Produkcja lentiwirusa

Podsumowanie

W celu wytworzenia lentiwirusów wektory DNA są transfekowane do ludzkich komórek 293. Po zbiorze i skoncentrowaniu naddatku miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego.

Streszczenie

Interferencja RNA (RNAi) jest systemem wyciszania genów w żywych komórkach. W procesie RNAi geny o sekwencji homologicznej do krótkich interferujących RNA (siRNA) są wyciszane na etapie posttranskrypcyjnym. Krótkie RNA spinki (shRNA), będące prekursorami siRNA, mogą być ekspresowane z wykorzystaniem lentiwirusów, co umożliwia przeprowadzenie RNAi w różnych typach komórek. Lentiwirusy, takie jak ludzki wirus niedoboru odporności, są zdolne do infekowania zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się. Opiszemy procedurę pakowania lentiwirusów. Pakowanie odnosi się do przygotowania kompetentnego wirusa z wektorów DNA. Systemy produkcji wektorów lentiwirusowych opierają się na systemie „rozdzielonym”, w którym naturalny genom wirusa został podzielony na poszczególne konstrukty plazmidów pomocniczych. Rozdzielenie różnych elementów wirusowych na cztery oddzielne wektory zmniejsza ryzyko powstania wirusa zdolnego do replikacji w wyniku przypadkowej rekombinacji genomu lentiwirusowego. W tej metodzie wektor zawierający interesujące shRNA oraz trzy wektory pakujące (p-VSVG, pRSV, pMDL) są przejściowo transfekowane do ludzkich komórek 293. Po okresie inkubacji trwającym co najmniej 48 godzin supernatant zawierający wirusa jest zbierany i zagęszczany. Na koniec miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji reporterowej (fluorescencyjnej) przy użyciu cytometru przepływowego.

Protokół

Część 1: Transfekcja komórek HEK 293 w celu produkcji lentiwirusów

*Na 24 godziny przed transfekcją wysiać 2,5 X 10⁶ komórek do szalki 10 cm, aby następnego dnia uzyskać konfluencję na poziomie 50-70%.

1. Protokół należy rozpocząć od przygotowania DNA, którym później przeprowadzi się transfekcję komórek w celu wytworzenia wirusa. Najpierw należy rozcieńczyć odczynnik do transfekcji FuGENE 6 Roche, który jest odczynnikiem lipidowym umożliwiającym pobieranie DNA przez komórki. Do probówki o pojemności 1,5 ml należy nalać pipetą 30μl FuGENE 6 do 600ul medium bezsurowiczego (SFDMEM). Należy uważać, aby FuGENE nie dotknął ścianek probówki podczas dozowania do medium. Mieszaninę FuGENE i SFDMEM należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
2. W zakrętce probówki należy wymieszać 4 μg plazmidu lentiwirusowego z 4 μg każdego z wektorów pakujących wirusa 3^rd generacji (pMDL, pRSV i pVSV-G). Plazmid lentiwirusowy zawiera DNA, które wirus wbuduje w genom każdej zainfekowanej komórki, natomiast wektory pakujące zawierają geny wszystkich pozostałych białek niezbędnych do wytworzenia lentiwirusa.
3. Należy zamknąć probówkę i wymieszać zawartość, kilkakrotnie odwracając probówkę.
4. Inkubować przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
5. Całą zawartość probówki należy przenieść pipetą na płytkę z komórkami 293. Wymieszać delikatnie, przechylając płytkę w przód i w tył.
6. Komórki należy zwrócić do inkubatora i pozostawić do produkcji wirusów na 48-96 godzin przed zbiorem.
7. Podczas inkubacji komórki 293 dokonują transkrypcji interesującego DNA z plazmidu lentiwirusowego, tworząc kopię RNA konstruktu lentiwirusowego. Transkrybują i tłumaczą one również geny z wektorów pakujących na białka wirusowe. Białka te służą do tworzenia wirusów zawierających wersję RNA konstruktu lentiwirusowego, którą wirus następnie odtworzy w procesie odwrotnej transkrypcji i wbuduje w genomy wszystkich zainfekowanych komórek.

