Ludzki lizat płytek krwi jest bogatym źródłem czynników wzrostu i silnym suplementem w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia proces przygotowania dużej puli ludzkiego lizatu płytek krwi, rozpoczynając od osocza bogatopłytkowego, przeprowadzając kilka cykli zamrażania i rozmrażania oraz usuwając fragmenty płytek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie puli lizatu płytek krwi ludzkich (pHPL) jako wydajnego suplementu do bezzernowych hodowli ludzkich komórek macierzystych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykazano, że czynniki wzrostu pochodzące z płytek krwi skutecznie stymulują proliferację komórekin vivo1,2iin vitroEfekt ten opisano w przypadku mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), fibroblastów oraz endotelialnych komórek kolonogennych w obecności płytek krwi aktywowanych trombiną3-5lub poddane lizie poprzez cykle zamrażania i rozmrażania6-14przed dodaniem uwalnianych składników płytkowych do pożywki hodowli komórkowej. Troficzny efekt czynników wzrostu pochodzenia płytkowego został już przetestowany w kilku badaniach nad inżynierią tkankową i terapią regeneracyjną.1,15-17Uważa się, że różna wydajność wynika przynajmniej częściowo z indywidualnych różnic w stężeniach czynników wzrostu18,19oraz obecny brak zestandaryzowanych protokołów przygotowania płytek krwi.15,16Niniejszy protokół przedstawia praktyczną procedurę generowania puli ludzkiego lizatu płytek krwi (pHPL) pochodzącego z rutynowo otrzymywanej osocza bogatopłytkowego (PRP) z czterdziestu do pięćdziesięciu pojedynczych donacji krwi. Poprzez kilka cykli zamrażania i rozmrażania błony płytek krwi ulegają uszkodzeniu, a czynniki wzrostu zostają efektywnie uwolnione do osocza. Na koniec fragmenty płytek są usuwane poprzez wirowanie, aby uniknąć rozległego tworzenia agregatów i usunąć potencjalne antygeny. Wdrożenie pHPL do standardowych protokołów hodowli stanowi obiecujące narzędzie dla dalszego rozwoju terapii komórkowych namnażanych w systemach wolnych od białek zwierzęcych.
Protokół
1. Materiał wyjściowy
Należy rozpocząć od jednostek osocza bogatopłytkowego (PRP) przygotowanych metodą cytaferezy lub pochodzących z warstwy leukocytarnej (buffy coat).
2. Kontrola sterylności
W celu sprawdzenia sterylności pobierz próbkę 20 mL z każdej jednostki PRP, przenosząc tę objętość do podłączonego małego worka (Baxter). Odłącz worek poprzez zgrzewanie.
3. Zamrażanie jednostek PRP
Bezpośrednio po przygotowaniu zamroź jednostki PRP do temperatury co najmniej -20°C w oryginalnej torbie do przechowywania, bez dalszych manipulacji.
4. Rozmrażanie jednostek HPL
W przypadku negatywnych wyników testów bakteryjnych, rozmrozić jednostki ludzkiego lizatu płytek krwi, zwane dalej jednostkami HPL, w temperaturze 37°C (kąpiel wodna), aż do całkowitego rozpuszczenia grudek lodu. Nie podgrzewać HPL.
5. Poolowanie jednostek HPL
Aby przygotować ustandaryzowany produkt, należy pobrać co najmniej dziesięć do piętnastu rozmrożonych jednostek HPL na jedną pulę lizatu płytek krwi. Po kolejności podłącz worki HPL do podwójnego worka do łączenia (MacoPharma) i przenieś HPL do tych dwóch worków. Odłącz puste worki HPL poprzez zgrzewanie. Poprzez zmieszanie zawartości obu worków uzyskaj końcową objętość od 3 do 4 L połączonego ludzkiego lizatu płytek krwi (pHPL). Podłącz mały worek (Baxter) i pobierz próbkę 20 mL pHPL w celu sprawdzenia sterylności połączonego produktu. Odłącz ten worek poprzez zgrzewanie.
