Wąsik szczękowy danio pręgowanego jest integumentarnym organem zmysłowym zawierającym pochodne ektodermy, mezodermy i grzebienia nerwowego. Co istotne, u osobników dorosłych wąsik ten potrafi zregenerować się po amputacji proksymalnej. Niniejszy film przedstawia rozwój wąsika szczękowego oraz prezentuje protokół chirurgiczny indukcji regeneracji, a następnie proces pobierania, zatapiania i obrazowania preparatów wąsików.
Artykuł metodologiczny
Metody badania wąsika szczękowego danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wąsiki są skórnymi wyrostkami sensorycznymi występującymi u ryb, gadów i płazów. Danio pręgowany, Danio rerio, rozwija dwie pary wąsików – krótką parę nozdrzową oraz dłuższą parę szczękową. Tkanka wąsików składa się z komórek pochodzenia ektodermalnego, mezodermalnego i z grzebienia nerwowego, w tym z komórek skóry, gruczołów, pąków smakowych, melanocytów, naczyń krwionośnych i nerwów sensorycznych. W przeciwieństwie do większości tkanek u osobników dorosłych, wąsik szczękowy jest optycznie przezroczysty, co pozwala na wizualizację rozwoju i utrzymania tych typów tkanek w całym cyklu życiowym.
W niniejszym filmie przedstawiono wczesny rozwój wąsika szczękowego (rozpoczynający się w przybliżeniu miesiąc po zapłodnieniu) oraz zaprezentowano protokół chirurgiczny służący do indukowania regeneracji tego wyrostka u osobników dorosłych (>3 miesiące po zapłodnieniu). W skrócie, lewy wąsik szczękowy znieczulonej ryby zostaje uniesiony sterylną pęsetą tuż za krawędzią tylną szczęki. Cienkie, sterylne nożyczki sprężynowe zostają ustawione przy pęsecie, aby przeciąć trzon wąsika na tym poziomie, co wyznacza punkt orientacyjny dla płaszczyzny amputacji. Przyrost regeneracyjny można mierzyć w odniesieniu do tej płaszczyzny oraz w porównaniu z wąsikiem przeciwległym. Tkanka wąsika regeneruje się szybko, osiągając maksymalny stopień odrostu w ciągu 2 tygodni od urazu.
Techniki analizy zregenerowanego wąsika obejmują preparowanie oraz zatapianie dopasowanych par wąsików (zregenerowanego i kontrolnego) w studzienkach standardowego żelu do elektroforezy DNA. Zatopione okazy można wygodnie fotografować pod stereomikroskopem w celu oceny morfologii ogólnej i morfometrii; mogą być one przechowywane przez wiele tygodni przed dalszymi zastosowaniami, takimi jak histologia w parafinie, kriosekcjonowanie i/lub immunohistochemia całych preparatów. Metody te czynią z wąsika szczękowego nowy system tkankowy in vivo do badania zdolności regeneracyjnych wielu typów komórek w kontekście genetycznym danio pręgowanego.
Protokół
Hodowla rybek danio
Ryby danio są utrzymywane i hodowane zgodnie ze standardowymi metodami 1. Po późnym okresie larwalnym stadium rozwojowe ryby danio można określić na podstawie jej długości standardowej (SL), czyli odległości w milimetrach w linii prostej od najbardziej przedniego punktu górnej wargi do nasady płetwy ogonowej (najbardziej tylna płytka hypuralna)2. W około jednym miesiącu po zapłodnieniu (10-12 mm SL) wąsy nosowe i szczękowe pojawiają się odpowiednio jako przezroczyste pączki nabłonkowe w pobliżu jam węchowych oraz na tylnych narożnikach szczęk. W miarę dojrzewania ryb danio, wąsy rozrastają się w wąskie, przypominające wibrysy wyrostki. Ponieważ wąs szczękowy jest większy (2-3 mm) i łatwiejszy w manipulacji, nasz protokół dotyczy wyłącznie tego konkretnego wyrostka; podobne techniki można jednak dostosować do mniejszego wąsa nosowego.
