w sekwencji do krótkich interferujących RNA (siRNA) są wyciszane w stanie potranskrypcyjnym. Krótkie RNA spinki do włosów, prekursory siRNA, mogą być wyrażane za pomocą lentiwirusa, co pozwala na RNAi w różnych typach komórek. Lentiwirusy, takie jak ludzki wirus niedoboru odporności, są zdolne do infekowania zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się. Opiszemy procedurę, którą należy spakować lentiwirusy. Pakowanie odnosi się do przygotowania kompetentnego wirusa z wektorów DNA. Systemy produkcji wektorów lentiwirusowych opierają się na systemie "podzielonym", w którym naturalny genom wirusa został podzielony na indywidualne konstrukty plazmidów pomocniczych. To rozszczepienie różnych elementów wirusa na cztery oddzielne wektory zmniejsza ryzyko powstania wirusa zdolnego do replikacji w wyniku przypadkowej rekombinacji genomu lentiwirusa. W tym przypadku wektor zawierający interesujące go shRNA i trzy wektory pakowania (p-VSVG, pRSV, pMDL) są przejściowo transfekowane do ludzkich 293 komórek. Po co najmniej 48-godzinnym okresie inkubacji supernatant zawierający wirusa jest zbierany i zagęszczany. Na koniec miano wirusa określa się za pomocą ekspresji reporterowej (fluorescencyjnej) za pomocą cytometru przepływowego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Część 1: Transfekcja komórek HEK 293 w celu wytworzenia lentiwirusów

*24 godziny przed transfekcją, umieść 2,5 X 106 komórek w 10-centymetrowym naczyniu, aby uzyskać konfluencję 50-70% następnego dnia.

  1. Rozpocznij ten protokół od przygotowania DNA, za pomocą którego później przetransfekujesz swoje komórki w celu wytworzenia wirusa. Najpierw rozcieńczyć odczynnik do transfekcji FuGENE 6 Roche, odczynnik lipidowy, który powoduje, że komórki pobierają DNA. W probówce o pojemności 1,5 ml odpipetować 30 μl FuGENE 6 do pożywki bez surowicy 600ul (SFDMEM). Należy uważać, aby FuGENE nie dotykał boku probówki, gdy jest dostarc....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centrum Badań Podstawowych nad Astmą Sandler (SABRE)
Fundacja Sandlera

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki DMEM HEK 293T Penicylina-streptomycyna Glutamina Sól fizjologiczna buforowana fosforanem FBSInvitrogen
FuGENE 6 pSico mCherry pMDL pRSV pVSVGRoche Group
BleachClorox
10-cm naczynia do hodowli komórkowych 96-dołkowe naczynia do hodowli komórkowych Falcon BD353003
PipetawielokanałowaRainin
Filtrowane końcówki do pipetRainin
1,5 ml Probówki Eppendorf Filtr strzykawkowy (0,45 i mu; m)Eppendorf
Beckman Coulter Inc.
Inkubator do hodowli tkankowych przy 5% CO2Coulter
Beckman SW41T. I wirnik
Ultrawirówka Beckman BeckmanCoulter Inc.
Mikroskop fluorescencyjnyCoulter
FACS ArrayBeckman Coulter Inc.
Odczynnik do transfekcji Probówki ultrawirówki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
  2. Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lentivirus ProductionViral TiterFlow CytometryUltracentrifugationTransfectionPlasmid DNAViral PackagingSerial DilutionFluorescent ReporterBiosafety Regulations

Powiązane artykuły