Oczyszczanie specyficznej populacji komórek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)

Podsumowanie

W przypadku wielu badań naukowych wymagających analizy biologicznej i chemicznej populacji komórek, komórki te muszą charakteryzować się wysokim stopniem czystości. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest doskonałą metodą pozyskiwania czystych populacji komórek.

Streszczenie

Badania eksperymentalne i kliniczne często wymagają wysoce oczyszczonych populacji komórek. FACS jest preferowaną techniką oczyszczania populacji komórek o znanym fenotypie. Inne masowe metody oczyszczania obejmują panning, deplecję dopełniacza oraz separację za pomocą kulek magnetycznych. FACS posiada jednak szereg zalet w porównaniu z innymi dostępnymi metodami. Jest to metoda preferowana w sytuacjach, gdy wymagana jest bardzo wysoka czystość pożądanej populacji, gdy populacja komórek docelowych wykazuje bardzo niski poziom markerów identyfikacyjnych lub gdy populacje komórek wymagają separacji na podstawie różnic w gęstości markerów. Ponadto FACS jest jedyną dostępną techniką oczyszczania umożliwiającą izolację komórek na podstawie barwienia wewnętrznego lub wewnątrzkomórkowej ekspresji białek, takich jak genetycznie zmodyfikowane fluorescencyjne białka markerowe. FACS pozwala na oczyszczanie pojedynczych komórek na podstawie ich wielkości, ziarnistości i fluorescencji. Aby oczyścić komórki docelowe, są one najpierw barwione przeciwciałami monoklonalnymi (mAb) znakowanymi fluorescencyjnie, które rozpoznają specyficzne markery powierzchniowe na pożądanej populacji komórek (1). Możliwa jest również negatywna selekcja komórek niebarwionych. Oczyszczanie metodą FACS wymaga cytometru przepływowego z funkcją sortowania oraz odpowiedniego oprogramowania. W metodzie FACS komórki w zawiesinie przepływają w strumieniu kropel, z których każda zawiera jedną komórkę, przed wiązką lasera. System detekcji fluorescencji wykrywa komórki docelowe na podstawie określonych wcześniej parametrów fluorescencyjnych. Urządzenie nadaje ładunek kropli zawierającej komórkę docelową, a elektrostatyczny system odchylania umożliwia zbieranie naładowanych kropel do odpowiednich probówek (2). Skuteczność barwienia, a w konsekwencji sortowania, zależy w dużej mierze od doboru markerów identyfikacyjnych oraz wyboru przeciwciał mAb. Parametry sortowania można dostosować w zależności od wymaganej czystości i wydajności. Mimo że FACS wymaga specjalistycznego sprzętu i przeszkolonego personelu, jest to metoda z wyboru w izolacji wysoce oczyszczonych populacji komórek.

