Technika jednoczesnej wizualizacji specyficznych dla wirusa limfocytów T CD8+ i komórek zakażonych wirusem in situ

Summary

Technika łącząca barwienie tetramerów in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę przestrzennej bliskości specyficznych dla wirusa limfocytów T CD8+ do ich celów zakażonych wirusem, oraz określenie ilościowych relacji między tymi efektorami immunologicznymi a celami dla wyników infekcji.

Abstract

Uważa się, że liczba i lokalizacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla wirusa w stosunku do liczby i lokalizacji ich zakażonych komórek docelowych ma kluczowe znaczenie w określaniu wyników, które wahają się od klirensu do przewlekłych uporczywych infekcji. Opisujemy tutaj metodę oceny przestrzennych i ilościowych relacji między limfocytami T CD8 + specyficznymi dla wirusa efektora immunologicznego (E) a zakażonymi celami (T), która łączy barwienie tetramerem in situ (IST) w celu wykrycia specyficznych dla wirusa limfocytów T CD8 + i hybrydyzacji in situ (ISH) w celu wykrycia komórek wirusowego RNA + w tkankach, w których toczy się walka między obroną immunologiczną a infekcją. Połączenie barwienia IST i ISH, w skrócie ISTH, umożliwia wizualizację i mapowanie lokalizacji komórek efektorowych i celów immunologicznych oraz łatwe określanie proporcji E:T. Parametry te z kolei można następnie wykorzystać do określenia relacji między bliskością przestrzenną a czasem i wielkością odpowiedzi immunologicznej, które przewidują wyniki we wczesnej infekcji.

Protocol

Ta metoda została użyta w badaniach opisanych w Li et al., Science 323, 1726-1729 (2009).

Połączone procedury barwienia tetramerów in situ i hybrydyzacji in situ (ISTH)

Procedury ISTH można podzielić na 4 etapy: 1) barwienie IST specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ w tkankach; 2) ISH do wykrywania komórek RNA+ zakażonych wirusem; 3) konfokalne obrazowanie mikroskopowe komórek barwionych IST i komórek wirusa-RNA+; 4) analiza obrazu, w tym budowa montaży obrazowych i mapowanie komórek tetrameru+ i RNA+ wirusa.