Część 2: Pozyskiwanie lentiwirusów

1. Po okresie inkubacji wyjmij komórki z inkubatora i za pomocą jednorazowej strzykawki 10ml usuń nadsącz zawierający wirusa. Objętość nadsączu wyniesie około 10ml.
2. Załóż na końcówkę strzykawki filtr strzykawkowy 0.45μM i przefiltruj wirusa do probówki do ultrawirówki Beckman. Filtr pozwala na przejście wyłącznie wirusów, zatrzymując komórki.
3. Przed utylizacją wszystkie komórki produkujące wirusa, płytki hodowlane, strzykawki oraz filtry inkubuj w 10% roztworze wybielacza przez 45 minut.

Część 3: Zagęszczanie lentiwirusów za pomocą ultrawirowania

1. Umieścić probówki wirówki w koszyczkach rotora SW-41Ti lub SW-28.
2. Użyć bezsurowiczego DMEM do zrównoważenia wszystkich probówek zawierających wirusa z dokładnością do 0.2g.
3. Szczelnie zamknąć koszyczki rotora i zamocować je w rotorze przed umieszczeniem rotora w ultrawirówce.
4. Wirować wirusa przez 90 minut w ultrawirówce w temperaturze 4°C przy 25 000 rpm w rotorze SW-41Ti lub 24 000 rpm w rotorze SW-28.
5. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odwrócić probówki do góry dnem, aby przelać nadsącz do pojemnika z 10% roztworem wybielacza.
6. Użyć chusteczki Kimwipe do odsączenia nadmiaru cieczy wokół osadu, a następnie odwrócić probówkę i pozostawić w odpowiednim statywie nie dłużej niż przez pięć minut.
7. Aby resuspender osad wirusowy, użyć końcówki z filtrem, aby dodać do probówki 100 μL sterylnego PBS, a następnie pipetować ciecz w górę i w dół około 20 razy.
8. Pozostawić wirusa w temperaturze 4°C przez noc w celu całkowitej resuspensji. Preparaty wirusowe można przechowywać w temperaturze 4°C przez około 1 tydzień i w -80°C do jednego roku. Należy pamiętać o potraktowaniu wszystkich pustych probówek 10% wybielaczem przed ich wyrzuceniem.
9. Jeśli preparat wirusowy ma być używany dłużej niż przez 1 tydzień, należy przygotować minimalne aliquoty po 5-20 μL do przyszłych eksperymentów oraz 1 aliquot o objętości od 3 do 5 μL do miareczkowania. Alikuoty należy zamrozić i przechowywać w temperaturze -80°C.

