Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pępowina jest bogatym źródłem komórek progenitorowych o wysokim potencjale proliferacyjnym, w tym mezenchymalnych komórek sromowych (zwanych również mezenchymalnymi komórkami macierzystymi, MSCs) oraz endothelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFCs). Oba typy komórek odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu integralności tkanek i prawdopodobnie biorą udział w procesach regeneracyjnych oraz tworzeniu guzów.
Aby w sposób porównawczy badać ich biologię i funkcję, ważne jest, aby oba typy komórek pochodziły od tego samego dawcy. W celach regeneracyjnych korzystne może być również pozyskanie MSCs i ECFCs z tej samej tkanki.
Ponieważ terapie komórkowe powinny w przyszłości trafić z laboratorium do praktyki klinicznej, opracowaliśmy nową metodę izolacji i dalszej ekspansji komórek progenitorowych bez użycia białek zwierzęcych. W każdym etapie naszego protokołu płytkowe lizaty ludzkie (pHPL) zastąpiły płodową surowicę bydlęcą, aby całkowicie uniknąć kontaktu komórek z białkami ksenogenneimi.
W niniejszym filmie zaprezentowano metodologię izolacji i ekspansji komórek progenitorowych z jednej pępowiny.
Wszystkie materiały i procedury zostaną opisane.
Protokół
Część 1: Przygotowanie
1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowej
Przed rozpoczęciem przygotowania pożywki należy zgromadzić wszystkie niezbędne materiały i narzędzia.
Odmrozić 2 x 56 ml alikwotów puli ludzkiego lizatu płytek krwi (pHPL, wykonanego samodzielnie: referencja 1 oraz JoVE #1523), 10 ml 100-krotnego roztworu penicyliny/streptomycyny oraz 2 x 5 mL L-glutaminy (obie z firmy Sigma).
Rozmrozić alikwoty cytokin i czynników wzrostu (VEGF, bFGF, EGF, IGF, hydrokortyzon, kwas askorbinowy, Heparyna, Amfoterycyna dostarczone jako „pojedyncze alikwoty”), przygotowane do uzupełnienia jednej butelki (500 mL) pożywki EGM-2 (Lonza).
Z lodówki wyjmij po jednej butelce o pojemności 500 ml (i) modyfikowanego przez alfę minimalnego medium esencjalnego (a-MEM) oraz (ii) podstawowego medium dla komórek śródbłonka (EBM).
Wszystkie poniższe kroki są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkankowych w warunkach sterylnych.
Przygotuj heparynę bez konserwantów (np. Biochrom), rozpuszczając proszek w wodzie sterylnej do uzyskania końcowego stężenia 1000 IU/mL.
Pożywka MSC:
Należy użyć 500 mL a-MEM, dodać 56 mL rozmrożonego pHPL (szczegóły znajdują się w referencji 1) oraz 2 IU/mL (=224 μl roztworu stokowego) heparyny bez konserwantów (zapobiega to koagulacji medium poprzez agregację fibrynogenu w osoczu), aby uzyskać końcowe stężenie 10% pHPL. Dodatkowo należy dodać roztwór penicyliny (100U/mL) /streptomycyny (100μg/mL) oraz 2mM L-glutaminy (oba z Sigma).
Przefiltruj medium przez filtr próżniowy o rozmiarze porów 20 μm (Millipore). Odpowiednio opisz butelkę (zawartość, data).
Pożywka ECFC:
Należy użyć jednej butelki (500 mL) EBM, dodać do podłoża podstawowego alikwoty cytokin, 56 mL pHPL, heparynę bez konserwantów w stężeniu 10 IU/ml (=1120μl roztworu zapasu), roztwór penicyliny (100U/mL) /streptomycyny (100 g/mL) oraz 2mM L-Glutaminy, a następnie przefiltrować całość za pomocą filtra próżniowego o rozmiarze porów 20 μl (Millipore). Butelkę należy odpowiednio oznakować (zawartość, data).
2. Sterylizacja narzędzi chirurgicznych
Pinceta, ostra para nożyc chirurgicznych oraz uchwyt skalpela muszą zostać poddane sterylizacji termicznej lub być sterylnymi wyrobami jednorazowymi.