1. Barwienie IST specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ w skrawkach tkanki.

1. Pokrój świeże tkanki na odcinki o grubości 200 um za pomocą wibratomu lub skalpela.
2. Schłodź kąpiel wibratomową ze sterylnym PBS-H i schłodzić do 0-2° C. Ustaw kąt ostrza wibratomu na dość strome 27°. Jeśli to możliwe, utrzymuj tkanki schłodzone na lodzie, aby zminimalizować degradację. Świeża tkanka jest również łatwiejsza do pokrojenia za pomocą wibratomu, gdy jest schłodzona.
3. Pokrój tkankę nożyczkami chirurgicznymi lub skalpelem na małe kawałki o szerokości około 0,5 cm i wysokości 0,25 cm. Umieść kawałki tkanek w łódce do ważenia lub małym naczyniu i przykryj stopioną 40% PBS, niskotopliwą agarozą o temperaturze ~40°C. Upewnij się, że chusteczka styka się z dnem naczynia. Wepchnij kawałki tkanki w dół, jeśli unoszą się na wodzie. Zestalić na lodzie. Zwykle zajmuje to 3-5 minut.
4. Pokryj blok tkanki wibratomu klejem Loctite. Przetnij agarozę wokół tkanki skalpelem, a następnie za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś delikatną tkankę zatopioną w agarozie na blok wibratomu pokryty klejem. Nie przesuwaj kawałka tkanki po jego umieszczeniu na bloku tkanki. Pozostaw do wyschnięcia na lodzie na około 10 minut.
5. Zamontuj blok tkankowy w wibratomie i pokrój tkankę na odcinki o grubości 200um, używając martwej niskiej prędkości do przodu i stosunkowo wysokiej amplitudy. Ustawienia prędkości i amplitudy różnią się w zależności od wibratomu. Jeśli wibratom nie jest dostępny lub tkanka nie nadaje się do cięcia wibratomem, pokrój tkanki na cienkie paski za pomocą skalpela.
6. Przenieść skrawki pędzlem do komory na tkanki umieszczonej w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 1 ml schłodzonego PBS-H. Umieść do czterech odcinków tkanki w każdej komorze tkankowej. Oznaczyć pokrywkę płytki do hodowli tkankowej informacjami o próbce doświadczalnej i przymocować pokrywkę do płytki gumką recepturką.
7. Alternatywnie, w przypadku tkanek, które nie tną dobrze za pomocą wibratomu, takich jak jelita, można przeciąć jak najcieńsze paski za pomocą skalpela lub żyletki. Umieść tylko jedną sekcję w studzience na sekcje cięte skalpelem.
8. Przystąp do barwienia natychmiast po zakończeniu cięcia tkanek. Sekcje należy przechowywać w chłodzie, aby zminimalizować degradację przez cały czas, aż do naprawienia. Nie pozwól, aby sekcje wyschły. Skrawki należy przechowywać w schłodzonym, sterylnym PBS-H.
9. Inkubować skrawki tkanek przez noc z 0,5 mg/ml sprzężonych tetramerów FITC. Może zawierać przeciwciała mysie lub inne niż królicze skierowane przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym w tej inkubacji, np. przeciwciała anty-CD8, rozcieńczone w stosunku 1:200 w roztworze blokującym. Do tej i wszystkich następnych inkubacji należy użyć 1 ml roztworu na studzienkę, a następnie przeprowadzić tę i wszystkie następne inkubacje w temperaturze 4 °C z płytkami na platformie kołyszącej. Komory tkankowe zawierające różne próbki doświadczalne należy przechowywać oddzielnie od siebie co najmniej jedną pustą studzienką, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu roztworów w kolejnych etapach.
10. Po wstępnej inkubacji przemyć sekcje schłodzonym PBS-H dwukrotnie (2X) przez 20 minut każda. W tym celu należy przenieść komory tkankowe na inną 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą schłodzony PBS-H. Należy uważać, aby nie kapać zawartości z jednej próbki doświadczalnej do drugiej podczas przenoszenia komór na tkanki. We wszystkich kolejnych inkubacjach i przemyciach należy podobnie przenieść komory tkankowe na czystą płytkę zawierającą odpowiedni roztwór. Monitoruj skrawki w komorach tkankowych podczas zabiegu, aby upewnić się, że skrawki nie przyklejają się do boków komór tkankowych.
11. Utrwal skrawki świeżym PBS buforowanym 4% paraformaldehydem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Umyć zimnym PBS-H 2X po 5 min.
12. Inkubować z króliczymi przeciwciałami anty-FITC, np. Biodesign 1:10 000, w roztworze blokującym przez jeden do trzech dni. Do wspólnego znakowania może również obejmować przeciwciała inne niż królicze skierowane na epitopy wewnątrzkomórkowe w tej inkubacji. W przypadku tej opcji w razie potrzeby należy odsłonić epitopy, a przed drugą inkubacją przeniknąć i zablokować komórki.
13. W przypadku stosowania przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom wewnątrzkomórkowym, które wymagają pobrania antygenu z wiązania formaldehydu, należy naświetlić epitopy, gotując 3 razy w 0,01 M mocznika, za każdym razem 10 sekund, w kuchence mikrofalowej. Odczekaj 2 minuty między każdym ogrzewaniem. Bądź bardzo ostrożny, ponieważ wrzący roztwór może wypchnąć sekcje ze studzienek. W takim przypadku należy za pomocą pędzla wepchnąć odcinki z boków komory na chusteczki lub z pokrywy płytki z powrotem na dno odpowiedniej komory na tkanki. Jeśli przeciwciała nie wymagają pobrania antygenu, pomiń ten krok.
14. W przypadku stosowania przeciwciał skierowanych na epitopy wewnątrzkomórkowe, przed drugą inkubacją, należy przeniknąć i zablokować komórki w skrawkach tkanek z PBS-H zawierającym 0,3% trytonu X-100 i 2% normalnej surowicy koziej przez jedną godzinę. Następnie wykonaj pozostałe inkubacje przeciwciał w PBS-H zawierającym 0,3% trytonu X-100 i 2% normalnej surowicy koziej.
15. Po drugiej inkubacji myć sekcje w PBS-H przez 20 minut do kilku godzin. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania. Przeprowadzić końcową inkubację z odpowiednimi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Na przykład kozia anty-królicza-Cy3 i kozia anty-mysia Alexa 488 rozcieńczone 1:1000 każdy w roztworze blokującym. Inkubować przez jeden do trzech dni. Skrawki należy chronić przed światłem, owijając płytki folią aluminiową podczas tej inkubacji i później, gdy światło gasi fluorofory.
16. Myć sekcje w PBS-H przez 20 minut do kilku godzin. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania.
17. W przypadku IST w połączeniu z odcinkami ISH post-fix po utrwaleniu w 4% paraformaldehydzie przez 1 godzinę, aby zabezpieczyć tetramery i przeciwciała na miejscu, a następnie ponownie przepłukać skrawki PBS-H i zamontować.
18. Użyj pędzla, aby przenieść skrawki na szkiełko mikroskopowe. Pokryć każdą sekcję glicerolem/żelatyną zawierającą 4 mg/ml galusanu n-propylu lub innym podłożem montażowym zawierającym środek konserwujący fluorofor i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Szkiełka należy przechowywać w lekko zabezpieczonym pojemniku na szkiełka w temperaturze -20°. Opłucz płytki do hodowli tkankowych i usuń etykiety z pokrywek alkoholem. Może ponownie używać talerzy.
19. Analizuj barwione skrawki tkanek za pomocą mikroskopu konfokalnego. Następnie można przejść do ISH.