Protokół

1. Przed rozpoczęciem procesu należy zebrać i przygotować następujące elementy:
   1. Lód
   2. Stożkowe probówki 15 ml do barwienia komórek oraz probówki do cytometrii 12 x 75 mm do barwienia kontroli jednobarwnych.
   3. Bufor do barwienia: solanka fosforanowa (PBS) + 3% płodowej surowicy bydlęcej (FCS)
   4. Pipety
   5. Blokada Fc (jeśli wymagana) i przeciwciała do barwienia. Przeciwciała muszą zostać poddane miareczkowaniu w celu uzyskania optymalnego barwienia.
   6. Kuleczki do kompensacji
   7. Bufor do zawiesiny: zrównoważony roztwór soli Hank'sa (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
   8. Błękit trypanu i hemocytometr
   9. Sito do komórek (Nylon 40 μm)
   10. Probówki do zbierania: można zastosować dwa rodzaje probówek: a) polistyrenowe probówki 12 x 75 mm (zawierające 300 μl FCS i 25 mM HEPES) lub b) stożkowe probówki 15 ml (zawierające 1 ml FCS + 25 mM HEPES). Do zbierania sortowanych komórek można użyć dowolnej pożywki bogatej o wysokim stężeniu surowicy.
2. Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z wyjściowej populacji komórkowej.
3. Opcjonalnie: Wzbogacić pożądaną populację komórek za pomocą metody puryfikacji masowej, takiej jak usuwanie dopełniacza lub sortowanie magnetyczne. Główną zaletą etapu wzbogacania jest skrócenie czasu sortowania.
4. Przemyć komórki raz buforem do barwienia.
5. Odlać supernatant i resuspendować komórki w buforze do barwienia przy stężeniu do 50 x 10⁶ dla zapewnienia wydajnego barwienia.
6. Opcjonalnie: W przypadku komórek wykazujących wysoką ekspresję FcR, zablokować receptory za pomocą odpowiedniej metody blokowania. Zalecaną metodą jest użycie przeciwciała mAb wiążącego FcγR w lodzie przez 10-15 min. Przeciwciała te są dostępne w handlu.
7. Dodać odpowiednie przeciwciało mAb (w ustalonym stężeniu), aby zabarwić pożądaną populację komórek, i inkubować przez 20-30 min w lodzie w ciemności, a następnie przemyć dwukrotnie buforem do barwienia. Opcjonalnie: można zastosować barwienie barwnikiem żywotności, takim jak jodek propidyny, aby zidentyfikować martwe komórki (5). W przypadku barwienia wielokolorowego wymagane są kontrole jednobarwne. Do przygotowania kontroli jednobarwnych zgodnie z protokołem producenta używamy kuleczek BD CompBeads.
8. Jeśli nie stosowano przeciwciał bezpośrednio koniugowanych, powtórzyć krok 7, używając odpowiedniego przeciwciała wtórnego lub koniugatu streptawidyny.
9. Po przemyciu resuspendować komórki w pożywce hodowlanej i oznaczyć stężenie komórek przy użyciu barwnika żywotności, np. błękitu trypanu.
10. Dostosować stężenie komórek do 15-20 x 10⁶/ml. W przypadku populacji komórkowych tworzących skupiska, które mogą zapchać instrument podczas sortowania, przefiltrować komórki przez sito.
11. Uruchomić i zoptymalizować sorter komórkowy. Proces konfiguracji cytometru przepływowego różni się w zależności od producenta i musi być przeprowadzony przez odpowiednio przeszkolony personel.
    Ogólne zalecenia są następujące:
    1. Wybrać odpowiednią dyszę w zależności od sortowanego typu komórek.
    2. W przypadku sortowania sterylnego, wysterylizować instrument.
    3. Przeprowadzić kontrolę jakości instrumentu za pomocą kuleczek, aby zweryfikować działanie laserów oraz dokładność sortowania.
    4. Zainstalować wymagane urządzenie do zbierania i ustawić strumienie boczne.
    5. Sprawdzić konfigurację laserów i detektorów instrumentu, aby określić możliwe do zastosowania znaczniki fluorescencyjne (nasz BD FACS Aria posiada trzy lasery i może wykrywać do dziewięciu kolorów).
    6. Po ustaleniu, jakie znaczniki fluorescencyjne zostaną użyte w sorterze, można przeprowadzić kompensację (zgodnie z poniższym opisem).
12. Przeprowadzić kompensację, używając próbki kontrolnej negatywnej oraz kontroli pojedynczo pozytywnych. Kompensacja jest niezbędna do usunięcia nakładania się widm między dwoma detektorami. Należy zauważyć, że kompensacja nie jest niezawodna i jest negatywnie wpływana przez intensywność barwienia niektórych markerów oraz przez fluorescencję komórek o niskiej autofluorescencji, co może prowadzić do słabej rozdzielczości między populacjami słabo barwiącymi a negatywnymi.