3. Przygotowanie probówek do pobierania pępowiny
Dodać 500 IU heparyny bez konserwantów do polipropylenowych probówek 50 ml (Falcon) i uzupełnić do końcowej objętości 20 mL za pomocą PBS. Przenieść probówki do sali porodowej.
4. Świadoma zgoda (potwierdzona przez lokalny komitet etyki lub IRB).
Przed porodem zapytaj rodziców, czy chcieliby przekazać fragment pępowiny, i rzetelnie poinformuj ich o celach, w jakich zostanie on wykorzystany.
5. Pobranie pępowiny
Po dostarczeniu i obejrzeniu łożyska oraz pępowiny, odetnij odcinek pępowiny o długości 10 cm i natychmiast przenieś go do probówki wypełnionej heparyną, aby zapobiec krzepnięciu krwi pozostałej w naczyniach pępowiny. Przystąp do izolacji komórek tak szybko, jak to możliwe.
Część 2: Izolacja komórek
- Przygotuj komorę z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek, czyszcząc powierzchnie preparatem Incidin lub 70% EtOH. W wyczyszczonej komorze odpowiednio rozmieść sterylne płytki do hodowli komórek o powierzchni 150 cm2, flasks do hodowli komórek o powierzchni 75 cm (obie marki Corning), PBS, wysterylizowane narzędzia chirurgiczne, skrobaki do komórek, uchwyt do probówek, pipety graduowane 25 mL oraz strzykawki 5 ml z igłami stępionymi.
- Podgrzej przygotowane pożywki do hodowli komórek α-MEM oraz EGM-2 do temperatury 37°C w kąpieli wodnej.
- Przenieś pępowinę z sali porodowej do laboratorium wyposażonego w komorę do hodowli komórek. Po przeniesieniu pępowiny do komory z laminarnym przepływem powietrza, przemyj ją dwukrotnie w PBS (poprzez przeniesienie na nową płytkę), aby usunąć zanieczyszczone komórki krwi. Przepłucz żyłę pępowinową po kaniulacji jednego z jej końców za pomocą sterylnej strzykawki 5 mL z igłą stępioną, używając PBS, aż płyn wypływający z drugiego końca pępowiny stanie się całkowicie przezroczysty (kolor czerwony wskazuje na zanieczyszczenie krwią).
Komórki ECFC:
- Przygotować kolbę 75 cm2 (Corning), opisać ją i wlać 15-20 mL uprzednio ogrzanej pożywki EGM-2.
- Umieścić pępowinę na nowej płytce wypełnionej sterylnym PBS.
Używając nożyczek chirurgicznych, przeciąć pępowinę na dwa kawałki o długości około 5 cm (krótsze fragmenty są łatwiejsze w obróbce, ponieważ naczynia pępowinowe są skręcone wzdłuż swojej osi). - Zlokalizować żyłę pępowinową (duże naczynie), wsunąć jedno ostrze nożyczek chirurgicznych i przeciąć żyłę wzdłużnie. Na tym etapie pomocne może być wsparcie asystenta, który będzie przytrzymywał już przeciętą żyłę za pomocą dwóch pęset podczas dalszego cięcia.
- Przenieść fragment pępowiny z przeciętą żyłą na nową płytkę bez PBS, następnie za pomocą skrobaka do komórek zeskrobać wewnętrzną (śródbłonkową) powierzchnię żyły pępowinowej, pocierając od jednego końca do drugiego. Przenieść komórki do przygotowanej kolby, płucząc końcówkę skrobaka w pożywce. Powtórzyć tę procedurę co najmniej 10 razy.
- Zamknąć kolbę i umieścić ją w inkubatorze (37°C, 5% CO2, 95% wilgotności).
MSC:
- Przygotuj płytkę hodowlaną o powierzchni 150 cm2 (Corning) i opisz ją.
- Pobierz fragment pępowiny (po zeskrobaniu warstwy śródbłonka) i potnij cały fragment na bardzo małe kawałki, używając sterylnych nożyczek i sterylnego skalpela. Maksymalny rozmiar fragmentów pępowiny powinien wynosić 1-2 mm.
- Przenieś fragmenty pępowiny sterylną pęsetą do wcześniej opisanej płytki hodowlanej. Pozostawienie otwartej płytki przez 5 minut przed napełnieniem pożywką wzmacnia przywieranie fragmentów do plastikowej powierzchni.