2. Wykrywanie komórek RNA+ zakażonych wirusem poprzez hybrydyzację in situ.

Ten protokół hybrydyzacji in situ został zmodyfikowany z naszych poprzednio opublikowanych protokołów^4,5 w następujący sposób:

1. Ponownie wytnij skrawki o grubości 5-8 mikronów z grubych odcinków wybarwionych tetramerem in situ.
   1. Sekcje o grubości 200 mikronów są podgrzewane w temperaturze 70°C przez 5 minut, aby odłączyć sekcję od szkiełka.
   2. Przekrój jest następnie zatapiany w OCT na suchym lodzie.
   3. Sekcje o grubości 8 mikronów są cięte kriostatem z grubych odcinków i przyklejane do silanizowanych szkiełek.
   4. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80°C w szczelnie zamkniętym pudełku w celu późniejszej hybrydyzacji in situ.
2. Hybrydyzacja in situ
   1. Uwodnij skrawki tkanek, zanurzając szkiełka na 3 minuty w 90% etanolu i wodzie uzdatnionej DEPC.
   2. Przepuszczalność skrawków tkanek poprzez ogrzewanie w 10 mM buforze cytrynianowym (pH 6,0) w temperaturze 98°C w łaźni wodnej przez 15 minut.
   3. Schłodzić skrawki tkanki w temperaturze pokojowej przez 20-30 min.
   4. Umyć dwukrotnie w wodzie uzdatnionej przez DEPC przez 3 minuty.
   5. Wycinek tkanki acetylowej zanurzając szkiełka w 0,25% bezwodniku octowym w 0,1 M TEA (trietanoloamina, pH 8,0) na 10 min.
   6. Przenieś szkiełka do 0,1 M herbaty (pH 8,0) na 5 minut.
   7. Hybrydyzuj skrawki z ³⁵znakowanymi S sondami antysensownymi lub sensem specyficznymi dla wirusa (takimi jak HIV-1, SIV) (kontrola negatywna dla HIV-1, SIV) lub ³⁵rybosondami LCMV znakowanymi S (łączone wyczucie i antysens).
   8. Przemyć skrawki dwukrotnie preparatem 2xSSC przez 5 minut po nocnej hybrydyzacji w temperaturze 42°C.
   9. Myć sekcje w STE (0,5 M NaCL, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7,5) przez 5 min.
   10. Trawienie skrawków z RNazami A i T1 w STE w temperaturze 37°C przez 30 min
   11. Myć sekcje w 2x SSC plus 50% formamidu przez 5 min.
   12. Mycie sekcji w 1x SSC 10 min.
   13. Mycie sekcji w 0,5 x SSC 15 min.
   14. Sekcje odwadniania w 70, 80 i 100% etanolu zawierającym 0,3 M octanu amonu, co 5 minut.
   15. Sekcje płaszcza z jądrową emulsją torową
   16. Suszyć w ciemnym pomieszczeniu przez 1 godzinę.
   17. Skrawki należy naświetlać w temperaturze 4°C przez 11 dni (SIV) i 3 dni (LCMV).
   18. Wywołaj sekcje w D19 (Kodak, Cat# 146 4593) przez 3 min, umyj w dH2O 30 sekund, utrwal w Rapid Fixer (Kodak, Cat# 146 4106) przez 4 min, umyj w dH2O 5 min x 3 razy.
   19. Odwodnić w 70%, 80% i absolutnym etanolu, po 5 minut każdy.
   20. Zamontuj slajdy w kompatybilnym ze świetlówkami medium Permount.

