Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

Podsumowanie

Opisujemy nową ilościową metodę lipidomiki służącą do identyfikacji licznych gatunków lipidów w drożdżach z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją przez elektroryś spray w trybie skanowania przeglądowego (ESI/MS). Metoda ta przewyższa obecnie dostępne metody identyfikacji i oznaczania ilościowego lipidów pod względem zdolności do rozdzielania różnych form cząsteczkowych lipidów, czułości oraz szybkości analizy.

Streszczenie

Lipidy są jedną z głównych klas biomolekuł i odgrywają istotne role w dynamice błon, magazynowaniu energii oraz sygnalizacji^1-4. Drożdżowiec piekarniczySaccharomyces cerevisiae, jednokomórkowy eukariont możliwy do modyfikacji genetycznej i biochemicznej, o zsekwencjonowanym genomie i bardzo prostym lipidomie, stanowi cenne modelowe narzędzie do badania funkcji biologicznych różnych gatunków lipidów u wielokomórkowych eukariontów^2,3,5.S. cerevisiaema 10 głównych klas lipidów o długości łańcucha głównie 16 lub 18 atomów węgla oraz o stopniu nienasycenia równym zero lub jednemu^6,7. Istniejące metody identyfikacji i ilościowego oznaczania lipidów – takie jak chromatografia cieczowa wysokiej rozdzielczości, chromatografia cienkowarstwowa, mikroskopia fluorescencyjna oraz chromatografia gazowa połączona z MS – są dobrze ugruntowane, jednak charakteryzują się niską czułością, niewystarczającym rozdzieleniem różnych form molekularnych lipidów, wymagają one pochodzenia lipidów przed analizą lub mogą być czasochłonne. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy opis naszego podejścia eksperymentalnego mającego na celu przezwyciężenie tych wewnętrznych ograniczeń poprzez zastosowanie skanowania badawczego ESI/MS do identyfikacji i ilościowego oznaczania pełnego zestawu lipidów w komórkach drożdży. Opisana metoda nie wymaga chromatograficznego rozdzielania złożonych mieszanek lipidów wyizolowanych z komórek drożdży, co znacznie przyspiesza proces pozyskiwania danych. Ta metoda umożliwia identyfikację i oznaczenie ilościowe lipidów w stężeniach rzędu g/ml i została pomyślnie zastosowana do oceny lipidomów całych komórek drożdży oraz ich oczyszczonych organelli. Ekstrakcja lipidów z całych komórek drożdży w celu zastosowania tej metody analizy lipidów trwa od dwóch do trzech godzin. Uruchomienie każdego próbek ekstrahowanych i wysuszonych lipidów na spektrometrze masowym Q-TOF wyposażonym w źródło nano-elektrospreju trwa zaledwie pięć do dziesięciu minut.

Protokół

Materiały i metody

1. Szczepy drożdży i warunki hodowli
   Szczep typu dzikiego BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) hodowano w bogatym medium YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy). Komórki hodowano w temperaturze 30°C przy wytrząsaniu obrotowym z prędkością 200 rpm w kolbach Erlenmeyera przy stosunku „objętość kolby/objętość medium” wynoszącym 5:1.
2. Przechowywanie komórek drożdży do ekstrakcji lipidów
   
   1. Kulturę komórek o objętości 50 ml zebrano poprzez wirowanie przy 3000 x g przez 5 minut.
   2. Przemyto dwukrotnie zimną wodą.
      1. Resuspendowano osad w 25 ml lodowatej wody
      2. Odwirowano komórki w wirówce przy 3000 x g przez 5 minut
   3. Resuspendowano osad i przeniesiono do probówki typu Eppendorf
   4. Odwirowano przy 16 000 x g przez 2 minuty, usunięto nadsącz i zamrożono  w temperaturze -80°C do czasu użycia (stosujemy zlewkę z alkoholem izopropylowym przechowywaną w zamrażarce -80°C, można również użyć ciekłego azotu)
3. Odczynniki
   Chloroform i metanol klasy biotechnologicznej pochodziły z firmy Sigma-Aldrich. Wolne kwasy tłuszczowe i triacyloglicerole zakupiono w firmie Larodan (Malmo, Szwecja). Różne rodzaje fosfolipidów – w tym fosfatydycholina, fosfatydyloetanoloamina, fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna, kwas fosfatydowy oraz kardiolipiny – otrzymano z firmy Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA). Wysokoobrotowe szklane probówki wirówkowe z zakrętkami wyłożonymi teflonem pochodziły z firmy Fisher.

Ekstrakcja lipidów

Jest to modyfikacja protokołu opisanego przez Bligha i Dyera⁸. Wszystkie manipulacje z ekstrahowanymi lipidami należy przeprowadzać przy użyciu szklanych pipet lub strzykawek; tworzywa sztuczne wywołają silny sygnał tła w przypadku kontaktu z chloroformem. Dokładne objętości nie są krytyczne, o ile zachowane zostaną proporcje 1:2:0,8 dla chloroformu - MeOH - H₂O w kroku 3 oraz 2:2:1,8 dla chloroformu - MeOH - H₂O w kroku 7.