- Po odpowiednim przywarciu fragmentów pępowiny do plastiku, ostrożnie dodaj 30-35 mL uprzednio ogrzanej pożywki alpha modified MEM. Staraj się używać jak najniższej prędkości dozowania, aby upewnić się, że wszystkie fragmenty pozostaną przytwierdzone.
- Zamknij płytkę i umieść ją w inkubatorze (37°C, 5% CO2, 95% wilgotności).
Część 3: Ekspansja komórek i potwierdzenie immunofenotypu za pomocą cytometrii przepływowej
Ekspansja komórek
EFCFs:
- Następnego dnia sprawdź przyczepność komórek śródbłonka pod mikroskopem odwróconym i wymień całe pożywkę EGM-2, aby usunąć wszystkie nieprzyczepione komórki i cząsteczki.
- Namnażaj komórki aż do osiągnięcia konfluencji, wymieniając jedną trzecią pożywki dwa razy w tygodniu. Po osiągnięciu konfluencji odczep komórki za pomocą 0,05% Trypsyny/0,7 mM EDTA i przenieś je do nowych naczyń hodowlanych. W zależności od liczby komórek w kolbie T75 należy dobrać rozmiar i liczbę nowych kolb, aby zapewnić niską gęstość zasiewu dla dalszej ekspansji.
- Podczas namnażania komórek wymieniaj jedną trzecią pożywki dwa razy w tygodniu.
MSC:
- Wzrost MSC z pępowiny zajmuje więcej czasu, dlatego należy odczekać co najmniej 3-4 dni przed sprawdzeniem pod mikroskopem odwróconym obecności wrzecionowatych komórek w otoczeniu przytwierdzonych fragmentów tkanki. Gdy przyrost komórek jest wystarczający, fragmenty tkanki mają tendencję do odrywania się z powodu utraty kontaktu z plastikiem.
- Po 10-12 dniach usunąć fragmenty tkanki, od럴pczepić MSC od plastiku za pomocą 0,05% Trypsyny/0,7 mM EDTA i przenieść je do nowych naczyń hodowlanych. W zależności od liczby komórek na płytce należy zdecydować o rozmiarze i liczbie nowych kolb, aby zagwarantować niską gęstość siewu w celu dalszej ekspansji.
- Podczas ekspansji komórek wymieniać jedną trzecią medium dwa razy w tygodniu.
Cytometria przepływowa
Wymagany sprzęt:
Cytometr przepływowy (BD FACSCalibur), probówki mikronowe (Corning), statyw na probówki, surowica owcza (odczyn blokujący), wirówka (Eppendorf), przeciwciała monoklonalne
MSCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, kontrole izotypowe
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, kontrole izotypowe
- Po osiągnięciu konfluencji odkleić komórki za pomocą 0,05% trypsyny/0,7 mM EDTA i wirować przy 300g przez 7 min w temperaturze 4°C.
- Resuspenduj komórki do stężenia 1x106 komórek/ml w zmodyfikowanym PBS i zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał przy użyciu 10% v/v surowicy owczej przez 20 min w 4°C.
- Oznakuj probówki mikrodozujące i dodaj odpowiednie stężenie przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie.
- Dodaj 50 μl zawiesiny komórkowej (zablokowanej) do każdej probówki i inkubować przez 30 min w 4°C.
- Wypłucz komórki, dodając zmodyfikowany bufor PBS, aby usunąć niespecyficznie wiążące się przeciwciała.
- Przenieś oznakowane komórki do cytometru przepływowego i przeprowadź analizę.
Część 4: Wzrost kolonii ECFC, fiksacja, barwienie i analiza hierarchii
- Wysiać niemal czyste zebrane ECFCs z bardzo niską gęstością wysiewu wynoszącą 3 lub 10 komórek na centymetr kwadratowy w płytkach do hodowli komórkowej, aby umożliwić wzrost pojedynczych kolonii.
- Wymieniać jedną trzecią pożywki dwa razy w tygodniu.
- Po 14 dniach (koniec hodowli) usunąć pożywkę, przemyć dwukrotnie PBS i utrwalić kolonie lodowatym roztworem fixującym (aceton : metanol = 3 : 2) przez 15 minut w lodówce.
