SC1 działa poprzez podwójne hamowanie Ras-GAP oraz ERK1. Przebadaliśmy funkcję SC1 w wspieraniu samoodnawiania się mysich komórek ES w obecności braku LIF i wykazaliśmy, że SC1 jest w stanie utrzymać samoodnawianie się kultur mysich komórek ES.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie SC1 (Pluripotin) w celu wspierania samoodnowy mESC wobec braku LIF
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mysie embrionalne komórki macierzyste (ES) są konwencjonalnie hodowane z czynnikiem hamującym białaczkę (LIF), aby utrzymać zdolność do samoodnawiania.1Jednakże LIF jest kosztowny, a aktywacja szlaku LIF/JAK/STAT3 nie jest absolutnie wymagana do utrzymania stanu samoodnawiania.2Mała cząsteczka SC1 może stanowić ekonomiczną alternatywę dla LIF. SC1 działa poprzez podwójne hamowanie Ras-GAP oraz ERK1.3Ilustracja jego mechanizmu działania sprawia, że jest to przydatne narzędzie do badania podstawowego molekularnego mechanizmu samoodnowy. W niniejszym materiale przedstawiamy procedurę hodowli komórek ES myszy w obecności SC1 i wykazujemy, że są one zdolne do utrzymania samoodnowy przy braku LIF. Komórki hodowane z SC1 wykazywały podobną morfologię w porównaniu z komórkami utrzymywanymi z LIF. Obie grupy wykazywały typową morfologię komórek ES myszy po pięciu pasażach. Ekspresja typowych markerów pluripotencji (Oct4, Sox2, Nanog oraz SSEA1) została zaobserwowana po pięciu pasażach w obecności SC1. Ponadto SC1 nie wywołał widocznej toksyczności w komórkach ES myszy.
Protokół
1. Przygotowanie płytek z komórkami karmionymi MEF
- Na dzień przed hodowlą komórek ES rozmrozić jedną fiolkę napromieniowanych komórek zasilających MEF E14.5 CF-1 (patrz: nasza procedura rozmrażania komórek ES).
- Wysiać komórki zasilające MEF w gęstości 10 000 komórek/dołek na płytce 12-dołkowej. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C i przy 5% CO2. Pożywka dla komórek MEF: DMEM uzupełniony o 10% ES-PBS, 1X glutaminę oraz 1X nieistotne aminokwasy.
2. Utrzymanie zdolności do samoodnawiania komórek ES myszy
- Odczepić komórki ES za pomocą trypsyny. Wysiać komórki w gęstości 50 000 cells/well na uprzednio przygotowane płytki z warstwą wspomagającą MEF w pożywce wzrostowej (Knockout MEM uzupełniony o 15% KSR, 4 mM L-glutaminy, 0,1 mM aminokwasów niepodstawowych i 1X BME) z dodatkiem SC1 w żądanym stężeniu (użyto 100 nM, 300 nM i 1 μM). Dodano również studzienkę kontrolną pozytywną, uzupełnioną o 1000 μ/ml LIF. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.
- Hodować komórki w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 3-4 dni w każdym pasażu. Odświeżać pożywkę co 48 godzin.
- Pasażować komórki w stosunku od 1:10 do 1:15 za pomocą trypsyny, aby utrzymać gęstość zbliżoną do początkowej gęstości wysiewu. Po 5 pasażach można zbadać komórki pod kątem ekspresji typowych markerów pluripotencji, stosując immunocytochemię.
3. Badanie markerów pluripotencji metodą immunocytochemiczną
- Delikatnie przemyć komórki trzykrotnie za pomocą PBS.
- Utrwalić komórki, dodając 500 μl utrwalacza, i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Delikatnie przemyć komórki trzykrotnie za pomocą PBS.
- Zablokować nieswoiste wiązania, dodając 500 μl buforu blokującego, i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
- Inkubować komórki z 250 μl specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego (użyto Nanog, Sox2, SSEA1 oraz Oct4 w następujących rozcieńczeniach: 1:500, 1:2000, 1:500 i 1:500).
- Delikatnie przemyć komórki trzykrotnie za pomocą PBS.
