Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Podsumowanie

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Streszczenie

Mikroskopia z wykorzystaniem transferu energii między fluoroforami (FRET) jest powszechnie stosowana do badania struktury i dynamiki cząsteczek o znaczeniu biologicznym, takich jak kwasy nukleinowe i białka. Pomiary FRET na pojedynczych cząsteczkach (sm-FRET) unieruchomionych cząsteczek umożliwiają długotrwałe obserwacje układu – skutecznie aż do czasu fotowybielenia obu barwników – co pozwala na uzyskanie przebiegów czasowych informujących o dynamice biomolekularnej w szerokim zakresie skal czasowych, od milisekund do minut. Aby ułatwić pozyskanie dużej liczby przebiegów do analiz statystycznych, proces ten musi zostać zautomatyzowany, a środowisko próbki powinno być ściśle kontrolowane przez cały czas pomiaru (~12 godzin). Jest to realizowane przy użyciu zautomatyzowanego skanującego mikroskopu konfokalnego, który pozwala na badanie tysięcy pojedynczych cząsteczek w ciągu nocy, oraz komórki mikroprzepływowej, która umożliwia kontrolowaną wymianę buforu z ograniczoną zawartością tlenu i utrzymuje stałą temperaturę przez cały okres pomiarowy. W niniejszej pracy pokazujemy, jak złożyć urządzenie mikroprzepływowe i jak aktywować jego powierzchnię w celu unieruchomienia DNA. Następnie wyjaśniamy, jak przygotować bufor, aby zmaksymalizować fotostabilność i czas życia fluoroforów. Na koniec przedstawiamy kroki niezbędne do przygotowania układu do zautomatyzowanego pozyskiwania rozdzielczych w czasie przebiegów sm-FRET dla cząsteczek DNA.

Protokół

1 - Montaż komory mikrofluidycznej

Komórka mikrofluidyczna jest wykonana poprzez połączenie ustrukturyzowanego dysku z polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 2 mm ze świeżo oczyszczonym szkiełkiem podstawowym z kwarcu. Dysk PDMS zawiera cztery prostokątne komory o pojemności 30 μl, do których dostęp zapewniają elastyczne kapilary wlotowe i wylotowe, podłączone odpowiednio do zbiornika z buforem i pompy strzykawkowej, w celu kontrolowanego przepływu buforu. Komórka przepływowa jest podparta od tyłu szklanym okienkiem i umieszczona w specjalnie wykonanym uchwycie komórki zawierającym chłodzony wodą element termoelektryczny do regulacji temperatury.

1. Aby przygotować wzorowany dysk z PDMS, wymieszać 10 części bazy elastomeru silikonowego z 1 częścią utwardzacza, dokładnie wymieszać i odgazować przez 1 godzinę w próżni.
2. Ostrożnie wylać mieszaninę elastomeru na formę komórki mikrofluidycznej. W naszym przypadku jest to 1-calowy wafelek krzemowy z czterema paskami (1x10⁴ x 1x10³ x 300 μm) wykonanymi z negatywowego fotorezystu. Pozostawić do utwardzenia na płycie grzejnej w temperaturze 70° C przez dwie godziny.
3. Ostrożnie oddzielić utwardzony dysk PDMS od formy za pomocą żyletki. Przytwierdzić dysk do 1-calowego okna szklanego (zawierającego 8 nawierconych otworów o średnicy 2 mm na obu końcach kanałów) poprzez utlenianie obu powierzchni plazmą przez 30 sekund. Przytwierdzić okna szklane do płaskiej strony dysku PDMS (strony nie zawierającej kanałów).
4. Wprowadzić 2-calową giętką kapilarę z topionego kwarcu przez każdy otwór w oknie szklanym, aż dotrze ona do kanału. Proces ten można ułatwić, wprowadzając najpierw igłę, a następnie za nią kapilarę. Uszczelnić otwory w oknie szklanym za pomocą szybko utwardzającej się silikonowej masy odlewniczej, takiej jak Kwik-Cast.
5. Przepłukać kanały etanolem i wodą, a następnie aktywować plazmą komórkę wraz ze świeżo oczyszczonym, 1-calowym okrągłym szkiełkiem kwarcowym przez 30 sekund. Sugerujemy oczyszczenie szkiełka za pomocą roztworu piranha*. Przytwierdzić szkiełko do strony komórki zawierającej kanały, uszczelniając komory.
6. Pozostawić zmontowaną komórkę do utwardzenia przez noc w temperaturze pokojowej.

* Roztwór piranha to mieszanina H₂O₂ i H₂SO₄ w proporcjach 1:2,5. Aby oczyścić szkiełka nakrywki, należy zanurzyć je w roztworze piranha w temperaturze 90° C na 20 min.

