Endotelialne komórki progenitorowe tworzące kolonie (ECFCs) stanowią obiecujące narzędzie do badania homeostazy i regeneracji naczyń krwionośnych.1,2 Niniejsza praca przedstawia nową metodę izolacji i ekspansji ECFC z heparynowanej krwi obwodowej dorosłego człowieka bez użycia surowicy zwierzęcej, z wykorzystaniem puli lizatu płytek krwi człowieka (pHPL), co zmniejsza ryzyko immunizacji przeciwko białkom bydlęcym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i wielkoskalowa ekspansja dorosłych ludzkich endotelialnych komórek progenitorowych zdolnych do tworzenia kolonii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niniejsza praca przedstawia nową strategię izolacji komórek progenitorowych tworzących kolonie śródbłonka (ECFC) z heparynizowanej, w pozostałym zakresie nieprzetworzonej krwi obwodowej dorosłego człowieka w średnim czasie 12 dni. Po ekspansji na dużą skalę można uzyskać >1x108 komórek ECFC do dalszych badań. Dzięki zastosowaniu pHPL można wykluczyć kontakt ludzkich komórek z antygenami surowicy bydlęcej. Za pomocą cytometrii przepływowej i immunohistochemii można scharakteryzować wyizolowane komórki jako ECFC, a ich funkcjonalność in vitro w zakresie tworzenia struktur przypominających naczynia można przetestować w teście z matrigelem. Ponadto komórki te mogą zostać wstrzyknięte podskórnie w modelu mysim w celu utworzenia funkcjonalnych, ukrwionych naczyń in vivo. Po długoterminowej ekspansji i kriokonserwacji proliferacja, funkcja oraz stabilność genomowa wydają się być zachowane. 3,4
Ta metoda izolacji i ekspansji bez użycia białek zwierzęcych jest łatwo stosowalna w celu uzyskania dużej ilości ECFC.
Protokół
A.) IZOLACJA ECFC
DZIEŃ 1:
- Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotować pożywkę do hodowli komórek Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2). 500 ml Endothelial Basal Medium-2 uzupełnić heparyną (1 ml stężenia 1000 U/ml), 5 ml 100-krotnym roztworem penicyliny/streptomycyny (wszystkie od Sigma, St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com), L-glutaminą (stężenie końcowe 2 mM) oraz 50 ml puli ludzkiego lizatu płytek krwi (pHPL). Następnie dodać 0,2 ml hydrokortyzonu, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml VEGF, 0,5 ml EGF, 0,5 ml IGF-1 i 0,5 ml kwasu askorbinowego (dostarczone jako SingleQuots, wszystkie od Lonza, Walkersville, MD; http://www.lonzabioscience.com/). Pożywkę przefiltrować sterylnie przez 500 ml próżniowy filtr Millipore o rozmiarze porów 0,2 µm. Ponieważ pHPL tworzy małe skrzepy, do jednej porcji pożywki może być potrzebnych dwa filtry. Przefiltrowane EGM-2 wstępnie ogrzać do 37°C w łaźni wodnej
- Pobrać próbki krwi, pobierając 5 ml obwodowej krwi ludzkiej od osoby dorosłej z żyły łokciowej do 6 ml probówki vacutainer z heparyną sodową bez konserwantów. Próbki krwi należy przetworzyć w ciągu maksymalnie dwóch godzin.
- Rozpocząć od przygotowania w komorze z laminarnym przepływem powietrza jednej kolby 75 cm2 (T75; Costar) z nakrętką z filtrem, jednej pipety 25 ml i dwóch pipet 5 ml.
- Do kolby wlać 15 ml wstępnie ogrzanej uzupełnionej pożywki EGM-2 za pomocą pipety 25 ml. Następnie otworzyć fiolkę z krwią i pobrać całe 5 ml pipetą 5 ml do kolby. Pustą fiolkę z krwią wypłukać 5 ml dodatkowej pożywki EGM-2 za pomocą drugiej pipety 5 ml. Całkowita objętość w kolbie T75 wynosi 25 ml. Zamknąć nakrętkę z filtrem kolby i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C, przy 5% CO2 i 95% wilgotności na 24 godziny.
DZIEŃ 2:
- Po około 24 godzinach (przez noc) należy usunąć mieszaninę pożywki z krwią, aby pozbyć się komórek nieprzylegających. W tym celu przygotuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza dwie pipety 25 ml i trzy pipety 5 ml, a następnie podgrzej w kąpieli wodnej do 37°C 20 ml uzupełnionej pożywki EGM-2 (przygotowanej poprzedniego dnia) oraz 30 ml PBS.