- Inkubować komórki z 250 μl przeciwciała wtórnego przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem (użyto przeciwciał osiołkowych anty-mysich sprzężonych z Alexa Fluor® 555 w rozcieńczeniu 1:2000 oraz osiołkowych anty-króliczych sprzężonych z Alexa Fluor® 488 w rozcieńczeniu 1:2000).
- Delikatnie przemyć komórki trzykrotnie za pomocą PBS.
- Do ostatniego przemycia dodać DAPI (stężenie końcowe 1 μg/ml) i inkubować przez 5 minut w celu wizualizacji jąder komórkowych.
- Przeanalizować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
4. Reprezentatywne wyniki:
1. Wyniki morfologiczne:
Mysie komórki ES (ESC R1) hodowano na komórkach zasilających MEF w obecności LIF lub SC1 w celu utrzymania samoodnawiania w stanie niedróżnicowanym. Po drugim pasażu zaobserwowano różnicowanie komórek pozbawionych LIF lub SC1 (kontrola negatywna), a po 5 pasażach praktycznie nie stwierdzono kolonii niedróżnicowanych. Kolonie traktowane LIF (kontrola pozytywna) pozostawały w stanie niedróżnicowanym przez wszystkie 5 pasaży komórek. Komórki traktowane SC1 w stężeniach 300 nM lub 100 nM również pozostały niedróżnicowane po 5 pasażach, natomiast w przypadku komórek traktowanych 1 μM SC1 doszło do śmierci komórek po czwartym pasażu. (ryc. 2 notatki aplikacyjnej) Tabela 1 podsumowuje obserwacje morfologiczne.
2. Ekspresja markerów pluripotencji
Komórki ES myszy utrzymywane przez 5 pasaży utrwalono i poddano badaniu immunocytochemicznemu w kierunku SSEA1, Oct4, Nanog i Sox2. Ekspresja markerów była podobna do komórek utrzymywanych w LIF. (rys. 3 i 4 notatki aplikacyjnej)
Rysunek 1: Porównanie morfologii komórek hodowanych w LIF lub SC1. Nie zaobserwowano różnic w morfologii.
Rycina 2 i Rycina 3: Barwienie Nanog, SSEA1, Sox2 i Oct4 komórek ES hodowanych z dodatkiem SC1 lub LIF (ryc. 4 notatki aplikacyjnej). Komórki hodowane w SC1 wykazują ekspresję markerów pluripotencji podobną do komórek hodowanych w LIF.
Tabela 1
| Kontrola negatywna | Kontrola pozytywna LIF | SC1 1uM | SC1 300 nM | SC1 100 nM | |
| 1. pasaż | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES |
| 2. pasaż | Częściowa morfologia zróżnicowana | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES |
| 3. pasaż | Większość komórek zróżnicowana | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES |
| 4. pasaż | Brak kolonii ESC | Normalna morfologia komórek ES | Obserwowano śmierć komórek | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES |
| 5. pasaż | zróżnicowane | Normalna morfologia komórek ES | Obserwowano śmierć komórek | Normalna morfologia komórek ES | Normalna morfologia komórek ES |
Dyskusja
Mała cząsteczka SC1 może być wykorzystana do utrzymania zdolności do samoodnawiania przy jednoczesnym zachowaniu stanu niedróżnicowania w komórkach ES myszy. Przed jednak zastosowaniem jej w nieprzebadanej linii komórkowej należy przeprowadzić miareczkowanie w celu ustalenia optymalnego stężenia. Przykładowo, przetestowano trzy stężenia na linii komórek ES myszy ESC R1. Stężenia 100 nM oraz 300 nM pozwoliły na utrzymanie komórek ES myszy, natomiast stężenie 1 μM okazało się toksyczne.
SC1 może być również stosowane w warunkach bez użycia komórek karmionek.
Oświadczenia
Autorzy tego artykułu są zatrudnieni przez firmę Stemgent, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować dr. Sheng Dinga z The Scripps Research Institute oraz dr. Hongkui Denga z Uniwersytetu Pekińskiego za pomoc i wskazówki.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| SC1 | Stemgent | 04-0011 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| przeciwciało SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | 21702 | |
| przeciwciało Nanog | Abcam | ab21603 | |
| przeciwciało Sox2 | Chemicon International | Ab5603 | |
| przeciwciało Oct4 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-5279 |
Bibliografia
- Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).
Przedruki i uprawnienia