6. Porcjowanie pHPL
Podziel pHPL na odpowiednie alikwoty do dalszej obróbki. Podłącz małe worki (Baxter) do podwójnego worka do łączenia (Macopharma) i przenieś objętości do 250 mL do małych worków do przechowywania (Baxter). Odłącz wypełnione worki poprzez zgrzewanie.
7. Ponowne zamrażanie aliquotów pHPL
Zwiększ tempo fragmentacji płytek oraz ilość uwalnianych czynników wzrostu poprzez dodatkowy cykl zamrażania i rozmrażania. Ponownie zamroź małe woreczki z podzielonym pHPL w temperaturze co najmniej -20°C.
8. Ponowne rozmrażanie i porcjowanie alikwotów pHPL
Rozmrozić worki z pHPL w temperaturze 37°C (kąpiel wodna). Przenieść zawartość do probówek 50 mL (Falcons BD), odcinając rurkę worka sterylnymi nożyczkami i przelewając pHPL do probówek. Krok ten należy wykonać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego lub grzybiczego.
9. Usuwanie fragmentów płytek krwi
Ponieważ fragmenty płytek krwi mają tendencję do agregacji i mogą indukować alloimmunizację, należy usunąć je z pHPL. W związku z tym probówki z pHPL należy odwirować przy 4,000g (15 minut, 4°C). W komorze z laminarnym przepływem powietrza pipetować supernatant osocza do końcowych probówek do przechowywania (Falcons BD), a osady płytek krwi usunąć, aby uniknąć obecności fragmentów w hodowli komórkowej.
10. Przechowywanie pHPL
Ponownie zamroź alikwoty w fiolkach pHPL o pojemności 50 mL w temperaturze co najmniej -20°C i przechowuj je do użytku eksperymentalnego.
11. Zastosowanie pHPL w hodowlach komórkowych
W pierwszej kolejności należy dodać do pożywki heparynę bez konserwantów, aby zapobiec tworzeniu się żelu. Rozmrozić alikwot pHPL w temperaturze 37°C i uzupełnić pożywkę hodowlaną, dodając 8 – 10%.
Pożywki
Pożywka do MSC:
Należy użyć 500 mL a-MEM, dodać 56 mL rozmrożonego pHPL (szczegóły znajdują się w odniesieniu 1) oraz Heparynę bez konserwantów w stężeniu 2 IU/mL (=224 μl roztworu zapasu), aby zapobiec koagulacji medium poprzez agregację fibrynogenu w osoczu i uzyskać końcowe stężenie 10% pHPL. Dodatkowo należy dodać roztwór Penicyliny (100U/mL) /Streptomycyny (100μg/mL) oraz 2mM L-Glutaminy (oba od Sigma).
Przefiltruj pożywkę przez filtr próżniowy o rozmiarze porów 20 μm (Millipore). Odpowiednio opisz butelkę (zawartość, data).
Pożywka ECFC:
Użyć jednej butelki (500 mL) EBM, dodać alikwoty cytokin, 56 mL pHPL, Heparynę bez konserwantów w stężeniu 10 IU/ml (=1120μl roztworu zapasu), roztwór Penicyliny (100U/mL) / Streptomycyny (100 g/mL) oraz 2mM L-Glutaminy do podłoża podstawowego, a następnie przefiltrować za pomocą filtra próżniowego o rozmiarze porów 20 μl (Millipore). Odpowiednio oznakować butelkę (zawartość, data).
