Oczyszczanie określonej populacji komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)

Podsumowanie

Dla wielu badań naukowych wymagających biologicznej i chemicznej analizy populacji komórek, komórki muszą być w wysokim stanie czystości. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest doskonałą metodą uzyskiwania czystych populacji komórek.

Streszczenie

Badania eksperymentalne i kliniczne często wymagają wysoce oczyszczonych populacji komórek. FACS jest techniką z wyboru do oczyszczania populacji komórek o znanym fenotypie. Inne masowe metody oczyszczania obejmują przesuwanie, zubożenie dopełniacza i separację kulek magnetycznych. Jednak FACS ma kilka zalet w porównaniu z innymi dostępnymi metodami. FACS jest preferowaną metodą, gdy wymagana jest bardzo wysoka czystość pożądanej populacji, gdy docelowa populacja komórek wykazuje bardzo niski poziom markera identyfikującego lub gdy populacje komórek wymagają separacji w oparciu o różnicową gęstość markerów. Ponadto FACS jest jedyną dostępną techniką oczyszczania do izolowania komórek na podstawie barwienia wewnętrznego lub wewnątrzkomórkowej ekspresji białek, takiej jak genetycznie zmodyfikowany marker białka fluorescencyjnego. FACS umożliwia oczyszczanie pojedynczych komórek na podstawie wielkości, ziarnistości i fluorescencji. W celu oczyszczenia interesujących komórek najpierw barwi się je fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami monoklonalnymi (mAb), które rozpoznają specyficzne markery powierzchniowe na pożądanej populacji komórek (1). Możliwa jest również negatywna selekcja niebarwionych komórek. Oczyszczanie FACS wymaga cytometru przepływowego o zdolności sortowania i odpowiedniego oprogramowania. W przypadku FACS komórki w zawiesinie są przepuszczane jako strumień w kropelkach, z których każda zawiera pojedynczą komórkę przed laserem. System detekcji fluorescencji wykrywa interesujące komórki na podstawie wcześniej określonych parametrów fluorescencyjnych komórek. Przyrząd nakłada ładunek na kroplę zawierającą interesujące ogniwo, a system odchylania elektrostatycznego ułatwia zbieranie naładowanych kropel do odpowiednich probówek zbiorczych (2). Powodzenie barwienia, a tym samym sortowania, zależy w dużej mierze od wyboru markerów identyfikujących i wyboru mAb. Parametry sortowania można dostosować w zależności od wymagań dotyczących czystości i wydajności. Chociaż FACS wymaga specjalistycznego sprzętu i przeszkolenia personelu, jest to metoda z wyboru do izolacji wysoce oczyszczonych populacji komórek.

