Montaż, ładowanie i wyrównywanie analitycznej celi próbki ultrawirówki

Podsumowanie

Komórka próbki analitycznej ultrawirówki (AUC) przechowuje próbkę i bufor referencyjny oraz podczas eksperymentów i jest wystawiona na działanie wysokiej próżni i prędkości wirnika do 60 000 obr./min. Ten film zademonstruje rygorystyczną dbałość o szczegóły niezbędną do montażu, obciążenia i wyrównania tego bardzo ważnego elementu eksperymentu AUC.

Streszczenie

Ultrawirówka analityczna (AUC) to potężne narzędzie biofizyczne, które pozwala nam rejestrować profile sedymentacji makromolekularnej podczas wirowania z dużą prędkością. Prawidłowo zaplanowany i przeprowadzony eksperyment prędkości sedymentacji AUC lub równowagi sedymentacji może ujawnić wiele informacji o białku w odniesieniu do wielkości i kształtu, czystości próbki, współczynnika sedymentacji, stanów oligomeryzacji i interakcji białko-białko.

Ta technika wymaga jednak rygorystycznego poziomu uwagi technicznej. Komórki próbki zawierają sektorowy element środkowy umieszczony między dwoma zespołami okien. Są one uszczelnione ciśnieniem momentu obrotowego około 120-140 cali/funtów. Bufor referencyjny i próbka są ładowane do sektorów centralnych, a następnie po uszczelnieniu komórki są precyzyjnie ustawiane w tytanowym wirniku, dzięki czemu optyczne systemy detekcji skanują zarówno próbkę, jak i bufor referencyjny w tej samej ścieżce promieniowej linii środkowej przez każdy sektor centralny, obracając się z prędkością do 60 000 obr./min i w bardzo wysokiej próżni

Nie tylko prawidłowe złożenie celi próbki jest krytyczne, elementy celi próbki są bardzo drogie i muszą być odpowiednio pielęgnowane, aby zapewnić optymalny stan pracy, aby uniknąć wycieków i pęknięć podczas eksperymentów. Z oknami należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ nawet najmniejsze pęknięcie lub zadrapanie może doprowadzić do pęknięcia wirówki. Kontakt między elementem centralnym a oknami musi być tak ścisły, jak to możliwe; tj. po przyłożeniu nacisku momentu obrotowego nie powinny być widoczne żadne pierścienie Newtona. Kurz, kłaczki, zadrapania i oleje na oknach lub elemencie centralnym zagrażają temu kontaktowi i mogą bardzo łatwo doprowadzić do wycieku roztworów z jednego sektora do drugiego lub wycieku z centralnej części razem. Nie tylko traci się cenne próbki, ale wyciek roztworów podczas eksperymentu spowoduje brak równowagi ciśnienia w komórce, co często prowadzi do pęknięć okien i elementów centralnych. Ponadto uszczelki zaślepkowe i zaślepki obudowy muszą być bezpiecznie zamocowane, aby zapobiec wyciąganiu roztworów z sektora środkowego elementu przez otwory załadowcze przez wysoką próżnię w komorze wirówki. Wykładziny okienne i uszczelki muszą być wolne od pęknięć i pęknięć, które mogłyby powodować ruch skutkujący pękniętymi oknami.

Ten film pokaże nasze procedury montażu celi próbnej, momentu obrotowego, obciążenia i wyrównania wirnika, aby zminimalizować uszkodzenia komponentów, wycieki roztworu i pęknięcia podczas doskonałego eksperymentu AUC.