- Wyjmij z inkubatora kolbę z próbką i usuń cały nadosad za pomocą pipety 25 ml. Należy uważać, aby nie zarysować powierzchni kolby, by uniknąć uszkodzenia potencjalnych kolonii. Przemyj wewnętrzną powierzchnię adhezyjną kolby trzykrotnie, ostrożnie dodając 10 ml podgrzanego PBS i przechylając kolbę z jednej strony na drugą. Za każdym razem natychmiast usuń i wylej PBS.
- Do kolby dodaj 20 ml świeżej, podgrzanej pożywki EGM-2 i umieść ją z powrotem w inkubatorze. Proces ten należy przeprowadzić tak szybko i delikatnie, jak to możliwe, aby komórki przytwierdzone nie oddzieliły się od podłoża. ECFC łatwo ulegają odklejeniu, jeśli są zbyt długo utrzymywane w PBS lub w temperaturze pokojowej.
- Systematycznie przeglądaj kolbę co drugi dzień, zaczynając od drugiego dnia, używając mikroskopu świetlnego przy małym powiększeniu w celu poszukiwania wzrostu ECFC. Po znalezieniu kolonii zaznacz jej położenie na zewnętrznej górnej ściance kolby. Należy pamiętać, że kolby nie powinny pozostawać poza inkubatorem dłużej niż 5 minut.
DZIEŃ 5:
- Piątego dnia po wysianiu przeprowadź całkowitą wymianę medium, aby usunąć komórki nieprzylegające. W tym celu podgrzej 20 ml EGM-2 do 37°C w kąpieli wodnej i przygotuj dwie pipety o pojemności 25 ml.
- Usuń medium za pomocą pipety 25 ml i jak najszybciej dodaj świeże, uprzednio podgrzane, uzupełnione EGM-2. Aby uniknąć wysychania, komórki nie powinny pozostawać bez medium przez więcej niż minutę. Umieść naczynia z powrotem w inkubatorze i codziennie monitoruj kolbę.
- Dokarmiaj komórki, wymieniając 30% medium na świeże, uzupełnione EGM-2 dwa razy w tygodniu.
DZIEŃ 14-28:
- Typowe kolonie o morfologii brukowanej powinny pojawić się około 12. dnia. Zaznacz górną zewnętrzną ściankę kolby, aby wskazać położenie każdej kolonii. Pozostaw kolonie do wzrostu aż do 28. dnia, chyba że pojedyncze komórki zaczną się odrywać. Po zidentyfikowaniu kolonii pierwotnych można je zebrać między 14. a 28. dniem, w zależności od ich wielkości.
B.) ZBIERANIE ECFC
- Podgrzej wstępnie 5 ml trypsyny 0,05%/EDTA, 20 ml PBS oraz 5 ml świeżego, uzupełnionego medium EGM-2.
- Całkowicie usuń medium z kolby do probówki typu Falcon (należy uważać, aby nie dotknąć powierzchni kolby, by uniknąć uszkodzenia potencjalnych kolonii) i ostrożnie przemyj komórki 10 ml podgrzanego PBS.
- Dodaj 5 ml trypsyny/EDTA i inkubuj przez 5 minut w inkubatorze. Komórki nie powinny być eksponowane na trypsynę dłużej niż przez 7 min, ponieważ staje się ona toksyczna. Dokładne opukiwanie ścianek kolby pomaga w odklejeniu komórek. Zahamuj aktywność proteazy trypsyny, dodając około 10 ml zachowanego, użytego medium hodowlanego.
- Przenieś zawiesinę komórkową do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. Przemyj kolbę raz 10 ml PBS, który następnie dodaj do zebranej zawiesiny komórkowej. Centryfuguj zawiesinę komórkową przy 300 g przez 7 min w temperaturze 4°C, aby zebrać komórki i usunąć trypsynę. Odlej nadosad i niezwłocznie resuspenduj osad komórkowy w 1 ml PBS. Przechowuj w lodzie.
- Określ liczbę komórek zgodnie z opisem w protokole JoVE opracowanym przez R. Ricardo i K. Phelani.5
C.) EKSPANSJA ECFC
- Uzupełnić 500 ml EGM-2 zgodnie z opisem w A 1.1). Podgrzać wstępnie do 37°C w łaźni wodnej.