2 - Aktywacja powierzchni w celu immobilizacji cząsteczek

W badaniach nad kwasami nukleinowymi najprostszy schemat immobilizacji powierzchniowej polega na uprzednim pokryciu szklanego lub kwarcowego szkiełka podstawowego biotynilowaną albuminą surowicy bydlęcej (BSA), a następnie streptawidyną. Pozwala to na immobilizację biotynilowanej próbki z wysoką swoistością przez wiele dni w temperaturze pokojowej.

1. Podłączyć elastyczne dreny do kapilar, aby umożliwić łatwe wstrzykiwanie buforu za pomocą strzykawki i igły.
2. Wstrzyknąć do kanału roztwór biotynilowanego BSA o stężeniu 0.1 mg/ml w buforze A (10 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, przefiltrowanym przez filtry 0.02 μm) i inkubować przez co najmniej 30 min.
3. Przepłukać kanał 300-500 μl buforu A w celu usunięcia wolnego biotynilowanego BSA, uważając, aby wewnątrz komory nie zatrzymały się pęcherzyki powietrza.
4. Wstrzyknąć roztwór streptawidyny o stężeniu 0.1 mg/ml w buforze A i inkubować przez 15 min. Następnie powtórzyć krok 3.
5. Przepuścić roztwór biotynilowanej próbki o stężeniu 3-5 pM. Wykonać skanowanie powierzchni, aby sprawdzić stopień pokrycia cząsteczkami fluorescencyjnymi. W razie potrzeby zwiększyć stężenie próbki, aby uzyskać lepsze pokrycie. Inkubować przez 10 min i powtórzyć krok 3.

Komórka mikroprzepływowa jest zamontowana na zmotoryzowanym stole x-y, który umożliwia ruchy grube (do 25 mm) za pomocą silników prądu stałego z kodowaniem optycznym oraz ruchy precyzyjne (1 nm) za pomocą dwóch piezoaktuatorów w pętli zamkniętej (Physik Instrumente model M-014 lub podobny). Można to wykonać zarówno przed, jak i po aktywacji powierzchni w celu immobilizacji próbki.

3 - Przygotowanie buforu do obrazowania (IB)

IB składa się z enzymatycznego układu usuwającego tlen oraz wygaszacza tripletów, takiego jak Trolox. Ponieważ IB jest stale przepłukiwany przez całą noc, należy wcześniej przygotować co najmniej 10 ml.

1. Przygotować 10 ml 0,8% w/v D-glukozy, co najmniej 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 oraz 50 mM NaCl w wodzie dejonizowanej. Wyższe stężenie buforu jest istotne z dwóch powodów: rozpuszczanie Troloxu zakwasi roztwór, a reakcja enzymatyczna z czasem również obniży pH roztworu. Ponieważ roztwór ten ma długą trwałość, można go przechowywać jako roztwór zapasowy.
2. Rozpuścić 5 mg Troloxu w buforze przygotowanym w kroku 1 poprzez mieszanie w wortexie przez kilka minut, a następnie wstrząsanie przez >10 min. Trolox nie jest bardzo rozpuszczalny w wodzie przy pH > 7, dlatego nie należy przyspieszać tego etapu. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i pozostawić do odgazowania w próżni przez 10 minut.
3. Przygotować enzymatyczny roztwór „gloxy”, mieszając 60 μl wody, 20 μl buforu A 5X, 20 μl katalazy, 1 mg oksydazy glukozowej oraz 100 μl BSA w stężeniu 10 mg/ml. Przefiltrować roztwór za pomocą wirówkowego filtra 0,22 μm.
4. Delikatnie zmieszać bufor z kroku 2 z roztworem „gloxy” z kroku 3, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
5. Przepuścić IB przez kanał ze stałą prędkością 5 μl/min, używając mechanicznej pompy strzykawkowej do kontrolowania szybkości przepływu. Przeprowadzać gaz argon do zbiornika IB, aby zapobiec ponownemu rozpuszczaniu się tlenu atmosferycznego w buforze.

Skanowanie powierzchni, lokalizacja cząsteczek oraz rejestracja śladów intensywności pojedynczych cząsteczek są sterowane programem LabView, który umożliwia zautomatyzowany pobór danych¹. Program skanuje obszary o wymiarach 20x20 μm² z rozdzielczością 0,2 μm i prędkością 0,1 μm/ms. Dane są natychmiast przetwarzane w celu wyznaczenia lokalizacji ważonych intensywnością dla wszystkich pikseli powyżej poziomu tła. Po zlokalizowaniu unieruchomionych cząsteczek są one pojedynczo przesuwane do objętości konfokalnej, a intensywności fluoroforu donora i akceptora są rejestrowane w funkcji czasu, aż do momentu fotowyblaknięcia obu fluoroforów. Następnie stolik zostaje zaprogramowany tak, aby przenieść się do nowego punktu początkowego oddalonego o 100 μm, a proces skanowania zostaje powtórzony.