1. Zamrożone komórki zawiesić w 1.6 ml lodowatej destylowanej H₂O.
2. Przenieść 1.6 ml zawiesiny komórkowej do szklanych probówek do wirowania wysokoprędkościowego.
3. Do zawiesiny komórkowej dodać 6 ml mieszaniny chloroformu i MeOH (1:2) oraz 0.8 ml kulek szklanych.
4. Zawiesinę komórkową z kulkami szklanymi mieszać w vorteksie dwukrotnie przez 1 min.
5. Dodać 2 ml chloroformu i delikatnie wymieszać.
6. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej, okazjonalnie mieszając.
7. Dodać 2 ml destylowanej H₂O i delikatnie wymieszać.
8. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej, okazjonalnie mieszając.
9. Wirować przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
10. Całą fazę ciekłą zebrać do nowej szklanej probówki do wirowania wysokoprędkościowego.
11. Do osadów komórkowych z etapu 9 dodać 3.2 ml chloroformu.
12. Mieszać w vorteksie dwukrotnie przez 1 min.
13. Wirować przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
14. Nastanad osad dodać do fazy ciekłej z etapu 10.
15. Wirować przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
16. Odlać górną fazę (wodną) i przenieść dolną fazę (organiczną) do nowej szklanej probówki do wirowania wysokoprędkościowego.
17. Wirować przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.
18. Cały naddatek przenieść do szklanej fiolki i wysuszyć w strumieniu azotu.
19. Film lipidowy rozpuścić w 500 μl chloroformu i przechowywać w temperaturze -20°C.

Analiza lipidów za pomocą spektrometrii mas

Należy wcześniej przygotować mieszaninę wzorców lipidów w chloroformie zgodnie z Tabelą 1, a także roztwór zapasowy MeOH - chloroform (1:1) z 0,1% (v/v) wodorotlenku amonu.

1. Przed wstrzyknięciem połączyć 10 μl próbki z 10 μl standardowej mieszaniny lipidów podanej w Tabeli 1, w 200 μL mieszaniny chloroform : metanol w stosunku 1:1 z dodatkiem 0,1% NH₄OH.
   • Stosunek standardu do próbki można zmienić w zależności od potrzeb.
2. Rozdzielenie lipidów przeprowadzić przy użyciu spektrometru mas Micromass Q-TOF 2 wyposażonego w źródło nano-elektrospray pracujące z szybkością przepływu 1 μl/min.
   • Dokładne parametry instrumentu będą się różnić w zależności od urządzenia. Ustawienia dla spektrometru Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) wyposażonego w źródło nano-elektrospray znajdują się w Tabeli 2. Choć wykorzystaliśmy wysoką rozdzielczość spektrometru mas typu Q-TOF, nie jest ona wymogiem obligatoryjnym.
3. Po akwizycji widma masowe są wygładzane, poddawane odjęciu tła oraz centrowaniu, a następnie lista pików jest eksportowana do programu Excel. Piki każdej klasy lipidów są następnie normalizowane do ich standardu wewnętrznego. W zależności od zastosowania może być konieczne przeprowadzenie dalszego przetwarzania danych, takiego jak deizotopowanie i dekonwolucja.

Tabela 1. Wewnętrzne standardy lipidowe, ich stężenia w mieszaninie standardowej oraz tryb MS dla ich analizy.

Klasa lipidów	Standardowy skład łańcucha	Masa standardu	Stężenie (μg/ml)	Tryb MS
Kwas fosfatydowy	14:0/14:0	591.40	100	Negatywny
Fosfatydyloetanoloamina	14:0/14:0	634.45	200	Negatywny
Fosfatydyloinozytol	N/A	N/A	N/A	Negatywny
Fosfatydyloseryna	14:0/14:0	622.37	40	Negatywny
Kardiolipina	4x14:0	619.92	100	Negatywny
Wolne kwasy tłuszczowe	19:0	297.28	100	Negatywny
Fosfatydylocholina	14:0/14:0	650.48	100	Pozytywny
Triacyloglicerole	13:0/13:0/13:0	698.63	200	Pozytywny

Tabela 2. Ustawienia instrumentu Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) wyposażonego w źródło nano-elektrospray.

	Przepływ	Napięcie stożka	Napięcie kapilary	Gaz kolizyjny
Tryb dodatni	1μl/min	-28 v	3.0 kv	10
Tryb ujemny	1μl/min	30 v	-3.2 kv	10

Dyskusja

Metoda ta umożliwia szybką ilościową ocenę lipidomu drożdży przy użyciu łatwo dostępnych, niedrogich materiałów. Metoda pozwala na identyfikację większości gatunków lipidów występujących w komórkach drożdży z wyjątkiem diacylogliceryli, ergosteroli i estrów ergosterylu, choć lipidy te można zidentyfikować, zastępując wodorotlenek amonu wodorotlenkiem litu. Opisana metoda umożliwia identyfikację i oznaczanie ilościowe lipidów przy stężeniach tak niskich jak μg/ml, przy czym liniowość stężeń obejmuje od 2 do 3 rzędów wielk...