Ilościowa ocena lipidomu drożdży przy użyciu spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylaną

Podsumowanie

Opisujemy nową ilościową metodę lipidomiczną do identyfikacji licznych gatunków lipidów w drożdżach za pomocą spektrometrii mas z jonizacją metodą electrospray (ESI/MS). Metoda ta przewyższa obecnie dostępne metody identyfikacji i kwantyfikacji lipidów pod względem zdolności do rozdzielania różnych form molekularnych lipidów, czułości i szybkości.

Streszczenie

Lipidy są jedną z głównych klas biomolekuł i odgrywają ważną rolę w dynamice błony, magazynowaniu energii i sygnalizacji^1-4. Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae, genetycznie i biochemicznie modyfikowalny jednokomórkowy eukariont z opisanym genomem i bardzo prostym lipidomem, jest cennym modelem do badania funkcji biologicznych różnych gatunków lipidów u wielokomórkowych eukariontów^2,3,5. S. cerevisiae ma 10 głównych klas lipidów o długości łańcuchów, głównie 16 lub 18 atomów węgla i zerowym lub jednym stopniu nienasycenia^6,7. Istniejące metody identyfikacji i kwantyfikacji lipidów - takie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa, chromatografia cienkowarstwowa, mikroskopia fluorescencyjna i chromatografia gazowa, a następnie MS - są dobrze ugruntowane, ale mają niską czułość, niewystarczająco oddzielają różne formy molekularne lipidów, wymagają pochodnej lipidów przed analizą lub mogą być dość czasochłonne. Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis naszego eksperymentalnego podejścia do rozwiązania tych nieodłącznych ograniczeń za pomocą ESI/MS do identyfikacji i kwantyfikacji całego zestawu lipidów w komórkach drożdży. Opisana metoda nie wymaga chromatograficznego rozdzielania złożonych mieszanin lipidowych odzyskanych z komórek drożdży, co znacznie przyspiesza proces pozyskiwania danych. Metoda ta umożliwia identyfikację i kwantyfikację lipidów w stężeniach tak niskich jak g/ml i jest z powodzeniem stosowana do oceny lipidomów całych komórek drożdży i ich oczyszczonych organelli. Ekstrakcja lipidów z całych komórek drożdży przy użyciu tej metody analizy lipidów trwa od dwóch do trzech godzin. Wystarczy pięć do dziesięciu minut, aby uruchomić każdą próbkę wyekstrahowanych i wysuszonych lipidów na spektrometrze masowym Q-TOF wyposażonym w źródło nano-elektrorozpylania.

Protokół

Materiały i metody

1. Szczepy drożdży i warunki wzrostu
   Szczep typu dzikiego BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) był uprawiany na bogatym podłożu YEPD (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton, 2% glukoza). Komórki hodowano w temperaturze 30°C z wytrząsaniem rotacyjnym przy 200 obr./min w kolbach Erlenmeyera w stosunku "objętość kolby/objętość medium" wynoszącym 5:1.
2. Przechowywanie komórek drożdży do ekstrakcji lipidów
   
   1. Hodowlę komórek o objętości 50 ml zebrano przez odwirowanie przy 3000 x g przez 5 minut.
   2. Umyte dwa razy zimną wodą.
      1. Zawiesić pelet w 25 ml lodowatej wody
      2. Granulki w wirówce przy 3000 x g przez 5 minut
   3. Zawiesić osad i przenieść do probówki eppendorf
   4. Osad przez odwirowanie, 16 000 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant i zamrozić  w temperaturze -80°C do użycia. (używamy zlewki z alkoholem izopropylowym przechowywanej w zamrażarce -80, można również użyć ciekłego azotu)
3. Odczynniki
   Chloroform i metanol klasy biotechnologicznej pochodziły z firmy Sigma-Aldrich. Wolne kwasy tłuszczowe i triacyloglicerole zakupiono w firmie Larodan (Malmö, Szwecja). Różne gatunki fosfolipidów - w tym fosfatydylocholina, fosfatydyloetanoloamina, fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna, kwas fosfatydynowy i kardiolipiny - uzyskano z Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA). Szybkoobrotowe szklane probówki wirówkowe z nasadkami wyłożonymi teflonem pochodziły od firmy Fisher.

Ekstrakcja lipidów

To jest modyfikacja protokołu opisanego przez Bligha i Dyera⁸. Wszystkie manipulacje z wyekstrahowanymi lipidami należy wykonywać za pomocą szklanych pipet lub strzykawek; Tworzywa sztuczne będą wytwarzać duży sygnał tła, jeśli wejdą w kontakt z chloroformem. Dokładne objętości nie są krytyczne, o ile zachowane są proporcje 1:2:0,8 dla chloroformu - MeOH -_H2Ow kroku 3 i 2:2:1,8 dla chloroformu - MeOH - H₂O w kroku 7.