Przycinanie wąsików
- Znieczulić dorosłe danio przebrone na odpowiednim etapie rozwoju (np. 1,5-2,5 cm SL, ~3-6 miesięcy po zapłodnieniu) poprzez zanurzenie w 0,015% MS-222 (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanu) buforowanym do pH 7,0 w wodzie systemowej. Obserwować ryby, aż ustaną ruchy pływackie, a wentylacja skrzeli stanie się powolna i regularna. W zależności od wielkości ryb pełne znieczulenie trwa około 2-5 minut.
- Używając siatki akwariowej, przenieść po 1-3 ryby na złożony kawałek mokrego ręcznika papierowego w szalce Petriego. Za pomocą tępej szpatułki ułożyć ryby równolegle do siebie, stroną lewą boczna do góry. Złożyć część mokrego ręcznika papierowego na części ogonowej ryby, zakrywając całe ciało aż do operculum (pokrywy skrzeli), aby utrzymać skórę i skrzela w wilgotności podczas procedury.
- Obejrzeć szalkę Petriego pod stereomikroskopem, używając niskokątowego światła padającego do oświetlenia obszaru głowy. Skupić się na podstawie lewego wąsa szczękowego, który wystaje z tylnego brzusznego rogu szczęki (Ryc. 1).
Rycina 1. - Mocno chwycić trzon wąsa nieco dystalnie od krawędzi szczęki. Unieść trzon wąsa i wprowadzić ramiona precyzyjnych nożyczek sprężynowych tuż proksymalnie do pęsety. Nożyczki można oprzeć o pęsetę dla stabilizacji. Przesunąć ramiona nożyczek wzdłuż trzonu wąsa, aż krawędź tnąca zbliży się do krawędzi szczęki. Zamknąć nożyczki, aby przeciąć trzon wąsa. Odcięty wąs, wciąż trzymany pęsetą, można usunąć do fiksacji lub dalszej obserwacji.
- Natychmiast przenieść rybę do małego zbiornika z czystą wodą systemową (~500 mL) zawierającej jedną kroplę błękitu metylenowego, aby zapobiec powierzchownym infekcjom grzybiczym. Pozostawić rybę do regeneracji na noc. Następnego ranka zwrócić rybę do systemu hodowlanego. Regeneracja wąsów jest maksymalna po 2 tygodniach.
Zalewanie agarem dopasowanych par barbeli
- Pobierz ryby, stosując odpowiednią technikę eutanazji, i utrwal w 50 mL probówce w 4% paraformaldehydzie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), mieszając w temperaturze 4°C przez noc. Objętość utrwalacza powinna być co najmniej dziesięciokrotnie większa od objętości tkanki. Po utrwaleniu zutylizuj odpady z paraformaldehydu w odpowiednim pojemniku i dokładnie wypłucz tkankę w kilku zmianach PBS.
- Przygotuj w 250 mL kolbie szklanej 150 mL 2% agarozy (Tm ~37°C) w wodzie destylowanej. Podgrzewaj w mikrofalówce lub na płycie grzewczej, okresowo mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia. Równoważ temperaturę stopionego roztworu w łaźni wodnej o temperaturze 50-60°C.
- Zmontuj standardowy zestaw do elektroforezy w żelu, mocując małą uszczelnioną formę do żelu (10 x 10 cm; objętość żelu ~100 mL) do ścianek komory buforowej. Włóż 2-4 grzebienie do próbek o małych zębach (4 x 1,5 mm).
- Na płaskiej powierzchni wlej stopioną agarozę do formy tak, aby tylko zakryła podstawę grzebieni, tworząc bardzo płytkie dołki. Natychmiast umieść pozostałą agarozę z powrotem w ciepłej łaźni wodnej; zostanie ona wykorzystana później do zatopienia tkanki (Kroki 9-12). Włóż długą szklaną pipetę Pasteura do kolby, aby pipeta miała tę samą temperaturę co agaroza.
- Pozostaw żel do stwardnienia na 20-30 minut. Wyjmij grzebienie, a następnie wyjmij formę zawierającą stwardniały żel z komory buforowej. Mocno zaklej otwarte boki formy taśmą laboratoryjną, aby żel nie wysunął się na zewnątrz. Taśma powinna wystawać kilka milimetrów ponad powierzchnię agarozy, aby umożliwić późniejsze dodanie dodatkowej agarozy (Krok 13).
- Ustaw formę z żelem na stole stereomikroskopu. Powiększ pusty dołek i ustaw ostrość krawędzi.