3. Zdobądź obrazy z mikroskopu konfokalnego.

1. Przechwytuj obrazy ISTH za pomocą mikroskopu konfokalnego Bio-Rad MRC 1000 lub dowolnego innego mikroskopu konfokalnego z urządzeniem Epi2-Blue Reflection.
2. Użyj Epi1-605 dla czerwonego tetrameru fluorochromowego, Epi2-522 DF32 dla zielonego fluorochromu CD8 i Epi2-Blue Reflection dla ziaren srebra (sygnał ISH w opracowanych radioautografach) przy 20x (dla SIV) lub 60x (dla LCMV)
3. Sekwencyjnie zbieraj obrazy szeregowe Z w odstępach 1 mikrona w trzech kanałach każdego pola.
4. Uzyskaj obrazy z każdej sekcji od lewej do prawej i od góry do dołu, a następnie nazwij każdy obraz zgodnie z jego wierszem i kolumną w pliku programu Excel.
5. Uchwyć każdy obraz z ~20% nałożeniem na sąsiednie obrazy, aby uniknąć luk w zrekonstruowanym obrazie montażowym.

4. Analizy obrazów: montaż rekonstrukcji obrazu, obliczanie centroidy komórek i analiza przestrzenna.

1. Rzutuj obrazy szeregowe Z na jeden obraz dla każdego kanału za pomocą Confocal Assistant (wersja 4.02.).
2. Obraz wyświetlany z trzech kanałów można automatycznie scalić w jeden obraz RGB za pomocą procedury operacji programu Photoshop 7.0.
3. Wygeneruj obraz montażowy, łącząc scalone obrazy w warstwy w programie Photoshop 7.0.
4. Powiąż poszczególne ziarna srebra i barwienie tetrameru z komórkami i przypisz współrzędne X,Y centrów (centroidów) komórek SIV RNA+ i tetramer+, używając MetaMorph (wersja 7.1.3.) lub Photoshop (dostępny u autora)
5. Eksportuj dane centroidów do plików programu Excel jako liczby liczbowe dla każdej komórki. Współczynniki E:T są określane z plików Excel na podstawie całkowitej liczby komórek tetrameru+ i wirusowego RNA+ w sekcji.

Przestrzenne relacje między czerwonymi komórkami tetramer+ i niebieskiego SIV RNA+ są rejestrowane poprzez kopiowanie i wklejanie odpowiednich wykresów z plików Excel do dokumentu Photoshopa. Po zmniejszeniu nieprzezroczystości warstwy w celu wyrównania i przeskalowania siatek tak, aby się pokrywały, wybraniu kolorów oraz skopiowaniu i wklejeniu do nowej warstwy pozycji niebieskich komórek RNA+, a następnie odrzuceniu warstwy użytej do wyrównania siatek, pozycje komórek tetrameru+ i wirusowego RNA+ zostaną ujawnione na spłaszczonym obrazie.