4 - Reprezentatywne wyniki

Poniżej znajdują się obrazy przedstawiające zmontowaną komórkę mikroprzepływową przed aktywacją powierzchni oraz po zamontowaniu na mikroskopie, gotową do immobilizacji cząsteczek. Jeśli kanał zostanie pomyślnie aktywowany, skany powierzchni powinny być zbliżone do przedstawionych poniżej skanów, ukazujących emisję barwnika donora (zielony) i akceptora (czerwony) po bezpośrednim wzbudzeniu donora. Cząsteczki te są wprowadzane pojedynczo do objętości sondowania, a fluorescencja jest rejestrowana w czasie, aż do fotowyblaknięcia obu barwników, co pokazano na śladach pojedynczych cząsteczek. Z takich śladów można wyznaczyć wydajność FRET, która dostarcza informacji o chwilowym oddaleniu donora od akceptora, co z kolei jest wykorzystywane do badania struktury i dynamiki cząsteczek o znaczeniu biologicznym.

Rycina 1: Komórka mikrofluidyczna z czterema kanałami, z których każdy posiada kapilary wlotowe i wylotowe. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.

Rysunek 2: Komórka zamocowana na mikroskopie, gotowa do pomiarów. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2.

Rysunek 3: Układ do pomiarów sm-FRET. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 3.

Ryciny 4 i 5: Kanał czerwony i zielony skanu powierzchni unieruchomionych cząsteczek FRET wzbudzonych zielonym laserem. Kliknij, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 4 lub ryciny 5.

Rysunki 6, 7, 8 i 9: Trajektorie intensywności fluoroforów donora (zielone) i akceptora (czerwone) przyłączonych do cząsteczki DNA w odległościach 8, 10, 16 i 18 par zasad. Kliknij, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 6, rysunku 7, rysunku 8 lub rysunku 9.

Dyskusja

Chociaż powyższy protokół został zoptymalizowany dla naszego konkretnego układu oraz dla specyficznego doboru barwników (TMR i ATTO647N), nie jest on jedyną sprawdzoną metodą. Niedawno wykazano, że alternatywny system usuwania tlenu, składający się z kwasu protokatechowego (PCA)/protokatechuranu-3,4-dioksygenazy (PCD), zwiększa fotostabilność niektórych barwników⁴. Podobnie, zamiast Troloxu można zastosować inne wygaszacze stanu tripletowego, takie jak β-merkaptoetanol (BME), choć mogą one nie hamować długotrwałego migotania niektórych barwników, w szczególności Cy5⁵.

Choć unieruchomienie poprzez biotynę-streptawidynę-biotynilowaną albuminę surowicy bydlęcej (BSA) jest preferowaną metodą w badaniach kwasów nukleinowych, powierzchnia powleczona glikolem polietylenowym (PEG) jest bardziej odpowiednia do badań białek, ponieważ zapobiega niespecyficznej adhezji¹. Dodatkowo w przypadkach, gdy cząsteczka biologiczna może ulegać oddziaływaniom powierzchniowym, można zastosować pęcherzyki o rozmiarze poniżej limitu dyfrakcyjnego do enkapsulacji badanej biomolekuły⁶.

W niniejszym artykule wykorzystaliśmy układ konfokalny wyposażony w krzemowe fotodiody lawinowe do rejestracji przebiegów intensywności fluorescencji. Protokół ten sprawdza się równie dobrze w mikroskopach fluorescencyjnych z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) wyposażonych w kamery CCD. Niezależnie od zastosowanej metody mikroskopii, sm-FRET może dostarczać informacji o rozdzielczości przestrzennej zbliżonej do angstremów, pod warunkiem właściwej korekty sygnału donora i akceptora⁷.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kapilary z topionego szkła kwarcowego	Polymicro Technologies	TSP150375
Kryszalka z topionego szkła kwarcowego	Esco Products	R425000
Przewody	Diba Industries
Biotynilowana BSA	Sigma-Aldrich	A8549
BSA	Sigma-Aldrich	A9085
Streptawidyna	Thermo Fisher Scientific, Inc.	0021122
Zestaw elastomerowy Sylgard 184	Dow Corning	3097366-1004	Zestaw elastomeru silikonowego
Trolox	Aldrich	238813
Katalaza	Sigma-Aldrich	C3155
Oksydaza glukozowa	Sigma-Aldrich	G2133
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G7528
Uszczelniacz Kwik-Cast	World Precision Instruments, Inc.	Kwik-Cast	Silikonowa masa odlewnicza