Protokół

1. Przed rozpoczęciem procesu należy zebrać i przygotować następujące elementy:
   1. lód
   2. Probówki stożkowe o pojemności 15 ml do barwienia komórek i probówki przepływowe 12 x 75 mm do barwienia jednokolorowych regulatorów.
   3. Bufor barwiący: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 3% płodowa surowica cielęca (FCS)
   4. Pipety
   5. Blok Fc (jeśli jest wymagany) i przeciwciała barwiące. Przeciwciała należy miareczkować w celu optymalnego barwienia.
   6. Koraliki kompensacyjne
   7. Bufor zawiesiny: Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
   8. Błękit trypanowy i hemocytometr
   9. Sitko do komórek (nylon 40 μm)
   10. Probówki zbiorcze: Można stosować dwa rodzaje probówek zbiorczych: a) probówki polistyrenowe 12 x 75 mm (zawierające 300 μl FCS i 25 mM HEPES) lub b) probówki stożkowe 15 ml (zawierające 1 ml FCS + 25 mM HEPES). Do zbierania posortowanych komórek można użyć dowolnej bogatej pożywki o wysokim stężeniu w surowicy.
2. Wygeneruj zawiesinę pojedynczej komórki początkowej populacji komórek.
3. Opcjonalnie: Wzbogacić w celu uzyskania pożądanej populacji komórek za pomocą metody oczyszczania masowego, takiej jak zubożenie dopełniacza lub sortowanie magnetyczne. Główną zaletą etapu wzbogacania jest to, że skraca on czas sortowania.
4. Umyj komórki raz buforem barwiącym.
5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym o stężeniu do 50 x 10⁶ w celu skutecznego barwienia.
6. Opcjonalnie: W przypadku komórek wykazujących wysoki poziom FcR, należy zablokować receptory za pomocą odpowiedniej metody blokowania. Metodą z wyboru jest użycie mAb, który wiąże się z FcγR na lodzie przez 10-15 minut. Przeciwciała te są dostępne w handlu.
7. Dodać odpowiedni mAb (w ustalonym stężeniu), aby wybarwić żądaną populację komórek i inkubować przez 20-30 minut na lodzie w ciemności, a następnie dwukrotnie przepłukać buforem barwiącym. Opcjonalnie: W celu rozpoznania martwych komórek można włączyć barwienie życiodajnym barwnikiem, takim jak jodek propidyny (5). Jeśli ma być używane barwienie wielokolorowe, wymagane są pojedyncze elementy sterujące kolorem. Używamy BD CompBeads do przygotowania jednokolorowych kontrolek z wykorzystaniem protokołu producenta.
8. Jeśli nie stosuje się przeciwciał bezpośrednio sprzężonych, należy powtórzyć krok 7, stosując odpowiednie przeciwciało drugorzędowe lub koniugat streptawidyny.
9. Po umyciu ponownie zawieś komórki w pożywce hodowlanej i określ stężenie komórek za pomocą ważnego barwnika, takiego jak błękit trypanowy.
10. Dostosuj stężenie komórek do 15-20 x 10⁶/ml. W przypadku populacji komórek, które tworzą klastry, które mogą zatkać urządzenie podczas sortowania, przefiltruj komórki przez sitko.
11. Skonfiguruj i zoptymalizuj sorter komórek. Proces ustawiania cytometru przepływowego różni się w zależności od producenta i musi być wykonywany przez odpowiednio przeszkolony personel.
    Ogólne zalecenia są następujące:
    1. Wybierz odpowiednią dyszę w zależności od typu komórki do sortowania.
    2. W przypadku sortów sterylnych wysterylizuj instrument.
    3. Przeprowadź kontrolę jakości urządzenia za pomocą koralików, aby sprawdzić, czy lasery działają i czy sortowanie jest dokładne.
    4. Zainstaluj wymagane urządzenie zbierające i skonfiguruj strumienie boczne.
    5. Spójrz na laser i detektor urządzenia, aby określić etykiety fluorescencyjne, których można użyć (nasz BD FACS Aria ma trzy lasery i może wykryć do dziewięciu kolorów).
    6. Po ustaleniu, jakie etykiety fluorescencyjne zostaną użyte w sortowniku komórek, można przeprowadzić kompensację (jak wyjaśniono poniżej).
12. Przeprowadzić kompensację przy użyciu próbki kontroli ujemnej i pojedynczych kontroli dodatnich. Kompensacja jest konieczna, aby usunąć nakładanie się widma między dwoma detektorami. Należy zauważyć, że kompensacja nie jest niezawodna i niekorzystnie wpływa na nią to, jak jasno barwią się niektóre markery, a także fluorescencja komórek, które mają niską autofluorescencję, co może prowadzić do słabej rozdzielczości między populacjami ciemnymi i ujemnymi.