- Wylać roztwór fixujący i pozostawić płytki otwarte do wyschnięcia na 10 minut.
- Rehydratować komórki wodą destylowaną przez 10 minut.
- Dodać roztwór hematoksyliny Harrisa i barwić utrwalone kolonie przez 12 minut.
- Usunąć roztwór hematoksyliny i opłukać płytki wodą z kranu, aby pozbyć się pozostałości roztworu barwiącego.
- Wykonać zdjęcia każdej kolonii za pomocą stereomikroskopu i zaimportować pliki w formacie *.jpg lub *.tif na komputer.
- Otworzyć zdjęcia w oprogramowaniu ImageJ i przeanalizować dokładną liczbę komórek w każdej kolonii zgodnie z opisem w animacji.
- Uruchomić oprogramowanie ImageJ i zaimportować obraz kolonii, korzystając z funkcji „File\Open” w menu rozwijanym.
- Kontynuować, korzystając z funkcji „Process\Subtract Background”.
- Użyć funkcji „wyboru eliptycznego lub pędzla” w menu ImageJ, aby zaznaczyć margines kolonii.
- Wyczyścić otoczenie obrazu za pomocą funkcji „Edit\Clear Outside” i przyciąć zdjęcie, wybierając „Image\Crop”.
- Ręcznie dostosować próg za pomocą funkcji „Image\Adjust\Threshold” w taki sposób, aby wszystkie komórki były całkowicie zabarwione na czerwono.
- Policzyć liczbę komórek w kolonii, wybierając „Analyze\Analyze Particles”. Wybrać odpowiednie ustawienia (zoptymalizowane dla każdego typu komórek) i zatwierdzić przyciskiem „OK”. Pojawi się okno z wynikami, zawierające liczbę komórek oraz nowy obraz z odpowiadającymi im obrysami policzonych komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieje szereg źródeł, z których można pozyskiwać MSC lub ECFC, w tym szpik kostny, tkanka tłuszczowa, krew pępowinowa itp.
Konieczne jest pozyskanie obu typów progenitorów z tego samego źródła, aby bezpośrednio porównać udział różnych typów komórek w procesach takich jak regeneracja tkanek i naczyń lub ich wkład w progresję nowotworu.
Łatwość izolacji i późniejszego badania autologicznych par ECFC i MSC pochodzących od tego samego dawcy sprawia, że metoda ta jes...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów o charakterze finansowym.
Podziękowania
Autorzy dziękują Katharinie Schallmoser za udostępnienie pHPL, Evie Rohde i Nicole Hofmann za pomocne uwagi do manuskryptu, Danieli Thaler i Margarethe Fr hwirth za pomoc techniczną, Monice Farrell za redakcję językową oraz Uwe Langowi, Margit Holzapfel i Sandrze Eppich z Zakładu Położnictwa za udostępnienie pępowin.
Praca ta została wsparta przez Austriacki Fundusz Badań (FWF, grant N211-NAN dla DS), Austriacką Agencję Promocji Badań (FFG, grant N200 dla DS) oraz Fundację Badań nad Dorosłymi Komórkami Macierzystymi (A.R.). A.R. jest stypendystą programu doktoranckiego z zakresu medycyny molekularnej na Uniwersytecie Medycznym w Grazu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| $\alpha$-modyfikowane MEM | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamina | Sigma-Aldrich | ||
| Penicylina/streptomycyna | Sigma-Aldrich | ||
| Medycyna oparta na dowodach (EBM) | Lonza Inc. | ||
| Pojedyncze pomiary cytokin | Lonza Inc. | ||
| 75 cm2 kolby | Corning | ||
| 150 cm2 płytki | Corning | ||
| Skrobacz do komórek | Corning | ||
| Trypsyna/EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| Przeciwciała monoklonalne | BD Biosciences | ||
| PBS | |||
| probówki 50 ml | Falcon BD | ||
| filtr 20 500 ml μrozmiar porów m | EMD Millipore | ||
| Heparyna bez konserwantów | Biochrom AG |
Bibliografia
- Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
- Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
- Strunk, D. Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy. Transfusion. 45, 315-326 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