- Dla powierzchni hodowlanej wynoszącej około 2500 cm2 przygotować albo 11 naczyń T220 (225 cm2), albo 15 naczyń T175 (175 cm2), albo jedną czterowarstwową fabrykę komórek (CF-4; Nunc, Naperville, IL; http://www.nuncbrand.com). Dodatkowo w komorze z laminarnym przepływem powietrza będą potrzebne dwa nowe korki wentylacyjne oraz specjalny sterylny lejek.
- Aby zasiać ECFC z początkową gęstością komórek 100 c/cm2, konieczne jest obliczenie liczby komórek. Dla jednej fabryki CF-4 252 800 komórek resuspenduje się w 500 ml świeżego EGM-2 i przelewa do CF-4 za pomocą sterylnego lejka. Zamknąć jeden otwór korkiem wentylacyjnym i przechylić CF-4 na jedną z dłuższych stron, aby umożliwić równomierny rozkład medium pomiędzy wszystkimi 4 warstwami. Następnie przywrócić komorę do pozycji poziomej i otworzyć pokrywkę korka wentylacyjnego. Umieścić CF-4 w inkubatorze.
- Wymieniać 20% medium co najmniej raz w tygodniu, aż do momentu uzyskania konfluencji w CF-4.
- Zebrać komórki zgodnie z opisem w B.), używając 70 ml trypsyny/EDTA i około 200 ml PBS.
REPREZENTATYWNE WYNIKI
Stosując tę metodę izolacji, zaobserwowaliśmy tworzenie się kolonii pierwotnych w 12. dniu. W poprzednim badaniu udało się odzyskać średnio 4,0 ± 0,8 kolonii ECFC z każdego ml krwi obwodowej.4 Komórki ECFC wykazywały typowy wygląd brukowany. Po szeroko zakrojonej ekspansji, przy gęstości wysiewu 100 cells/cm2, uzyskaliśmy > 1 x 108 komórek w łącznym czasie około 30 dni od 3 ochotników płci męskiej i 1 ochotniczki płci żeńskiej (w wieku od 26 do 50 lat).
Wykazano, że ECFC hodowane w tych warunkach wykazują zdolność do proliferacji, są funkcjonalne i stabilne genomowo.4 Ponadto komórki mogą być przechowywane (w 10 % DMSO) w ciekłym azocie do późniejszego użycia. 3,4
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ta nowatorska metoda izolacji i ekspansji jest prostym i wydajnym procesem, który jest bardziej efektywny i mniej czasochłonny dzięki uniknięciu separacji komórek (brak konieczności stosowania gradientu gęstości) oraz tańszy niż techniki konwencjonalne. Dzięki zastosowaniu kontaktu pHPL z antygenami bydlęcymi, ewentualna późniejsza ksenoimmunizacja zostaje wykluczona. W okresie hodowli mogą tworzyć się małe skrzepy wywołane przez pHPL. W oparciu o nasze doświadczenie, skrzepy te nie wpływają na tworzenie kolonii, prolife...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Autorzy dziękują dr Katharinie Schallmoser za udostępnienie pHPL oraz Margarethei Frühwirth i Danieli Thaler za doskonałą pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka podstawowa dla komórek śródbłonka Endothelial basal Medium-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, hydrokortyzon, kwas askorbinowy | |
| Heparyna bez konserwantów | Biochrom AG | 10U/ml na EGM-2 | |
| L-glutamina | Sigma-Aldrich | 2mM na EGM-2 | |
| Penicylina i streptomycyna | Sigma-Aldrich | 100U/mL penicyliny i 100μg/mL streptomycyny na EGM-2 | |
| Trypsyna/1mM EDTA | Invitrogen | 7ml dla kolby T75 70ml dla CF-4 | |
| PBS | |||
| Czterowarstwowa fabryka komórek (CF-4) | Corning | ||
| Lejek sterylny | Corning | ||
| Kolba hodowlana T75cm2 (z nakrętką z filtrem) | Corning | ||
| Probówki vacutainer 6 mL (z heparyną sodową bez konserwantów) | BD Biosciences | wypełnione 108 IU/6ml heparyny sodowej bez konserwantów | |
| Probówki Falcon 50ml | Falcon BD | ||
| Pipety Stripetts 5ml | Costar | ||
| Pipety Stripetts 25ml | Costar | ||
| Wyciskarka | Costar | ||
| Sterylny filtr o rozmiarze porów 0,2 | EMD Millipore | 2x 500ml na EGM-2 |
Bibliografia
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