5. Dodatkowe uwagi

Jeśli przecinasz zakaźną tkankę:

Praca w laboratorium BSL2.5. Podejmij specjalne środki ostrożności przy użyciu żyletek. Włóż maszynkę do golenia w mocowaniu ostrza wibratomu za pomocą kleszczy. Jeśli nie możesz włożyć ostrza za pomocą kleszczy, włóż je przed dodaniem chusteczki do kąpieli i nie wymieniaj ostrza. Po zakończeniu cięcia zdejmij ostrze za pomocą kleszczy. Spryskaj ostrze 70% EtOH lub DMQ przed usunięciem. Jak zawsze, wyrzuć ostrza do pojemnika na ostre przedmioty. Zmienić rękawice zewnętrzne lub spłukać w środku dezynfekującym po każdym kontakcie z tkanką lub zanieczyszczonym PBS w zbiorniku. Po zakończeniu, jeśli pracujesz z materiałem zakaźnym, dodaj środek dezynfekujący DMQ do PBS w zbiorniku i pozostaw na kilka minut przed usunięciem. Odkażony PBS należy wyrzucić do kanalizacji. Następnie wypłucz zbiornik wodą, aby usunąć sól i środek dezynfekujący. Wyczyść przestrzeń roboczą i przybory kuchenne za pomocą DMQ. Opłucz naczynia wodą.

Aby zrobić tetramery z biotynylowanych monomerów MHC:

Otrzymaj biotynylowane cząsteczki MHC klasy I, takie jak HLA-A *0201/B₂m/peptyd wytwarzane z peptydów Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV) lub nieistotnych peptydów MART (ELAGIGILTV) od Beckman Coulter. Biotynylowane cząsteczki HLA-A *0301/B₂m/peptyd wytwarzane za pomocą Gag (KIRLRPGGK) lub Nef (QVPLRPMTYK) w zakładzie tetramerów NIAID. Tetramery są generowane przez dodanie 6 podwielokrotności znakowanej FITC ExtraAvidin (Sigma) do biotynylowanych monomerów Mamu A*01/B₂m/peptyd w ciągu 8 godzin do końcowego stosunku molowego 4,5:1. Uzasadnieniem powolnego dodawania ekstrawidyny jest to, że we wczesnych punktach czasowych występuje nadmiar monomeru, co zapewnia, że cała dodana ekstrawidyna wiąże się ze wszystkimi czterema miejscami biotyny. W późniejszej fazie reakcji proces ten jest mniej wydajny, ponieważ pozostaje mniej monomeru i większa szansa, że ExtrAvidin nie będzie miał związanych wszystkich 4 miejsc. Gdyby dodać całą ekstrywajdynę na raz, reakcja byłaby mniej wydajna, a więcej cząsteczek ekstrawidyny miałoby przyłączone tylko 2 lub 3 monomery.

Discussion

Ponieważ RNA wirusa jest używane jako marker dla komórek zakażonych wirusem w tym raporcie, wszystkie odczynniki przed hybrydyzacją powinny być wolne od RNAazy. Opisana tutaj procedura hybrydyzacji in situ została zmodyfikowana w celu zachowania sygnału fluorescencyjnego z barwienia tetramerów in situ. Ponieważ sygnał radiologiczny z komórek zakażonych wirusem wykrywany przez hybrydyzację in situ znajduje się na głębokości około jednej średnicy komórki, grube odcinki używane do barwienia tetramerów in situ muszą być ponownie pocięte na odcinki o grubości 5-8 mikronów.

Ta nowatorska technika łączenia tetramerów in situ i hybrydyzacji in situ (ISTH) opisana tutaj umożliwia jednoczesną wizualizację, mapowanie i analizę relacji przestrzennych limfocytów T CD8+ specyficznych dla wirusa i komórek docelowych zakażonych wirusem. Metoda ta może być stosowana do oceny szczepionki opartej na limfocytach T CD8 + oraz w innych interakcjach patogenów i gospodarzy niezwiązanych z wirusem. Opisana tutaj metoda analizy obrazu może być również zaadaptowana do badania relacji przestrzennych dowolnych populacji dwukomórkowych oddziałujących in situ, np. ostatnio zastosowaliśmy procedurę mapowania centroidów w badaniu transmisji płciowej HIV-1 w modelu małpiego wirusa niedoboru odporności u makaków rezusów u naczelnych⁶

