Komora pomiarowa analitycznej ultrawirówki (AUC) mieści próbkę oraz bufor referencyjny i podczas eksperymentów jest poddawana działaniu wysokiej próżni oraz prędkościom rotacji do 60 000 rpm. Niniejszy film zaprezentuje rygorystyczną dbałość o szczegóły, która jest niezbędna podczas montażu, napełniania i centrowania tego kluczowego elementu eksperymentu AUC.
Artykuł metodologiczny
Montaż, napełnianie i centrowanie celi pomiarowej analitycznej ultrawirówki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analityczna ultracentryfuga (AUC) jest potężnym narzędziem biofizycznym, które umożliwia rejestrowanie profili sedymentacji makrocząsteczek podczas wirowania z wysoką prędkością. Przy odpowiednim zaplanowaniu i wykonaniu, eksperyment AUC z zakresu prędkości sedymentacji lub równowagi sedymentacyjnej może dostarczyć wielu informacji o białku w odniesieniu do jego rozmiaru i kształtu, czystości próbki, współczynnika sedymentacji, stanów oligomeryzacji oraz oddziaływań białko-białko.
Technika ta wymaga jednak ścisłego przestrzegania rygorów technicznych. Ogniwa z próbkami zawierają podzielony na sektory element środkowy, umieszczony pomiędzy dwoma zestawami okiennymi. Są one uszczelniane z momentem dokręcania wynoszącym około 120-140 in/lbs. Bufor referencyjny oraz próbka są wprowadzane do sektorów elementu środkowego, a następnie po uszczelnieniu ogniwa są precyzyjnie montowane w rotorze tytanowym w taki sposób, aby systemy detekcji optycznej skanowały zarówno próbkę, jak i bufor referencyjny po tej samej linii środkowej ścieżki radialnej przez każdy sektor elementu środkowego, podczas rotacji z prędkością do 60 000 rpm w warunkach bardzo wysokiej próżni
Prawidłowy montaż celi pomiarowej jest nie tylko krytyczny, ale jej komponenty są bardzo kosztowne i wymagają odpowiedniej pielęgnacji, aby zapewnić ich optymalny stan techniczny i zapobiec wyciekom oraz uszkodzeniom podczas eksperymentów. Okna należy obsługiwać ostrożnie, ponieważ nawet najmniejsza rysa lub pęknięcie może doprowadzić do rozbicia celi w wirówce. Styk między elementem centralnym a oknami musi być jak najściślejszy; oznacza to, że po przyłożeniu momentu obrotowego nie powinny być widoczne pierścienie Newtona. Kurz, kłaczki, rysy i tłuszcze na oknach lub elemencie centralnym pogarszają ten kontakt i mogą bardzo łatwo doprowadzić do wycieku roztworów z jednego sektora do drugiego lub całkowitego wycieku z elementu centralnego. Prowadzi to nie tylko do utraty cennych próbek, ale wycieki roztworów podczas eksperymentu spowodują niezrównoważenie ciśnienia w celi, co często skutkuje pęknięciem okien i elementów centralnych. Ponadto uszczelki korków i zaślepki obudowy muszą być szczelnie zamontowane, aby zapobiec wysysaniu roztworów z sektora elementu centralnego przez otwory załadowcze przez wysoką próżnię w komorze wirówki. Podkładki pod okna i uszczelki muszą być wolne od pęknięć i szczelin, które mogłyby spowodować przemieszczenie elementów, prowadząc do rozbicia okien.
W tym filmie zaprezentowano procedury montażu komórki z próbką, dokręcania, ładowania oraz wyrównywania rotora, aby pomóc zminimalizować uszkodzenia komponentów, wycieki roztworu i pęknięcia podczas przeprowadzania eksperymentu AUC.
Protokół
Montaż celi próbnej i moment obrotowy
- Konstrukcję ogniwa z próbką rozpoczynamy od złożenia dwóch zestawów okiennych.
Włóż uszczelkę okna do uchwytu okna. Umieść wkładkę okna (czasami nazywaną podkładką okna) wewnątrz uchwytu okna w taki sposób, aby otwór wkładki znajdował się naprzeciwko wpustu uchwytu. Pod lekkim kątem włóż okno do uchwytu, dopasowując znak rylcowy na oknie do wpustu uchwytu okna. Delikatnie dociśnij krawędzie po obu stronach okna. - Aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie i dokładny moment dokręcenia ogniwa z próbką, lekko smarujemy uszczelkę obudowy oraz pierścieńy śruby smarem Spinkote. Rozprowadź bardzo niewielką ilość Spinkote między kciukiem a palcem wskazującym. Pokryj gwinty pierścienia śruby cienką, niewidoczną warstwą Spinkote. W ten sam sposób pokryj uszczelkę obudowy. Wytrzyj nadmiar widocznego smaru.