Rysunek 1:Przygotowanie plazmy bogatopłytkowej z donacji krwi pełnej z lokalnego banku krwi lub innego uprawnionego dostawcy. Po wirowaniu krew można rozdzielić na plazmę, warstwę leukocytarną oraz erytrocyty. Przed wirowaniem w celu wyizolowania plazmy bogatopłytkowej można połączyć cztery jednostki warstwy leukocytarnej grupy krwi O oraz jedną jednostkę plazmy grupy krwi AB. Standardowa jednostka plazmy bogatopłytkowej o objętości około 300mL powinna zawierać 1x109 płytkaczek na mL lub łącznie 3x1011 płytkaczek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niektórych regionach osocze bogate w płytki krwi (PRP) może być pozyskiwane z warstw leukocytarnych (buffy-coats), które w przeciwnym razie stanowią produkt odpadowy przy produkcji zagęszczonych erytrocytów z przebadanych donacji krwi (Rycina 1). Optymalnie PRP należy wykorzystać niezwłocznie do dalszego przygotowania pHPL, ponieważ w przeterminowanych koncentratach płytek dostępność czynników wzrostu może być ograniczona z powodu uszkodzeń płytek podczas przechowywania oraz ich degradacji20. Ponadto zaleca ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Niniejsza praca została wsparta przez Austriacką Fundację Badawczą (FWF, grant N211-NAN dla DS) oraz Austriacką Agencję Promocji Badań (FFG, grant N200 dla DS). Autorzy dziękują Claudii Url za doskonałą pomoc techniczną oraz Monice Farrell za redakcję językową.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Podwójna torba (2 x 3,5L) | MacoPharma | VDL 8000XQ | pierwotnie do punkcji wodobrzusza |
| Probówka Falcon 50 mL | Falcon BD | 2098 | |
| Pipety Stripettes 50 mL | Costar | 4501 | |
| Worki do osocza (600mL) | Baxter Internationl Inc. | R4R2021 | |
| Sterylny zgrzewacz drenów | Terumo Medical Corp. | TSCD-II | |
| Sprzęt do zgrzewania | Fresenius Kabi | Compo Seal | |
| Kąpiel wodna | |||
| Sterylne nożyczki | |||
| Zaciski | |||
| Wirówka |
Bibliografia
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
- Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Repair Regen. 16, 585-601 (2008).
- Giacco, F. Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1. FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).
- Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25, 1270-1278 (2007).
- Kakudo, N. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 122, 1352-1360 (2008).
- Doucet, C. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: A safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 205, 228-236 (2005).
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum Tissue Eng Part. C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Lange, C. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, 18-26 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Bernardo, M. E. Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. J Cell Physiol. 211, 121-130 (2007).
- Carrancio, S. Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification. Exp Hematol. 36, 1014-1021 (2008).
- Muller, A. M. Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue. Tissue Eng Part A. 15, 869-875 (2009).
- Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., Andia, I. The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields. Biomaterials. 28, 4551-4560 (2007).
- Anitua, E. New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies. Trends Biotechnol. 24, 227-234 (2006).
- Martinez-Zapata, M. J. Efficacy and safety of the use of autologous plasma rich in platelets for tissue regeneration: a systematic review. Transfusion. 49, 44-56 (2009).
- Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Craniomaxillofac Surg. 30, 97-102 (2002).
- Frechette, J. P., Martineau, I. &, Gagnon, G. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing. J Dent Res. 84, 434-439 (2005).
- Seghatchian, J., Krailadsiri, P. The platelet storage lesion. Transfus Med Rev. 11, 130-144 (1997).
- Selvaggi, T. A., Walker, R. E., Fleisher, T. A. Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions. Blood. 89, 776-779 (1997).
- Tonti, G. A., Mannello, F. From bone marrow to therapeutic applications: different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera. Int J Dev Biol. 52, 1023-1032 (2008).
- Bieback, K. Human Alternatives to Fetal Bovine Serum for the Expansion of Mesenchymal Stromal Cells from Bone Marrow. Stem Cells. , (2009).
- Rohde, E., Schallmoser, K., Bartmann, C., Reinisch, A. GMP-Compliant Propagation of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Regulations and Quality. Gad, S. C. , John Wiley and Sons, Inc. 97-115 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