    Aby uzyskać najlepsze wyniki, projekt eksperymentalny powinien obejmować użycie jasnych fluorochromów z markerami, które mają niską ekspresję lub które nie mają znanego wzoru barwienia. Markery, które zapewniają dobrą separację między populacjami komórek i są wysoce eksprymowane, powinny być używane z fluorochromami dimerowymi, takimi jak te wzbudzone przez lasery czerwone lub fioletowe.
    1. Kompensację można przeprowadzić za pomocą kulek kompensacyjnych, które są mikrocząstkami polistyrenu, które zostały sprzężone z przeciwciałem specyficznym dla łańcucha lekkiego Ig Kappa od myszy, szczura lub szczura/chomika. Koraliki są łatwe do barwienia, mają silny sygnał i zapewniają łatwy sposób przygotowania pojedynczych barwionych kontroli, które mają ten sam fluorofor co próbki eksperymentalne.
    2. Skonfiguruj szablon, który zawiera wykres dwóch zmiennych do wyświetlania rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC) oraz jeden histogram dla każdego fluorochromu, który zostanie użyty.
    3. Uruchom probówkę kontroli ujemnej i dostosuj rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC), aby umieścić badaną populację na skali.
    4. Dostosuj ustawienia PMT fluorescencji, aby umieścić populację ujemną lub autofluorescencję w skrajnej lewej części histogramu.
    5. Nagrać probówkę kontroli ujemnej.
    6. Uruchomić pojedyncze probówki kontroli dodatniej i zapisać dane dla każdej probówki.
    7. Narysuj bramkę interwałową wokół dodatniej części danych na histogramie, a kolejną bramkę interwałową wokół ujemnej części histogramu.
    8. Kompensacja ręczna odbywa się poprzez dostosowanie mediany (mediana jest lepszym oszacowaniem tendencji centralnej niż średnia na skali logarytmicznej) pozytywów, aż będzie równa medianie wartości ujemnych. Należy to zrobić dla każdej z etykiet fluorochromowych użytych w doświadczeniu.
    9. Aby dostosować medianę, należy dostosować wartości nakładania się widma w górę lub w dół, aż mediany dla każdego parametru fluorescencyjnego będą jak najbardziej zgodne.
    10. Kompensacja może być również dokonywana automatycznie za pomocą oprogramowania analitycznego. Automatyczna kompensacja wykorzystuje zarejestrowane dane z kontroli kompensacji do obliczenia macierzy algebraicznej dla wszystkich fluoroforów użytych w eksperymencie. Wartości te są używane do odejmowania udziału kolorów innych niż podstawowe, które przenikają do detektora koloru podstawowego.
13. Zapisz próbkę doświadczalną do sortowania i użyj narzędzi do bramkowania i metod podzbiorów w celu zdefiniowania populacji będących przedmiotem zainteresowania.
    1. Skonfiguruj szablon eksperymentalny z wykresem kropkowym, który wyświetla FSC i SSC, i użyj narzędzia do bramkowania, wielokąta, prostokąta, interwału lub kwadrantu, aby określić populację będącą przedmiotem zainteresowania. Wykres punktowy przedstawia właściwości fizyczne komórki, które są odrębne od typu komórki.
    2. Najlepszym sposobem określenia strategii bramkowania fluorescencji jest użycie kontroli fluorescencji minus jeden (FMO). W probówce kontrolnej FMO znajdują się wszystkie odczynniki, które są używane w eksperymencie, z wyjątkiem jednego będącego przedmiotem zainteresowania. FMO pomaga rozróżnić populacje słabo zabarwione i szerokie populacje negatywne.
    3. Wykorzystaj dane zarejestrowane z probówek FMO, aby określić, gdzie umieścić bramki w probówce eksperymentalnej.
14. Po ustaleniu bramek można je wybrać do sortowania do zewnętrznych probówek zbiorczych. Jednocześnie można sortować do czterech bramek (lub populacji) w zależności od dostępnego oprzyrządowania.
15. Uruchomić probówkę z próbką doświadczalną w temperaturze 4 °C, włączyć płytki odchylające i posortować próbkę. 5 x 10⁵ -1,5 x 10⁶ komórek można sortować do probówki 12 x 75 mm, a 1,5 x 10⁶ - 4,5 x 10 6 komórek można sortować do stożkowej o pojemności 15 ml.
16. Po uzyskaniu wymaganej liczby komórek ręcznie przerwij sortowanie.
17. Wykonaj analizę po sortowaniu, aby określić czystość posortowanych populacji komórek.