- Na powierzchnię agarozy sąsiadującą z dołkiem nanieś pipetą kroplę wody lub buforu zawierającego utrwalone próbki wąsów rybich (np. zregenerowane i kontrolne). Używając zgiętych szpilek entomologicznych, przesuń wilgotne próbki do dołka i dociśnij je do dna. Zorientuj trzony wąsów równolegle do siebie i wyrównaj je wzdłuż przeciwległych długich krawędzi dołka. Napięcie powierzchniowe pomoże utrzymać tkankę w pozycji.
- Przed zatopieniem, za pomocą cienkiej końcówki pipety lub rogu chusteczki laboratoryjnej, usuń nadmiar płynu z dołka. Pracuj szybko, aby nie dopuścić do wyschnięcia tkanki.
- Używając podgrzanej szklanej pipety Pasteura, delikatnie nanieś świeżą stopioną agarozę do wnętrza i wokół próbek, aby unieruchomić tkankę wąsów. Nie przepełniaj dołka. Zanim agaroza stwardnieje, dokonaj ostatecznych korekt ustawienia za pomocą szpilek entomologicznych.
- Umieść ponumerowaną papierową etykietę próbki obok dołka i zabezpiecz ją małą kroplą agarozy.
- Powtórz kroki od 6 do 10 dla każdego dołka z próbkami.
- Jeśli jest to wymagane do kalibracji obrazu, włóż kawałek papieru z wydrukowaną skalą mikrometryczną (np. http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/) na dno pustego dołka. Wygładź papier na dnie dołka i pokryj go ciepłą agarozą.
- Po zatopieniu wszystkich próbek powierzchnia żelu będzie nieregularna, z zastygłymi kroplami agarozy. Połóż żel na płaskiej powierzchni i delikatnie wlej dodatkową stopioną agarozę, aż górna powierzchnia stanie się jednolita. Użyj najmniejszej ilości agarozy niezbędnej do uzyskania gładkiej powierzchni; zbyt duża ilość agarozy utrudni fotografowanie w świetle przechodzącym. Pozostaw tę górną warstwę do stwardnienia.
- Żel można teraz sfotografować na stole stereomikroskopu, aby zarejestrować morfologię makroskopową każdej pary wąsów. Kalibrację obrazu uzyskuje się poprzez sfotografowanie zatopionej skali mikrometrycznej.
- Cały żel można przechowywać zawinięty w mokre ręczniki papierowe i szczelnie zamknięty w plastikowej torbie w temperaturze 4° przez kilka tygodni.
- Do dalszych analiz bloki agarowe zawierające dopasowaną parę wąsów można wyciąć z żelu skalpelem lub ostrzem żyletki i przetworzyć metodą histologii parafinowej lub kriosekcjonowania zgodnie ze standardowymi metodami3,4. Alternatywnie, poszczególne wąsy można wypreparować z agarozy za pomocą cienkich igieł, wypłukać w wodzie i poddać innym aplikacjom (np. immunohistochemii całego preparatu lub mikroskopii konfokalnej).
Dyskusja
Wąsik szczękowy danio pręgowanego jest niewykorzystanym w pełni systemem tkankowym do badania wzrostu, utrzymania i regeneracji kilku typów komórek u tych ryb. Choć wyrostek wąsika nie posiada odpowiednika u ludzi, zawarte w nim typy komórek są wysoce konserwatywne, co umożliwia badanie skóry, gruczołów, melanocytów, naczyń krwionośnych i nerwów w optycznie przejrzystej i anatomicznie prostej strukturze cylindrycznej. Podobnie jak w przypadku dobrze przebadanej płetwy ogonowej, regenerację tkanki wąsika można wywołać poprzez amputację. Wykorzystując brzeg szczęki jako punkt orientacyjny, płaszczyznę amputacji można wyznaczyć precyzyjnie, co ułatwia pomiar odrastania wąsika. Doświadczonemu operatorowi każda operacja zajmuje zaledwie kilka sekund. Rekonwalescencja przebiega szybko i do tej pory nie stwierdziliśmy krótkoterminowych ani długoterminowych skutków wpływających na zachowanie ryb. Danio pręgowane z jednym wąsikiem szczękowym pływają, jedzą i rozmnażają się równie efektywnie jak grupy kontrolne nieoperowane, a ich przeżywalność do czasu pobrania tkanek, nawet do 6 miesięcy po operacji, jest porównywalna. Przewiduje się, że fizjologiczny wpływ tej operacji jest minimalny, ponieważ 1) pozajęzykowe kubki smakowe znajdujące się na wąsiku występują również w wielu innych częściach nabłonka ryby, w tym na wargach, policzkach i głowie5, oraz 2) różnicujące się kubki smakowe pojawiają się na regenerującym się wąsiku w ciągu 72 godzin (LeClair et al., niepublikowane dane). Dzięki temu wąsik szczękowy stanowi małoinwazyjny system do badania gojenia ran, rewaskularyzacji i reinnerwacji w kontekście dorosłego kręgowca.