    Dla uzyskania najlepszych wyników, plan eksperymentu powinien zakładać użycie jasnych fluorochromów dla markerów o niskiej ekspresji lub tych, których wzorzec barwienia nie jest znany. Markery zapewniające dobrą separację populacji komórkowych i wysoce eksponowane powinny być używane z fluorochromami słabiej świecącymi, takimi jak te wzbudzane laserami czerwonymi lub fioletowymi.
    1. Kompensację można przeprowadzić za pomocą kuleczek do kompensacji, które są mikrocząsteczkami polistyrenu sprzężonymi z przeciwciałem specyficznym dla łańcucha lekkiego Kappa Ig myszy, szczura lub szczura/ chomika. Kuleczki te są łatwe do zabarwienia, dają silny sygnał i stanowią prosty sposób przygotowania kontroli jednobarwnych z tym samym fluoroforem co próbki eksperymentalne.
    2. Przygotować szablon zawierający wykres bivariant dla rozproszonego światła przedniego (FSC) i bocznego (SSC) oraz jeden histogram dla każdego użytego fluorochromu.
    3. Przeanalizować probówkę z kontrolą negatywną i dostosować FSC oraz SSC, aby umieścić badaną populację w odpowiedniej skali.
    4. Dostosować ustawienia PMT fluorescencji, aby umieścić populację negatywną lub autofluorescencję w lewej części histogramu.
    5. Zapisać dane z probówki kontrolnej negatywnej.
    6. Przeanalizować probówki z kontrolami pojedynczo pozytywnymi i zapisać dane dla każdej z nich.
    7. Wyznaczyć bramkę przedziałową wokół części pozytywnej danych na histogramie oraz drugą bramkę przedziałową na części negatywnej histogramu.
    8. Kompensację ręczną wykonuje się poprzez dostosowanie mediany (mediana jest lepszą miarą tendencji centralnej niż średnia w skali logarytmicznej) wartości dodatnich, aż stanie się ona równa medianie wartości ujemnych. Należy to zrobić dla każdego z fluorochromów użytych w eksperymencie.
    9. Aby dostosować medianę, należy zmieniać wartości nakładania widm (zwiększać lub zmniejszać), aż mediany dla każdego parametru fluorescencyjnego będą jak najbardziej zbliżone.
    10. Kompensację można również przeprowadzić automatycznie za pomocą oprogramowania analitycznego. Kompensacja automatyczna wykorzystuje zapisane dane z kontroli kompensacyjnych do obliczenia macierzy algebraicznej dla wszystkich fluoroforów użytych w eksperymencie. Wartości te służą do odjęcia wkładu kolorów niepodstawowych, które przenikają do detektora koloru podstawowego.
13. Zarejestrować próbkę eksperymentalną do sortowania i użyć narzędzi bramkowania oraz metod podziału, aby zdefiniować interesujące populacje.
    1. Przygotować szablon eksperymentalny z wykresem kropkowym FSC vs. SSC i użyć narzędzia bramkowania (wielokąta, prostokąta, przedziału lub kwadrantu), aby wyznaczyć bramkę dla interesującej populacji. Wykres rozproszenia obrazuje właściwości fizyczne komórki, które są charakterystyczne dla danego typu komórek.
    2. Najlepszym sposobem określenia strategii bramkowania fluorescencji jest zastosowanie kontroli FMO (fluorescence minus one). W probówce kontrolnej FMO znajdują się wszystkie odczynniki użyte w eksperymencie z wyjątkiem jednego, który jest przedmiotem badania. FMO pomaga odróżnić populacje słabo zabarwione od szerokich populacji negatywnych.
    3. Użyć danych zapisanych z probówek FMO, aby określić miejsce rozmieszczenia bramek w próbce eksperymentalnej.
14. Po wyznaczeniu bramek można je wybrać do sortowania do zewnętrznych probówek zbierających. Jednocześnie można sortować do czterech bramek (lub populacji), w zależności od dostępnego instrumentarium.
15. Analizować próbkę eksperymentalną w temperaturze 4 °C, włączyć płyty odchylające i przeprowadzić sortowanie próbki. Do probówki 12 x 75 mm można posortować od 5 x 10⁵ do 1,5 x 10⁶ komórek, a do stożkowej probówki 15 ml od 1,5 x 10⁶ do 4,5 x 10⁶ komórek.
16. Po uzyskaniu wymaganej liczby komórek ręcznie zatrzymać sortowanie.
17. Przeprowadzić analizę po sortowaniu, aby określić czystość posortowanych populacji komórkowych.