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roztwory i odczynniki:
PBS-H Sól fizjologiczna buforowana fosforanem zawierająca heparynę (100ug/ml lub 18,7U/ml) w celu zahamowania RNAS RPMI pożywki do hodowli tkankowej zawierające heparynę (100ug/ml lub 18,7U/ml) w celu zahamowania RNAS 4% niskotopliwej agarozy w PBS PBS z 2% normalna surowica kozia (lub surowica z gatunków, w których wytworzono przeciwciała sprzężone z fluoroforem). PBS z 2% normalną surowicą kozią i 0,3% trytonem X-100 MHC tetramery klasy I sprzężone z przeciwciałami FITC Anty-FITC, np. IgG anty-króliczej anty-FITC Fluorophor sprzężonej z fluoroforem, która została silnie zaadsorbowana krzyżowo z innymi gatunkami IgG do stosowania z wielokrotnym znakowaniem, np. kozio-anty-króliczo-Cy3 Fluorophore sprzężony anty-mysi IgG, który został silnie zaadsorbowany krzyżowo z innymi gatunkami IgG do stosowania z wielokrotnym znakowaniem Fresh PBS buforowany 4% paraformaldehydu 0,01M Mocznik Glicerol/żelatyna zawierająca 4 mg/ml galusanu n-propylu
Sprzęt specjalny
Vibratome Skalpel Żyletki Nożyczki chirurgiczne Loctite Quick Set Instant Adhesive (produkt # 46551) Kleszcze #2 pędzle do malowania włosów wielbłąda. Można przycinać żyletką do żądanej grubości 24-dołkowe płaskodenne płytki do hodowli tkankowych, np. Falcon katalog #353226 Komory tkankowe Folia aluminiowa Tekturowy folder slajdów, np. Fisher katalog#12-587-10 Mikroskop konfokalny
Odczynniki IST Krótki przewodnik
PBS-H (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z heparyną)
450 ml 1X PBS 50 ml 1X PBS + 10X heparyna
1x PBS + 10X heparyna
500 ml 1X PBS 500 mg heparyny w proszku (znalezione na półce do przechowywania suchych chemikaliów)
PBS-H/ 2% NGS (normalna surowica kozia)
49 ml PBS-H w probówce Falcon 1 ml NGS (znajduje się w podwielokrotnościach 1 ml w zamrażarce -20)
PBS-H/ 2% NGS/ 0,3% Triton X-100
49 ml PBS-H/ 0,3% Triton X-100 w probówce Falcon 1 ml NGS (znajduje się w 1 ml porcjach w zamrażarce -20)
PBS-H/ 0,3% Triton X-100
500 ml PBS-H 1,5 ml Triton X-100 (jest to gęsty płyn znajdujący się na półkach do przechowywania suchych chemikaliów)
4% LMP Agaroza
2 g LMP agaroza w proszku 50 ml PBS Wstrząsaj do wymieszania, kuchenka mikrofalowa, aż proszek się rozpuści.
GG-NPG (żelatyna glicerolowa z galalanem n-propylu
Umieść butelkę żelatyny glicerolowej w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni, aby się rozpuściła Dodaj 0,06 g galanu propylu (znajdującego się na półce Terri), dobrze wstrząsnąć Przechowywać w łaźni wodnej, od czasu do czasu wstrząsając, aż się rozpuści. Porcjować do 1 ml probówek (brązowe tuby)
4% paraformaldehydu
4 g paraformaldehydu w proszku (znalezionego na suchych półkach do przechowywania chemikaliów) Umieść około 10 ml PBS-H w cylindrze z podziałką dodać proszek PF Dodaj trochę wody, aż objętość osiągnie około 70 ml Dodać jeden zakraplacz NaOH. Mieszać aż do rozpuszczenia (zwykle około 20-30 minut) Dodaj HCl, aż pH osiągnie wartość między 7-8. Doprowadzić objętość do 100 ml wodą.
Mocznik 0,01 M
0,3 g mocznika (znalezionego na półkach do przechowywania suchych chemikaliów) 500 ml wody