Protokół

Przykładowy montaż ogniwa i moment obrotowy

1. Budowę celi próbnej rozpoczynamy od złożenia 2 zestawów okiennych.
   Umieść uszczelkę okienną w uchwycie okiennym. Umieść wykładzinę okienną (lub czasami nazywaną poduszką okienną) wewnątrz uchwytu okiennego tak, aby otwór wykładziny znajdował się naprzeciwko rowka wpustowego uchwytu. Pod niewielkim kątem umieść okienko w uchwycie, wyrównując rysę na okienku z rowkiem wpustu uchwytu okiennego. Delikatnie dociśnij na samych krawędziach po obu stronach okna.
2. Aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie i dokładny moment obrotowy celi próbki, delikatnie pokrywamy uszczelkę obudowy i pierścień śrubowy smarem Spinkote. Rozprowadź bardzo małą ilość Spinkote między kciukiem a palcem wskazującym. Pokryj gwinty pierścieni śrubowych cienką, niewidoczną warstwą Spinkote. Podobnie pokryj uszczelkę obudowy. Zetrzyj wszelkie widoczne smary.
3. Montaż celi próbki należy rozpocząć od wsunięcia jednego zespołu okna, z okienkiem skierowanym do góry, do obudowy kuwe, wyrównując rowek wpustowy z wpustem obudowy. Dopasuj rowek wpustowy centralnej części do klucza obudowy i pozwól mu delikatnie opaść na zespół okienny wewnątrz komórki.
4. Nigdy nie używaj żadnych narzędzi do wciskania centralnego elementu w obudowę ogniwa. Może to spowodować trwałe uszkodzenie CP, powodując wyciek podczas eksperymentów. Obróć drugi zespół okna tak, aby okno było skierowane w stronę elementu centralnego, od siebie, wyrównaj rowek wpustowy z kluczem do obudowy i przesuń go w dół na centralną część. Umieść uszczelkę obudowy na górze, a następnie pierścień śrubowy, aby słowo "Out" było widoczne. Palcami i narzędziem do wyrównywania ręcznie dokręć pierścień.
   Jeśli CP nie wsuwa się łatwo w lufę obudowy, najpierw go wyrównaj, a następnie umieść na nim drugi zespół okienka. Wywierając delikatny nacisk w dół na zespół okna, wsuń oba elementy do obudowy ogniwa w tym samym czasie. W ten sposób unikamy bezpośredniego naciskania na CP.
   Teraz jest dobry moment, aby zajrzeć do wnętrza komórki w poszukiwaniu kurzu, kłaczków i odcisków palców. Zauważysz również pierścienie Newtona, które wskazują, że między CP a oknami nadal jest powietrze. Znikną one po przyłożeniu momentu obrotowego.
5. Trzymając pierścień do góry i widoczne słowo "na zewnątrz", umieść celę próbki całkowicie w tulei zaciskowej ogniwa stojaka momentu obrotowego. Przytrzymaj ogniwo na miejscu, wywierając stały nacisk na uchwyt stojaka dynamometrycznego. Jednym ciągłym ruchem dokręć pierścień śrubowy momentem 120-140 in-lbs. Jeśli używasz regulowanego klucza dynamometrycznego z mikrometrem, ustaw go na 120-140 cali/funtów i dokręć pierścień śrubowy, aż klucz "kliknie", wskazując osiągnięcie ustawionego momentu obrotowego. Zwolnij uchwyt stojaka dynamometrycznego i ostrożnie wyjmij sample celę, nie dotykając okien.

Ładowanie i uszczelnianie próbki

6. W przypadku eksperymentów z prędkością sedymentacji rutynowo ładujemy objętość 400 ul do każdego sektora elementu centralnego o średnicy 12 mm za pomocą pipety 200 ul. Umieść celę próbki tak, aby otwory załadowcze znajdowały się na górze, a na pierścieniu śrubowym widniał napis "out". Wsuń końcówkę pipety do połowy w dół do LEWEGO środkowego sektora przez otwory załadowcze i powoli dozuj 200 ul roztworu referencyjnego. Powtórz raz, aby uzyskać łącznie 400ul. Używając tej samej końcówki pipety i tej samej techniki, ostrożnie i powoli napełnij PRAWY sektor centralny 400ul roztworu próbki.
   Objętości 150-180 ul są używane do eksperymentów równowagi sedymentacji, ale należy przestrzegać tej samej ostrożności i techniki.
   