Reprezentatywne wyniki

Przedstawiliśmy tutaj wyniki sortowania komórek B i komórek T CD4 ze śledziony myszy (Rysunek 1). Splenocyty barwiono przeciwciałem anty-mysim B220 sprzężonym z PE Texas Red, anty-mysim TCRβ sprzężonym z FITC oraz anty-mysim CD4 sprzężonym z Alexafluor-700, aby zidentyfikować komórki B (B220+TCRβ-) i komórki T CD4 (CD4+TCRβ+). Sortowanie wykonano przy użyciu instrumentu BD FACS Aria. Po sortowaniu czystość komórek B wyniosła >97%, a czystość komórek T CD4 >98%.

Rysunek 1. Czystość limfocytów B śledzionowych i limfocytów T CD4 po FACS. Splenocyty mysie barwiono przeciwciałami przeciwko antygenom B220, TCRβ oraz CD4 u myszy. FACS dla limfocytów B przeprowadzono przy użyciu urządzenia BD FACS Aria, stosując bramkowanie na komórki B220+TCRβ- (Rys. 1A, panel lewy, dolny prawy kwadrant). Przeprowadzono analizę po sortowaniu w celu określenia czystości limfocytów B (Rys. 1A, panel prawy). Barwienie B220 przedstawiono na osi x, a barwienie TCRβ na osi y. FACS dla limfocytów T CD4 przeprowadzono przy użyciu tego samego cytometru przepływowego, stosując bramkowanie na komórki TCRβ+CD4+ (Rys. 1B, panel lewy, górny prawy kwadrant). Przeprowadzono analizę po sortowaniu w celu określenia czystości limfocytów T CD4 (Rys. 1B, panel prawy). Barwienie TCRβ przedstawiono na osi x, a barwienie CD4 na osi y. Przedstawiono procent komórek dodatnich w każdym kwadrancie.

Dyskusja

FACS jest wysoce wyspecjalizowaną techniką oczyszczania wybranych populacji komórek, która pozwala na uzyskanie bardzo wysokiej czystości (95-100%) sortowanej populacji. Dlatego technika ta jest szczególnie istotna w eksperymentach, w których wysoka czystość jest niezbędnym wymogiem (np. w analizie mikromacierzy). FACS wykazuje szczególną przewagę nad innymi dostępnymi metodami oczyszczania w sytuacjach, gdy populacja komórek wymaga oczyszczenia na podstawie słabo eksponowanego markera powierzchniowego lub gdy konieczne jest wyodrębnienie dwóch lub więcej populacji różniących się poziomem ekspresji tego samego markera powierzchniowego. Przykładem może być oczyszczanie limfocytów B strefy marginalnej (B220⁺CD21^hiCD23^int/low) oraz limfocytów B mieszkowych (B220⁺CD21^int/lowCD23^hi) na podstawie poziomów ekspresji CD21 i CD23. Innym coraz częściej stosowanym zastosowaniem FACS jest sortowanie pojedynczych komórek, co umożliwia analizę poszczególnych jednostek komórkowych (3, 4). FACS jest również powszechnie wykorzystywany do sortowania komórek wykazujących genetyczną ekspresję białek fluorescencyjnych, takich jak białka znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (5). Jeśli sortowanie jest przeprowadzane w warunkach sterylnych, komórki mogą być następnie hodowane. Jednakże w trakcie sortowania może dojść do obniżenia żywotności i wydajności odzysku komórek. Żywotność można poprawić, stosując optymalną dla danej linii komórkowej temperaturę sortowania oraz przetwarzając probówki odbiorcze natychmiast po ich wypełnieniu. Wydajność odzysku można zwiększyć poprzez zastosowanie polipropylenowych probówek odbiorczych, zbieranie sortowanych komórek w pożywkach bogatych w surowicę i okresowe odwracanie probówek, utrzymywanie probówek w optymalnej temperaturze oraz wirowanie sortowanych komórek przez ~10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu/Protocol.htm).