- Montaż ogniwa z próbką rozpocznij od wsunięcia jednego zestawu okiennego (oknem skierowanym do góry, w Twoją stronę) do obudowy ogniwa, dopasowując wpust do klucza obudowy. Dopasuj wpust elementu środkowego do klucza obudowy i pozwól mu delikatnie opaść na zestaw okienny wewnątrz ogniwa.
- Nigdy nie używaj żadnych narzędzi do wpychania elementu środkowego do obudowy ogniwa. Może to spowodować trwałe uszkodzenie CP, co doprowadzi do wycieków podczas eksperymentów. Obróć drugi zestaw okienny tak, aby okno było skierowane w stronę elementu środkowego (od Ciebie), dopasuj wpust do klucza obudowy i wsuń go na element środkowy. Na górze umieść uszczelkę obudowy, a następnie pierścień śruby tak, aby napis „Out” był widoczny. Używając palców i narzędzia do wyrównywania, ręcznie dokręć pierścień śruby.
Jeśli CP nie wsuwa się łatwo do tulei obudowy, najpierw go wyrównaj, a następnie umieść na nim drugi zestaw okienny. Wywierając delikatny nacisk w dół na zestaw okienny, wsuń oba elementy do obudowy ogniwa jednocześnie. W ten sposób unikamy bezpośredniego nacisku na CP.
To dobry moment, aby sprawdzić, czy wewnątrz ogniwa nie ma kurzu, kłaczków i odcisków palców. Zauważysz również pierścienie Newtona, które wskazują, że między CP a oknami wciąż znajduje się powietrze. Znikną one po zastosowaniu momentu dokręcania. - Przy założonym pierścieniu śruby z widocznym napisem „out”, wsuń ogniwo z próbką całkowicie do zacisku momentowego statywu pomiarowego. Przytrzymaj ogniwo w miejscu, wywierając stały nacisk na uchwyt statywu. Jednym ciągłym ruchem dokręć pierścień śruby do wartości między 120-140 in-lbs. W przypadku użycia regulowanego klucza dynamometrycznego z mikrometem, ustaw go na wartość między 120-140 in/lbs i dokręcaj pierścień śruby, aż klucz „kliknie”, co oznacza osiągnięcie ustawionego momentu. Zwolnij uchwyt statywu i ostrożnie wyjmij ogniwo z próbką, nie dotykając okien.
Załadunek i uszczelnianie celi z próbką
- W eksperymentach z prędkością sedymentacji rutynowo wprowadzamy objętość 400ul do każdego sektora elementu centralnego o średnicy 12mm, używając pipety 200ul. Należy ustawić kuwetę z otworami do ładowania skierowanymi do góry, tak aby na pierścieniu z nakrętką widoczny był napis „out”. Wsunąć końcówkę pipety do połowy wysokości do LEWEGO sektora elementu centralnego przez otwory do ładowania i powoli dozować 200ul roztworu referencyjnego. Powtórzyć czynność raz, aby uzyskać łącznie 400ul. Korzystając z tej samej końcówki pipety i tej samej techniki, ostrożnie i powoli wypełnić PRAWY sektor elementu centralnego 400ul roztworu próbki.
W eksperymentach z równowagą sedymentacji stosuje się objętości 150-180 ul, jednak należy zachować tę samą ostrożność i technikę.
Kluczowe jest jak najdokładniejsze dopasowanie objętości roztworów referencyjnego i próbki. Mocne osadzenie końcówki na pipecie, powolne ładowanie i dozowanie roztworów, unikanie wprowadzania pęcherzyków powietrza oraz użycie tej samej końcówki pipety dla obu roztworów pomagają w utrzymaniu jak największej równości objętości. - Uszczelnić kuwetę, umieszczając 2 nowe czerwone uszczelki nasadek obudowy ściśle w każdym otworze do ładowania, upewniając się, że znajdują się one pomiędzy elementem centralnym a aluminiową obudową. Przykryć każdą z nich nasadką obudowy. Dokręcić ręcznie małym śrubokrętem płaskim.