Reprezentatywne wyniki

Pokazaliśmy tutaj wyniki sortowania komórek T B i CD4 myszy w śledzionie (Rysunek 1). Splenocyty barwiono anty-mysią witaminą B220 sprzężoną z PE Texas Red, anty-mysią TCRβ sprzężoną z FITC i anty-mysią CD4 sprzężoną z Alexafluor-700 w celu identyfikacji limfocytów B (B220 + TCRβ-) i limfocytów T CD4 (CD4 + TCRβ +). Sortowanie zostało wykonane za pomocą instrumentu BD FACS Aria. Po sortowaniu czystość limfocytów B wynosiła >97%, a czystość limfocytów T CD4 wynosiła >98%.

Rysunek 1. Czystość limfocytów B śledziony i limfocytów T CD4 po FACS. Mysie splenocyty wybarwiono przeciwciałami anty-mysimi B220, TCRβ i CD4. FACS dla komórek B przeprowadzono przy użyciu BD FACS Aria poprzez bramkowanie na komórkach B220 + TCRβ- (ryc. 1A, lewy panel, prawy dolny kwadrant). Przeprowadzono analizę po sortowaniu w celu określenia czystości komórek B (ryc. 1A, prawy panel). Barwienie B220 jest pokazane na osi x, a barwienie TCRβ na osi y. FACS dla limfocytów T CD4 przeprowadzono przy użyciu tego samego cytometru przepływowego poprzez bramkowanie na komórkach TCRβ + CD4 + (ryc. 1B, lewy panel, prawy górny kwadrant). Przeprowadzono analizę po sortowaniu w celu określenia czystości limfocytów T CD4 (ryc. 1B, prawy panel). Barwienie TCRβ jest pokazane na osi x, a barwienie CD4 na osi y. Pokazany jest procent dodatnich komórek w każdym kwadrancie.

Dyskusja

FACS jest wysoce zaawansowaną techniką oczyszczania populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania, w której można uzyskać bardzo wysoką czystość (95-100%) posortowanej populacji. Dlatego technika ta jest szczególnie ważna w przypadku eksperymentów, w których niezbędna jest wysoka czystość (np. analiza mikromacierzy). FACS jest szczególnie korzystny w porównaniu z innymi dostępnymi metodami oczyszczania, gdy populacja komórek musi zostać oczyszczona na podstawie tygodniowego wyrażonego markera powierzchniowego lub gdy konieczne jest oczyszczenie dwóch lub więcej populacji, które mają różne poziomy ekspresji tego samego markera powierzchniowego. Na przykład oczyszczanie komórek strefy brzeżnej B (B220 ⁺ CD21^hiCD23^{int / low}) i pęcherzyków B (B220 ⁺ CD21^{int / low}CD23^hi) w oparciu o poziomy ekspresji CD21 i CD23. Innym rosnącym zastosowaniem FACS jest sortowanie pojedynczych komórek, które umożliwia analizę pojedynczych komórek (3, 4). FACS jest również powszechnie stosowany do sortowania komórek eksprymujących białka fluorescencyjne, które są wyrażane genetycznie, takie jak białka znakowane zieloną fluorescencją (5). Jeśli przeprowadza się sortowanie sterylne, komórki można hodować. Jednak żywotność komórek i wydajność mogą być zagrożone podczas sortowania. Żywotność można poprawić, stosując optymalną temperaturę sortowania zależną od komórki oraz przetwarzając probówki zbierające natychmiast po osiągnięciu przez nie pojemności. Odzysk można zwiększyć, stosując probówki do pobierania z polipropylenu, zbierając posortowane komórki w pożywkach bogatych w surowicę i przerywając probówki zbiorcze, utrzymując probówki zbiorcze w optymalnej temperaturze i odwirowując posortowane komórki przez ~10 minut (http://cyto.mednet.ucla.edu/Protocol.htm).