   Konieczne jest jak najdokładniejsze dopasowanie objętości roztworów referencyjnych i próbek. Mocne dopasowanie końcówki pipety do pipety, powolne ładowanie i dozowanie roztworów, unikanie ładowania pęcherzyków powietrza i używanie tej samej końcówki pipety do obu roztworów pomaga w utrzymaniu jak najbardziej równych objętości.
7. Uszczelnij ogniwo, umieszczając 2 nowe czerwone uszczelki zaślepki obudowy ściśle w każdym otworze załadunkowym, upewniając się, że są one umieszczone między środkową częścią a aluminiową obudową. Przykryj każdy z nich zatyczką obudowy. Dokręć ręcznie małym płaskim śrubokrętem.

Wyrównanie komórek próbki w wirniku

8. Przed załadowaniem wirnika upewnij się, że przeciwwaga nie jest więcej niż .5 g LŻEJSZA niż cela próbki w przeciwnej pozycji w przypadku, gdy ta próbka komórka przecieka. Zacznij od zerowego salda. Najpierw zważ celę próbki, która będzie znajdować się w pozycji przeciwnej do CB. Wytaruj wagę, aby odjąć masę celi próbki, a następnie zważyć CB. Dodaj lub odejmij ciężar od otworu mocującego przeciwwagi. Upewnij się, że ciężarki nie wystają z góry. Zważ ponownie, aby upewnić się, że końcowa masa przeciwwagi jest lżejsza o 0,5 g niż przeciwległa kuweta z próbką.
9. Za pomocą 4-miejscowego wirnika umieść przeciwwagę w pozycji 4 tak, aby biała strzałka była widoczna i skierowana w kierunku siły odśrodkowej. Upewnij się, że jest całkowicie zanurzony w wirniku. Delikatnie dokręć ustalającą, znajdującą się na górze przeciwwagi po drugiej stronie białej strzałki, aż przeciwwaga będzie mocno osadzona, ale nadal będzie można ją wyrównać. Umieść zrównoważoną celę pomiarową tak, aby zaślepki obudowy były skierowane do środka wirnika, a na pierścieniu śrubowym widoczny był napis "out".
10. Patrząc od spodu wirnika, wyrównaj wewnętrzny znacznik rysowania (znak znajdujący się najbliżej środka wirnika) ze znakiem rysowania na przeciwwadze za pomocą narzędzia do wyrównywania. Dokręć ustalającą, aby zablokować wyrównaną przeciwwagę na miejscu. W ten sam sposób wyrównaj rysę komórki próbki ze znacznikiem rysy wewnętrznej w pozycji 2 na wirniku.

Więcej informacji można znaleźć w https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx

Dyskusja

Prawidłowe złożenie komórek, wprowadzenie próbki i wyrównanie komórek w wirniku ma kluczowe znaczenie dla wysokiej jakości eksperymentów AUC. Dotyczy to w szczególności eksperymentów, które wymagają bardzo szczegółowej analizy uzyskanych danych na temat makromolekularnych profili sedymentacji, na przykład podczas badania interakcji białek i określania śladowych ilości zagregowanych. Często jakość konfiguracji eksperymentalnej jest ograniczona dla dokładności i precyzji wyników badania AUC. Szczegółowe informacje na temat praktycznego projektowania i dalszego przeprowadzania eksperymentów AUC znajdują się w Piśmiennictwie 1 – 3. Dwa razy w roku w naszym laboratorium w National Institutes of Health odbywają się warsztaty obejmujące praktyczną konfigurację, teorię i analizę danych z eksperymentów AUC [4].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4-miejscowy rotor analityczny Ti	Beckman Coulter Inc.
Zespół stojaka dynamometrycznego	Beckman Coulter Inc.
Narzędzie do wyrównywania komórek	Beckman Coulter Inc.	362340
Smar Spinkote	Beckman Coulter Inc.
Przeciwwaga	Beckman Coulter Inc.
Zestaw obudów komór	Beckman Coulter Inc.
Uszczelka okienna	Beckman Coulter Inc.
Wykładzina okienna	Beckman Coulter Inc.
Okno, szafir	Beckman Coulter Inc.
307177 Okno, kwarcowe	Beckman Coulter Inc.	301730
Uchwyt okienny	Beckman Coulter Inc.
12 mm dwusektorowy element centralny Epon	Beckman Coulter Inc.
Uszczelki korka komory	Beckman Coulter Inc.
Zaślepka do obudowy ogniwa	Beckman Coulter Inc.