Ustawianie próbki komórkowej w rotorze
- Przed załadowaniem rotora należy upewnić się, że przeciwwaga jest lżejsza od komórki z próbką w przeciwległej pozycji o nie więcej niż .5g, na wypadek wycieku z tej komórki. Rozpocząć należy od ustawienia wagi na zero. Najpierw zważyć komórkę z próbką, która znajdzie się w pozycji przeciwległej do przeciwwagi. Tarować wagę, aby odjąć masę komórki z próbką, a następnie zważyć przeciwwagę. Dodać lub odjąć obciążenie z otworu montażowego przeciwwagi. Należy upewnić się, że obciążniki nie wystają ponad górną krawędź. Zważyć ponownie, aby upewnić się, że końcowa masa przeciwwagi jest lżejsza od przeciwległej komórki z próbką o nie więcej niż .5g.
- W przypadku rotora 4-miejscowego umieścić przeciwwagę w pozycji 4 tak, aby biała strzałka była widoczna i wskazywała kierunek siły odśrodkowej. Należy upewnić się, że przeciwwaga jest całkowicie osadzona wewnątrz rotora. Delikatnie dokręcić śrubę blokującą, znajdującą się na górze przeciwwagi naprzeciwko białej strzałki, aż przeciwwaga zostanie stabilnie zamocowana, ale wciąż będzie można ją wyrównać. Umieścić zrównoważoną komórkę z próbką tak, aby zaślepki obudowy były skierowane w stronę centrum rotora, a napis „out” na pierścieniu śruby był widoczny.
- Patrząc od spodu rotora, należy za pomocą narzędzia do wyrównywania dopasować wewnętrzną kreskę pomocniczą (kreskę najbliższą centrum rotora) do kreski pomocniczej na przeciwwadze. Dokręcić śrubę blokującą, aby unieruchomić wyrównaną przeciwwagę. W ten sam sposób wyrównać kreskę pomocniczą komórki z próbką z wewnętrzną kreską pomocniczą w pozycji 2 na rotorze.
Więcej informacji można znaleźć na stronie https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx
Dyskusja
Prawidłowy montaż komórki, wprowadzenie próbki i ustawienie komórki w rotorze są kluczowe dla uzyskania wysokiej jakości eksperymentów AUC. Ma to szczególne znaczenie w przypadku doświadczeń wymagających bardzo szczegółowej analizy pozyskanych danych dotyczących profili sedymentacji makrocząsteczek, na przykład podczas badania oddziaływań białkowych i wyznaczania ilości śladowych agregatów. Często to właśnie jakość przygotowania eksperymentalnego ogranicza dokładność i precyzję wyników badania AUC. Szczegółowe informacje na temat praktycznego projektowania i dalszego przeprowadzania eksperymentów AUC znajdują się w referencjach 1 – 3. Warsztaty obejmujące praktyczne przygotowanie, teorię i analizę danych eksperymentów AUC odbywają się dwa razy w roku w naszym laboratorium w National Institutes of Health [4].
Podziękowania
Podziękowania za wsparcie badawcze kierujemy do Intramural Research Program organizacji NIBIB, NIH.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4-miejscowy analityczny rotor Ti | Beckman Coulter Inc. | 361964 | |
| Zestaw statywu momentowego | Beckman Coulter Inc. | 361318 | |
| Narzędzie do wyrównywania komórki | Beckman Coulter Inc. | 362340 | |
| Smar Spinkote | Beckman Coulter Inc. | 306812 | |
| Przeciwwaga | Beckman Coulter Inc. | 360219 | |
| Zestaw obudowy komórki | Beckman Coulter Inc. | 334602 | |
| Uszczelka okna | Beckman Coulter Inc. | 327021 | |
| Wkładka okna | Beckman Coulter Inc. | 362329 | |
| Okno, szafirowe | Beckman Coulter Inc. | 307177 | |
| Okno, kwarcowe | Beckman Coulter Inc. | 301730 | |
| Uchwyt okna | Beckman Coulter Inc. | 305037 | |
| 12mm dwusektorowy element środkowy z Epon | Beckman Coulter Inc. | 306493 | |
| Uszczelki korka komórki | Beckman Coulter Inc. | 327022 | |
| Korek obudowy komórki | Beckman Coulter Inc. | 362327 |
Bibliografia
- Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
- Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
- analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
- Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.
Przedruki i uprawnienia
