Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Podsumowanie

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Streszczenie

Mikroskopia z wykorzystaniem transferu energii między fluoroforami (FRET) jest powszechnie stosowana do badania struktury i dynamiki cząsteczek o znaczeniu biologicznym, takich jak kwasy nukleinowe i białka. Pomiary FRET na pojedynczych cząsteczkach (sm-FRET) unieruchomionych cząsteczek umożliwiają długotrwałe obserwacje układu – skutecznie aż do czasu fotowybielenia obu barwników – co pozwala na uzyskanie przebiegów czasowych informujących o dynamice biomolekularnej w szerokim zakresie skal czasowych, od milisekund do minut. Aby ułatwić pozyskanie dużej liczby przebiegów do analiz statystycznych, proces ten musi zostać zautomatyzowany, a środowisko próbki powinno być ściśle kontrolowane przez cały czas pomiaru (~12 godzin). Jest to realizowane przy użyciu zautomatyzowanego skanującego mikroskopu konfokalnego, który pozwala na badanie tysięcy pojedynczych cząsteczek w ciągu nocy, oraz komórki mikroprzepływowej, która umożliwia kontrolowaną wymianę buforu z ograniczoną zawartością tlenu i utrzymuje stałą temperaturę przez cały okres pomiarowy. W niniejszej pracy pokazujemy, jak złożyć urządzenie mikroprzepływowe i jak aktywować jego powierzchnię w celu unieruchomienia DNA. Następnie wyjaśniamy, jak przygotować bufor, aby zmaksymalizować fotostabilność i czas życia fluoroforów. Na koniec przedstawiamy kroki niezbędne do przygotowania układu do zautomatyzowanego pozyskiwania rozdzielczych w czasie przebiegów sm-FRET dla cząsteczek DNA.

Protokół

1 - Montaż celi mikrofluidycznej

Komora mikroprzepływowa jest wykonana poprzez połączenie wzorowanego dysku z polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 2 mm z nowo oczyszczonym szkiełkiem kwarcowym. Dysk PDMS zawiera cztery prostokątne komory o pojemności 30 μl, do których dostęp prowadzi poprzez elastyczne kapilary wlotowe i wylotowe, odpowiednio podłączone do zbiornika z buforem i pompy strzykawkowej, w celu kontrolowanego przepływu buforu. Komora przepływowa jest wsparta od tyłu szklanym okienkiem i umieszczona w specjalnie wykonanym uchwycie komory zawierającym chłodzony wodą element termoelektryczny do regulacji temperatury.

1. Aby przygotować wzorowany dysk PDMS, wymieszać 10 części bazy elastomeru silikonowego z 1 częścią utwardzacza, dokładnie wymieszać i pozostawić do odpowietrzenia w próżni przez 1 godzinę.
2. ostrożnie wylać mieszaninę elastomeru na formę komórki mikrofluidycznej. W naszym przypadku jest to podłoże krzemowe o średnicy 1", z czterema pasmami (1x10⁴ x 1x10³ x 300 μm) wykonanymi z negatywowego fotorezystu. Pozostawić do utwardzenia na płycie grzewczej w temperaturze 70° C przez dwie godziny.
3. Ostrożnie oddzielić utwardzony dysk PDMS od formy za pomocą żyletki. Przymocować dysk do okienka szklanego o średnicy 1" (zawierającego 8 nawierconych otworów o średnicy 2 mm na obu końcach kanałów) poprzez utlenianie obu powierzchni plazmą przez 30 sekund. Przymocować okienka szklane do płaskiej strony dysku PDMS (strony nie zawierającej kanałów).
4. Wprowadzić elastyczną kapilarę z topionego kwarcu o długości 2 cali przez każdy otwór w okienku szklanym, aż dotrze ona do kanału. Wprowadzenie najpierw igły, a następnie kapilary może ułatwić ten proces. Uszczelnić otwory w okienku szklanym za pomocą szybko utwardzającej się silikonowej masy odlewniczej, takiej jak Kwik-Cast.
5. Przepłukać kanały etanolem i wodą, a następnie aktywować plazmą komórkę wraz ze świeżo oczyszczonym, okrągłym szkiełkiem kwarcowym o średnicy 1" przez 30 sekund. Sugerujemy oczyszczenie tego szkiełka za pomocą roztworu piranha*. Przymocować szkiełko do strony komórki zawierającej kanały, uszczelniając komory.
6. Pozostawić zmontowaną komórkę do utwardzenia przez noc w temperaturze pokojowej.

* Piranha to roztwór H₂O₂ i H₂SO₄ w proporcjach 1:2,5. Aby oczyścić szkiełka nakrywki, zanurz je w roztworze piranha w temperaturze 90° C na 20 min.