Rozwój ultraszybkich sortowników rozszerzył możliwości zastosowania sortowania przepływowego w warunkach klinicznych. Potencjalne zastosowania kliniczne FACS obejmują oczyszczanie komórek macierzystych krwi z krwi ludzkiej w celach terapeutycznych, zastosowania w terapii nowotworów, zastępstwie amniopunkcji, sortowaniu nasienia ludzkiego i wczesnym wykrywaniu chorób (6, 7).

W przypadku barwienia wielokolorowego wybór przeciwciał jest krytycznym krokiem, a fluorochromy są wybierane na podstawie systemu wykrywania dla każdego konkretnego instrumentu. Istnieje wiele firm, które sprzedają sortery komórek, a konfiguracja lasera różni się w zależności od potrzeb użytkownika. W związku z tym nie można po prostu użyć dokładnie tych samych przeciwciał, które zostały użyte w opublikowanych badaniach, bez potwierdzenia zgodności. W celu optymalnego doboru przeciwciał należy wziąć pod uwagę poziom ekspresji badanego białka. Ogólnie rzecz biorąc, najjaśniejsze dostępne przeciwciała znakowane fluorochromem powinny być używane do barwienia słabo wyrażonych markerów powierzchniowych, podczas gdy słabe fluorochromy mogą być używane do barwienia markerów powierzchniowych o wysokiej ekspresji (8). Ponadto przeciwciała powinny być dobierane w taki sposób, aby nakładanie się ich widm emisyjnych było minimalne. W przypadku barwienia wielokolorowego niezwykle trudno jest wybrać fluorochrom, które nie nakładają się na siebie widmowo. W takiej sytuacji następuje kompensacja.

Kompensacja jest konieczna, aby matematycznie wyeliminować nakładanie się widma fluorescencji między widmem emisji różnych fluorochromów, które można zmierzyć za pomocą detektorów (8-10). Innymi słowy, fluorescencja nakładająca się z jednego fluorochromu jest odejmowana od widma emisji innego fluorochromu. Obliczenie kompensacji wymaga niebarwionej kontroli i pojedynczych kontroli dodatnich dla każdego fluorochromu użytego do barwienia wielobarwnego (9, 10). Kompensację można przeprowadzić za pomocą ogniw lub kulek. Koraliki są łatwe do barwienia, mają silny sygnał i zapewniają łatwy sposób przygotowania pojedynczych barwionych kontroli, które mają te same fluorofory co próbki eksperymentalne. Kulki kompensacyjne są szczególnie korzystne, gdy białko powierzchniowe komórki będące przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji na niskim poziomie i gdy populacja komórek będących przedmiotem zainteresowania jest ograniczona w początkowej początkowej populacji komórek.

Po wybraniu przeciwciał należy zoptymalizować ich aktywność poprzez przeprowadzenie analizy miareczkowania. Jest to szczególnie ważne, jeśli maszyna FACS jest wyposażona w lasery o dużej mocy. Stosowanie nieoptymalnych stężeń przeciwciał barwiących może skutkować słabym oddzieleniem pożądanej populacji komórek od całej populacji komórek. Stosowanie wysokich stężeń przeciwciał zwiększa szansę na niespecyficzne barwienie antygenu. Dlatego miareczkowanie przeciwciał pozwoli na wybór stężenia przeciwciał, które daje maksymalną jasność populacji dodatniej i minimalne barwienie tła (8).

FACS jest obecnie standardową techniką oczyszczania subpopulacji komórek. Może być stosowany do oddzielania dowolnego typu komórek, w których można wytworzyć pojedynczą zawiesinę komórkową i dostępne są przeciwciała w celu identyfikacji pożądanej populacji komórek. FACS jest metodą z wyboru, gdy wymagane są wysoce czyste populacje komórek.