Część 4: Miareczkowanie lentiwirusów z użyciem cytometrii przepływowej

1. Kolejnym krokiem jest oznaczenie miana wirusa za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta znajduje zastosowanie wyłącznie w przypadkach, gdy plazmid lentiwirusowy zawiera gen reporterowy fluorescencyjny. Zasada polega na tym, że podczas infekcji komórki wirus wprowadza DNA plazmidu lentiwirusowego do genomu tej komórki. Zainfekowana komórka będzie następnie transkrybować i transladować geny zawarte w plazmidzie lentiwirusowym; jeśli do plazmidu włączono gen reporterowy fluorescencyjny, zainfekowane komórki będą wykazywać fluorescencję. Poziom fluorescencji reprezentuje aktywność, czyli miano wirusa.
2. Dla każdego stoku wirusa poddawanego mianowaniu, należy rozcieńczyć 3 μl stężonego wirusa w 1,5 ml pożywki kompletnej (DMEM, pen-strep, glutamina, FBS).
3. W dołkach 1-6 w jednym rzędzie płytki 96-dołkowej należy wykonać następujące rozcieńczenia szeregowe: do wszystkich 6 dołków dodać 100 μl kompletnej pożywki DMEM. Do pierwszego dołka dodać 100 μl pożywki bez wirusa (jest to kontrola niebarwiona), do drugiego dołka dodać 100 μl rozcieńczonego wirusa (co odpowiada 1 ml nierozcieńczonego wirusa), do trzeciego dołka dodać 100 μl mieszaniny z drugiego dołka, do czwartego dołka dodać 100 μl z trzeciego dołka, do piątego dołka dodać 100 μl z czwartego dołka, a do szóstego dołka dodać 100 μl z piątego dołka. Na koniec należy odjąć 100 μl z szóstego dołka i zutylizować w roztworze wybielacza. Wykonano rozcieńczenie szeregowe, w którym każdy kolejny dołek zawiera połowę objętości wirusa w porównaniu do poprzedniego.
4. Uzupełnić całkowitą objętość we wszystkich dołkach do 200 μl. Należy pamiętać, że są to jedynie sugerowane rozcieńczenia, które powinny być odpowiednie dla mianowania większości stężonych wirusów. W przypadku wirusów o niskim mianie lub nierozcieńczonych może być konieczne dostosowanie rozcieńczeń.
5. Każdy niewykorzystany rozcieńczony wirus należy potraktować 10% roztworem wybielacza przez 45 minut przed wyrzuceniem do pojemnika na odpady biologiczne.
6. Do każdego z 6 dołków dodać ok. 15 000 zdrowych, aktywnie dzielących się komórek 293. Jedna płytka 96-dołkowa może posłużyć do mianowania 16 preparatów wirusowych.
7. Przenieść komórki do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i pozwolić na przebieg infekcji przez co najmniej 48 godzin.
8. Po inkubacji komórki analizuje się pod kątem ekspresji reportera (w naszym przypadku fluorescencji) za pomocą cytometru przepływowego. Cząstki wirusowe są ilościowo określane na podstawie procenta komórek fluorescencyjnych w każdym dołku.

Oblicz liczbę jednostek zakaźnych na ml, korzystając z następującego wzoru:

Część 5: Reprezentatywne wyniki:

Po 48-godzinnym okresie inkubacji po transfekcji, płytka z komórkami 293 powinna wykazywać około 90% fluorescencji. Wysoki odsetek fluorescencyjnych komórek wskazuje na wysoką liczbę komórek produkujących wirusa.

Po wirowaniu osad wirusowy jest ledwo widoczny podczas resuspensji. Jest to zjawisko normalne, ponieważ osad jest przezroczysty i bardzo mały.

Podczas interpretacji wyników cytometrii przepływowej należy pamiętać, że dokładne obliczenia miana są możliwe tylko wtedy, gdy zainfekowane (fluorescencyjne) komórki otrzymały nie więcej niż jedną integrację wirusową na komórkę. Aby zapewnić spełnienie tego warunku, do obliczeń należy używać komórek z poziomem infekcji < 15 %. Komórki z wyższym poziomem infekcji prawdopodobnie otrzymały wiele integrantów wirusowych na komórkę. Rozcieńczenia zasugerowane w kroku 2 powinny przynieść kilka próbek mieszczących się w tym zakresie infekcji. Idealnie byłoby wykorzystać kilka próbek do wygenerowania wykresu mianowania (linia liniowa), z którego można obliczyć miano końcowe, jednak w razie potrzeby miano można obliczyć na podstawie pojedynczej próbki. Przewidywane miano wynosi 1.0 x 10⁷ TU/ml dla wirusa niekoncentrowanego oraz 1.0 x 10⁸ TU/ml dla wirusa skoncentrowanego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM, komórki HEK 293T, penicylina-streptomycyna, glutamina, PBS, FBS	Invitrogen
Odczynnik do transfekcji FuGENE 6, pSico mCherry, pMDL, pRSV, pVSVG	Roche Group
Wybielacz	Clorox
10-cm szalki do hodowli komórek, 96-dołkowe płytki do hodowli komórek	Falcon BD	353003
Pipeta wielokanałowa	Rainin
Filtrowane końcówki do pipet	Rainin
Probówki Eppendorf 1.5ml, strzykawka, filtr strzykawkowy (0.45-μm)	Eppendorf
Probówki do ultrawirówki	Beckman Coulter Inc.
Inkubator do hodowli tkankowych z 5% CO2	Coulter
Rotor Beckman SW41T.I
Ultrawirówka Beckman	Beckman Coulter Inc.
Mikroskop fluorescencyjny	Coulter
Analizator FACS Array	Beckman Coulter Inc.