2 - Aktywacja powierzchni w celu immobilizacji cząsteczek

W badaniach nad kwasami nukleinowymi najprostszy schemat immobilizacji powierzchniowej polega na uprzednim pokryciu szklanego lub kwarcowego szkiełka przedmiotowego biotynilowaną albuminą surowicy bydlęcej (BSA), a następnie streptawidyną. Pozwala to na immobilizację biotynilowanej próbki z wysoką specyficznością przez wiele dni w temperaturze pokojowej.

1. Podłączyć elastyczne rurki do kapilar, aby umożliwić łatwe wstrzykiwanie buforu za pomocą strzykawki i igły.
2. Wstrzyknąć do kanału roztwór biotinylowanego BSA o stężeniu 0.1 mg/ml w buforze A (10 mM TRIS-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, przefiltrowanym przez filtry 0.02 μm) i inkubować przez co najmniej 30 min.
3. Przepłukać kanał 300-500 μl buforu A, aby usunąć wolny biotinylowany BSA, uważając, aby w komorze nie powstały pęcherzyki powietrza.
4. Wstrzyknąć roztwór streptawidyny o stężeniu 0.1 mg/ml w buforze A i inkubować przez 15 min. Następnie powtórzyć krok 3.
5. Przepuścić roztwór biotinylowanej próbki o stężeniu 3-5 pM. Wykonać skanowanie powierzchni, aby sprawdzić stopień pokrycia cząsteczkami fluorescencyjnymi. W razie potrzeby zwiększyć stężenie próbki w celu uzyskania lepszego pokrycia. Inkubować przez 10 min i powtórzyć krok 3.

Komórka mikroprzepływowa jest zamontowana na zmotoryzowanym stoliku x-y, który umożliwia ruchy grube (do 25 mm) za pomocą silników DC z kodowaniem optycznym oraz ruchy precyzyjne (1 nm) za pomocą dwóch zamkniętych piezoaktuatorów (Physik Instrumente model M-014 lub podobny). Można to wykonać zarówno przed, jak i po aktywacji powierzchni w celu unieruchomienia próbki.

3 - Przygotowanie buforu obrazowania (IB)

IB składa się z enzymatycznego układu usuwającego tlen oraz wygaszacza tripletów, takiego jak Trolox. Ponieważ IB jest stale przepłukiwany przez całą noc, należy wcześniej przygotować co najmniej 10 ml.

1. Przygotować 10 ml 0,8% w/v D-glukozy, co najmniej 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 oraz 50 mM NaCl w wodzie dejonizowanej. Wyższe stężenie buforu jest istotne z dwóch powodów: rozpuszczenie Troloxu zakwasi roztwór, a reakcja enzymatyczna również spowoduje obniżenie pH roztworu w czasie. Ponieważ roztwór ten ma długi okres trwałości, można go przechowywać jako roztwór zapasowy.
2. Rozpuścić 5 mg Troloxu w buforze przygotowanym w kroku 1, mieszając go na wirówce typu vortex przez kilka minut, a następnie wstrząsając przez >10 min. Trolox nie jest bardzo rozpuszczalny w wodzie przy pH > 7, dlatego nie należy przyspieszać tego etapu. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i pozostawić do odgazowania w próżni przez 10 minut.
3. Przygotować enzymatyczny roztwór „gloxy”, mieszając 60 μl wody, 20 μl buforu A 5X, 20 μl katalazy, 1 mg oksydazy glukozowej oraz 100 μl BSA w stężeniu 10 mg/ml. Przefiltrować roztwór za pomocą wirówkowego filtra 0,22 μm.
4. Delikatnie zmieszać bufor z kroku 2 z roztworem „gloxy” z kroku 3, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
5. Przeprowadzić IB przez kanał ze stałą prędkością 5 μl/min, używając mechanicznej pompy strzykawkowej do kontrolowania szybkości przepływu. Przebąblować zbiornik IB argonem, aby zapobiec ponownemu rozpuszczaniu tlenu atmosferycznego w buforze.

Skanowanie powierzchni, lokalizacja cząsteczek i akwizycja śladów intensywności pojedynczych cząsteczek są sterowane programem LabView, który umożliwia zautomatyzowany pobór danych¹. Program skanuje obszary o wielkości 20x20 μm² z rozdzielczością 0,2 μm i prędkością 0,1 μm/ms. Dane są natychmiast przetwarzane w celu uzyskania lokalizacji ważonych intensywnością dla wszystkich pikseli przekraczających poziom tła. Po zlokalizowaniu unieruchomionych cząsteczek są one sukcesywnie przesuwane do objętości konfokalnej, a intensywności fluoroforu donora i akceptora są rejestrowane w funkcji czasu aż do fotowyblechowania obu fluoroforów. Następnie stolik jest programowany tak, aby przesunąć się do nowego punktu początkowego oddalonego o 100 μm, a proces skanowania zostaje powtórzony.