Po chirurgicznym indukowaniu regeneracji, wąsiki można pobierać w określonych odstępach czasu w celu wykonania pomiarów morfometrycznych i/lub analizy mikroskopowej utrwalonej tkanki. Wąsik szczękowy ma wygodną długość (2-3 mm) i średnicę (100-200 mm), zbliżoną do wymiarów zarodka danio pręgowanego, co ułatwia stosowanie wielu standardowych protokołów, w tym histologii parafiniowej, kriosekcjonowania, immunohistochemii całych preparatów oraz hybrydyzacji in situ. Suma tych cech sprawia, że wąsik szczękowy jest wysoce funkcjonalnym modelem in vivo do badania naprawy i regeneracji tkanek.
Podziękowania
Metody te zostały opracowane przez E.E.L. podczas urlopu naukowego w laboratorium J.T. Wsparcie zapewniły Rada Badawcza Uniwersytetu DePaul oraz grant NIH/NIDCR R01 przyznany J.T. (DE016678). Z wdzięcznością dziękujemy za pomoc Caroline Hunter, techniku ds. opieki nad zwierzętami w placówce zebrafish core facility CMRC, oraz Paulinie Pawluczuk, naszej asystentce laboratoryjnej na studiach licencjackich.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stereomikroskop sekcyjny z prześwietlającym i padającym światłowodowym oświetleniem jest wymagany do przycinania wąsików oraz zatapiania w agarozy | |||
| Woda z systemu hodowli ryb | |||
| 2 zbiorniki do krzyżowania zebrafish | |||
| MS-222 (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoanu; Sigma Chemical #E10521-10G) | |||
| sterylna płytka Petri 120-mm | |||
| mokre ręczniki papierowe | |||
| tępa metalowa szpatułka | |||
| Pinceta Dumont #55 Bio Inox (Fine Science Tools #11255-20) | |||
| Mini-nożyczki sprężynowe Vannasa (Fine Science Tools #15000-00) | |||
| przeciwdrożny środek przeciwgrzybiczy z błękitem metylenowym (Drs. Foster & Smith #CD-905781) | |||
| mały akwariowy siatkowy chwytak do ryb | |||
| 4% paraformaldehyd w 1x fosforanie buforowanym solą (PF-PBS), rozdzielony na probówki stożkowe 50 mL i przechowywany w zamrożeniu w -20°C do momentu użycia | |||
| 1x fosforan buforowany solą (pH 7,27-6) | |||
| szklana kolba 250 mL | |||
| 2% agaroza w wodzie destylowanej | |||
| standardowy mały zestaw do elektroforezy w żelu agarozowym (rozmiar żelu = ok. 10 cm kwadrat) | |||
| grzebień do próbek elektroforetycznych z drobnymi zębami (rozmiar zęba 4 x 1,5 mm) | |||
| ciepła łaźnia wodna (50-60°C) | |||
| taśma laboratoryjna | |||
| czarne emaliowane szpilki entomologiczne, rozmiar 000 (Fine Science Tools #26000-25) | |||
| 1-2 uchwyty do szpilek (Fine Science tools #26016-12) | |||
| 9-calowa szklana pipeta Pasteura | |||
| gruszka lub pompa do pipet | |||
| ręczniki laboratoryjne | |||
| małe papierowe etykiety | |||
| (opcjonalnie) wydrukowana skala kalibracyjna | |||
| mokre ręczniki papierowe | |||
| plastikowy woreczek strunowy | |||
| skalpel/żyletka (do wycinania bloków agarozy) |
Bibliografia
- Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
- Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).
Przedruki i uprawnienia