Rozwój ultraszybkich sorterów rozszerzył możliwości zastosowania sortowania przepływowego w warunkach klinicznych. Potencjalne zastosowania kliniczne FACS obejmują oczyszczanie komórek macierzystych krwi z krwi ludzkiej do celów terapeutycznych, zastosowania w terapii nowotworów, alternatywę dla amniocentezy, sortowanie plemników ludzkich oraz wczesne wykrywanie chorób (6, 7).

W przypadku barwienia wielokolorowego kluczowym krokiem jest wybór przeciwciał, a fluorochromy dobiera się na podstawie systemu detekcji konkretnego urządzenia. Istnieje wiele firm sprzedających sortery komórkowe, a konfiguracja laserów różni się w zależności od potrzeb użytkownika. W związku z tym nie można po prostu użyć dokładnie tych samych przeciwciał, które zostały wykorzystane w opublikowanych badaniach, bez potwierdzenia ich kompatybilności. Aby zoptymalizować wybór przeciwciał, należy wziąć pod uwagę poziom ekspresji badanego białka. Zasadniczo do barwienia słabo eksponowanych markerów powierzchniowych należy używać przeciwciał znakowanych najjaśniejszymi dostępnymi fluorochromami, natomiast słabo świecące fluorochromy można zastosować do barwienia markerów powierzchniowych o wysokim poziomie ekspresji (8). Ponadto przeciwciała powinny być dobrane w taki sposób, aby nakładanie się ich widm emisji było minimalne. W barwieniu wielokolorowym niezwykle trudno jest dobrać fluorochromy, które nie wykazują żadnego nakładania się widm. W takiej sytuacji przeprowadza się kompensację.

Kompensacja jest niezbędna, aby matematycznie wyeliminować nakładanie się fluorescencji w widmach emisji różnych fluorochromów mierzonych przez detektory (8-10). Innymi słowy, fluorescencja nakładająca się z jednego fluorochromu jest odejmowana od widma emisji innego fluorochromu. Obliczenie kompensacji wymaga niebarwionej próbki kontrolnej oraz pojedynczych kontrol pozytywnych dla każdego fluorochromu użytego do barwienia wielokolorowego (9, 10). Kompensację można przeprowadzić z wykorzystaniem komórek lub kulek kalibracyjnych. Kuleczki są łatwe do zabarwienia, dają silny sygnał i stanowią prosty sposób przygotowania kontroli jednobarwnych zawierających te same fluorofory, co próbki eksperymentalne. Kuleczki do kompensacji są szczególnie korzystne, gdy białko powierzchniowe komórki, które jest przedmiotem badania, wykazuje niski poziom ekspresji, a populacja komórek budząca zainteresowanie jest ograniczona w początkowej populacji komórkowej.

Po wybraniu przeciwciał ich aktywność należy zoptymalizować poprzez przeprowadzenie analizy miareczkowania. Jest to szczególnie istotne w przypadku zastosowania cytometru FACS wyposażonego w bardzo silne lasery. Wykorzystanie suboptymalnych stężeń przeciwciał barwiących może prowadzić do słabej separacji pożądanej populacji komórek z całkowitej populacji komórek. Z kolei stosowanie wysokich stężeń przeciwciał zwiększa ryzyko niespecyficznego barwienia antygenów. Zatem miareczkowanie przeciwciał pozwoli na wybór takiego stężenia, które zapewni maksymalną jasność populacji pozytywnej przy minimalnym barwieniu tła (8).

FACS jest obecnie standardową techniką oczyszczania subpopulacji komórek. Może być wykorzystywany do separacji każdego typu komórek, z których można przygotować zawiesinę pojedynczych komórek i dla których dostępne są przeciwciała pozwalające zidentyfikować pożądaną populację komórkową. FACS jest metodą z wyboru w sytuacjach, gdy wymagane są wysokoczyste populacje komórek.