4 - Reprezentatywne wyniki

Poniżej znajdują się obrazy przedstawiające zmontowaną komórkę mikrofluidyczną przed aktywacją powierzchni oraz po zamontowaniu na mikroskopie w celu immobilizacji cząsteczek. Jeśli kanał zostanie pomyślnie aktywowany, skany powierzchni powinny być zbliżone do przedstawionych poniżej skanów, wykazujących emisję barwnika donora (zielony) i akceptora (czerwony) po bezpośrednim wzbudzeniu donora. Cząsteczki te są wprowadzane pojedynczo do objętości sondowania, a fluorescencja jest rejestrowana w czasie aż do fotowybielenia obu barwników, co pokazano na śladach pojedynczych cząsteczek. Z takich śladów można wyznaczyć wydajność FRET, która dostarcza informacji o chwilowym oddaleniu donora od akceptora, co z kolei jest wykorzystywane do badania struktury i dynamiki cząsteczek o znaczeniu biologicznym.

Rysunek 1: Komórka mikrofluidyczna z czterema kanałami, każdy z kapilarami wlotowymi/wylotowymi. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

Rycina 2: Komórka zamontowana na mikroskopie, gotowa do pomiarów. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

Rycina 3: Układ do pomiarów sm-FRET. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 3.

Ryciny 4 i 5: Kanał czerwony i zielony skanu powierzchni unieruchomionych cząsteczek FRET wzbudzonych zielonym laserem. Proszę kliknąć, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 4 lub ryciny 5.

Ryciny 6, 7, 8 i 9: Trajektorie intensywności fluoroforów donora (zielony) i akceptora (czerwony) przyłączonych do cząsteczki DNA w odległościach 8, 10, 16 i 18 par zasad. Kliknij, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 6, ryciny 7,ryciny 8 lub ryciny 9.

Dyskusja

Chociaż powyższy protokół został zoptymalizowany dla naszego konkretnego układu oraz dla specyficznego doboru barwników (TMR i ATTO647N), nie jest on jedyną sprawdzoną metodą. Niedawno wykazano, że alternatywny system usuwania tlenu, składający się z kwasu protokatechowego (PCA)/protokatechuranu-3,4-dioksygenazy (PCD), zwiększa fotostabilność niektórych barwników⁴. Podobnie, zamiast Troloxu można zastosować inne wygaszacze stanu tripletowego, takie jak β-merkaptoetanol (BME), choć mogą one nie hamować długotrwałego migotania niektórych barwników, w szczególności Cy5⁵.

Choć unieruchomienie poprzez biotynę-streptawidynę-biotynilowaną albuminę surowicy bydlęcej (BSA) jest preferowaną metodą w badaniach kwasów nukleinowych, powierzchnia powleczona glikolem polietylenowym (PEG) jest bardziej odpowiednia do badań białek, ponieważ zapobiega niespecyficznej adhezji¹. Dodatkowo w przypadkach, gdy cząsteczka biologiczna może ulegać oddziaływaniom powierzchniowym, można zastosować pęcherzyki o rozmiarze poniżej limitu dyfrakcyjnego do enkapsulacji badanej biomolekuły⁶.

W niniejszym artykule wykorzystaliśmy układ konfokalny wyposażony w krzemowe fotodiody lawinowe do rejestracji przebiegów intensywności fluorescencji. Protokół ten sprawdza się równie dobrze w mikroskopach fluorescencyjnych z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) wyposażonych w kamery CCD. Niezależnie od zastosowanej metody mikroskopii, sm-FRET może dostarczać informacji o rozdzielczości przestrzennej zbliżonej do angstremów, pod warunkiem właściwej korekty sygnału donora i akceptora⁷.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kapilary z topionego szkła kwarcowego	Polymicro Technologies	TSP150375
Kryszalka z topionego szkła kwarcowego	Esco Products	R425000
Przewody	Diba Industries
Biotynilowana BSA	Sigma-Aldrich	A8549
BSA	Sigma-Aldrich	A9085
Streptawidyna	Thermo Fisher Scientific, Inc.	0021122
Zestaw elastomerowy Sylgard 184	Dow Corning	3097366-1004	Zestaw elastomeru silikonowego
Trolox	Aldrich	238813
Katalaza	Sigma-Aldrich	C3155
Oksydaza glukozowa	Sigma-Aldrich	G2133
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G7528
Uszczelniacz Kwik-Cast	World Precision Instruments, Inc.	Kwik-Cast	Silikonowa masa odlewnicza