1. Zawiesić zamrożone komórki w 1,6 ml lodowato destylowanego_H2O.
2. Przenieść 1,6 ml zawiesiny komórek do szklanych probówek wirówek szybkoobrotowych.
3. Do zawiesiny komórek dodać 6 ml mieszaniny chloroformu i MeOH (1:2) oraz 0,8 ml kulek szklanych.
4. Wirować zawiesinę komórkową ze szklanymi kulkami dwa razy przez 1 minutę.
5. Dodaj 2 ml chloroformu i delikatnie wymieszaj.
6. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym mieszaniem.
7. Dodać 2 ml destylowanego_H2Oi delikatnie wymieszać.
8. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym mieszaniem.
9. Wirować przez 5 minut przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
10. Zbierz całą fazę ciekłą do nowej szklanej probówki wirówkowej o dużej prędkości.
11. Dodać 3,2 ml chloroformu do osadów komórkowych z kroku 9.
12. Wiruj dwa razy przez 1 minutę.
13. Wirować przez 5 minut przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
14. Dodać supernatant do fazy ciekłej z kroku 10.
15. Wirować przez 5 minut przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
16. Wyrzuć górną (wodną) fazę i przenieś dolną (organiczną) fazę do nowej wysokoobrotowej szklanej probówki wirówkowej.
17. Wirować przez 5 minut przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
18. Przenieść cały supernatant do szklanej fiolki i wysuszyć pod wpływem azotu.
19. Warstwę lipidową rozpuścić w 500 μl chloroformu i przechowywać w temperaturze -20°C.

Analiza lipidów za pomocą spektrometrii mas

Powinna być przygotowana wcześniej podstawowa mieszanka wzorców lipidowych w chloroformie, jak również podstawowy roztwór MeOH - chloroform (1:1) z 0,1% (v/v) wodorotlenkiem amonu.

1. Przed wstrzyknięciem należy połączyć 10 μl próbki z 10 μl wzorcowej mieszaniny lipidów podanej w tabeli 1. W 200 μl chloroformu 1:1 : metanol z 0,1% NH₄OH.
   • Stosunek wzorca do próbki można zmienić w razie potrzeby.
2. Rozpuścić lipidy za pomocą spektrometru masowego Micromass Q-TOF 2 wyposażonego w źródło nanoelektronsprayu działającego z natężeniem przepływu 1 μl/min.
   • Dokładne parametry instrumentu będą się różnić w zależności od instrumentu. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z ustawieniami dla Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) wyposażonego w źródło nano-elektrorozpylania. Chociaż skorzystaliśmy z wysokiej rozdzielczości spektrometru mas typu Q-TOF, nie jest to obowiązkowy wymóg.
3. Po akwizycji widma mas są wygładzane, tło odejmowane i wyśrodkowane, a następnie lista pików eksportowana do Excela. Piki każdej klasy lipidów są następnie normalizowane do ich wewnętrznego wzorca. W zależności od aplikacji może być konieczne wykonanie dalszej obróbki końcowej, takiej jak deizotopowanie i dekonwolucja.

Tabela 1. Wewnętrzne wzorce lipidów, ich stężenia w mieszaninie wzorcowej oraz tryb MS do ich analizy.

zł szt. szt. szt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. szt.

Klasa lipidowa	Standardowy skład łańcucha	Masa wzorca	Stężenie (μg/ml)	Tryb MS
Kwas fosfatydowy	14:0/14:0	591,40	100	Minus
Fosfatydyloetanoloamina	14:0/14:0	634,45	200	Minus
Fosfatydyloinozytol	N/a	N/a	N/a	Minus
Fosfatydyloseryna	14:0/14:0	622,37 pkt.	Rozdział 40	Minus
Kardiolipina	Wymiary: 4x14:0	619,92	100	Minus
Wolne kwasy tłuszczowe	19:0	297,28	100	Minus
Fosfatydylocholina	14:0/14:0	650,48	100	Plus
Triacyloglicerole	13:0/13:0/13:0	698,63	200	Plus

Tabela 2. Ustawienia przyrządu dla Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) wyposażonego w źródło nano-elektrorozpylania.

	Przepływ	Napięcie stożka	Napięcie kapilarne	Gaz kolizyjny
Tryb dodatni	1μl/min	-28 V	3,0 kV	10
Tryb ujemny	1μl/min	30 V	-3,2 kV	10

Dyskusja

Metoda ta umożliwia szybką ocenę ilościową lipidomu drożdży przy użyciu łatwo dostępnych, niedrogich materiałów. Metoda pozwala na identyfikację większości gatunków lipidów występujących w komórkach drożdży, z wyjątkiem diacylogliceroli, ergosteroli i estrów ergosterylowych, chociaż lipidy te można zidentyfikować poprzez zastąpienie wodorotlenku amonu wodorotlenkiem litu. Opisana metoda umożliwia identyfikację i kwantyfikację lipidów już przy stężeniach μg/ml, przy czym liniowość stężeń rozkłada się na 2 do 3 rzędów wiel...