Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Podsumowanie

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Streszczenie

Uważa się, że liczebność i rozmieszczenie wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ w stosunku do liczby i lokalizacji zainfekowanych komórek docelowych mają krytyczne znaczenie dla rozstrzygnięcia przebiegu infekcji, od całkowitego wyeliminowania patogenu po przewlekłe zakażenia utrwalone. Opisujemy tutaj metodę oceny przestrzennych i ilościowych zależności między efektorowymi (E) wirusowo-specyficznymi limfocytami T CD8+ a zainfekowanymi celami (T), która łączy barwienie tetramerami in situ (IST) w celu wykrycia wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ z hybrydyzacją in situ (ISH) w celu wykrycia komórek z obecnością viral-RNA+ w tkankach, w których toczy się walka między mechanizmami obronnymi odporności a infekcją. Połączenie barwienia IST i ISH, skrótowo określane jako ISTH, umożliwia wizualizację i mapowanie lokalizacji efektorowych komórek odpornościowych oraz celów, a także łatwe wyznaczenie stosunku E:T. Parametry te mogą następnie posłużyć do określenia zależności między bliskością przestrzenną a czasem i skalą odpowiedzi immunologicznej, co pozwala na prognozowanie wyników wczesnej fazy infekcji.

Protokół

Metoda ta została wykorzystana w badaniach opisanych w pracy Li et al., Science 323, 1726-1729 (2009).

Procedury połączonego barwienia tetramerami in situ i hybrydyzacji in situ (ISTH)

Procedury ISTH można podzielić na 4 etapy: 1) barwienie IST antygenowo-specyficznych limfocytów T CD8+ w tkankach; 2) ISH w celu wykrycia komórek z obecnością RNA wirusa zainfekowanych przez wirusa; 3) obrazowanie mikroskopowe konfokalne komórek zabarwionych metodą IST oraz komórek RNA+ wirusa; 4) analiza obrazów, obejmująca tworzenie montaży obrazów oraz mapowanie komórek tetramer+ i komórek RNA+ wirusa.

1. Barwienie IST swoistych dla antygenu limfocytów T CD8+ w przekrojach tkanek.

1. Przygotować świeże tkanki, wycinając sekcje o grubości 200 µm za pomocą wibratomu lub skalpela.
2. Kąpiel wibratoma należy schłodzić sterylnym PBS-H do temperatury 0-2°C. Ustawić kąt ostrza wibratoma na dość stromy, wynoszący 27°. W miarę możliwości utrzymać tkanki w niskiej temperaturze na lodzie, aby zminimalizować degradację. Schłodzona świeża tkanka jest również łatwiejsza do sekcjonowania za pomocą wibratoma.
3. Wyciąć tkankę nożyczkami chirurgicznymi lub skalpelem na małe kawałki o szerokości około 0,5 cm i wysokości 0,25 cm. Umieścić kawałki tkanki w naczyniu do ważenia lub małej szalce i przykryć roztopioną w temperaturze ~40°C 4% agarozą o niskiej temperaturze topnienia w buforze PBS. Upewnić się, że tkanka styka się z dnem naczynia. Docisnąć kawałki tkanki, jeśli wypływają na powierzchnię. Pozostawić na lodzie do zastygnięcia, co zazwyczaj zajmuje 3-5 minut.
4. Pokryć blok tkankowy do wibratoma klejem Loctite. Wyciąć agarozę wokół tkanki skalpelem, a następnie za pomocą pęsety ostrożnie przenieść delikatną tkankę zatopioną w agarozie na blok wibratoma pokryty klejem. Nie przesuwać kawałka tkanki po jego osadzeniu na bloku. Pozostawić do wyschnięcia przez około 10 minut na lodzie.
5. Zamocować blok tkankowy w wibratomie i wyciąć sekcje o grubości 200 µm, stosując bardzo małą prędkość przesuwu do przodu i stosunkowo dużą amplitudę. Ustawienia prędkości i amplitudy różnią się w zależności od wibratoma. Jeśli wibratom nie jest dostępny lub tkanka nie nadaje się do sekcjonowania wibratomem, pociąć tkanki na cienkie paski za pomocą skalpela.
6. Przenieść sekcje pędzlem do komór tkankowych umieszczonych w dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek zawierającej 1 ml schłodzonego PBS-H. Umieścić do czterech sekcji tkanki w każdej komorze. Opisać pokrywkę płytki informacjami o próbce badawczej i zabezpieczyć ją gumką recepturką.
7. Alternatywnie, w przypadku tkanek, które nie dają się dobrze ciąć wibratomem (np. jelito), można wyciąć skalpelem lub żyletką paski tak cienkie, jak to możliwe. W przypadku sekcji ciętych skalpelem umieszczać tylko jedną sekcję na dołek.
8. Przejść do barwienia natychmiast po zakończeniu cięcia tkanek. Przez cały czas do momentu utrwalenia utrzymywać sekcje w niskiej temperaturze, aby zminimalizować degradację. Nie dopuścić do wyschnięcia sekcji. Przechowywać sekcje w schłodzonym sterylnym PBS-H.
9. Inkubować sekcje tkanek przez noc z tetramerami sprzężonymi z FITC w stężeniu 0,5 mg/ml. W tej inkubacji można zastosować przeciwciała mysie lub niekrólicze skierowane przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym, np. przeciwciała anty-CD8 rozcieńczone 1:200 w roztworze blokującym. Do tej i wszystkich kolejnych inkubacji używać 1 ml roztworu na dołek i przeprowadzać je w temperaturze 4°C na platformie kołyszącej. Komory tkankowe z różnymi próbkami badawczymi należy oddzielić od siebie co najmniej jednym pustym dołkiem, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej roztworów w kolejnych krokach.
10. Po inkubacji pierwotnej przemyć sekcje schłodzonym PBS-H dwukrotnie (2X), po 20 minut za każdym razem. Należy to zrobić, przenosząc komory tkankowe do innej 24-dołkowej płytki zawierającej schłodzony PBS-H. Podczas przenoszenia komór uważać, aby nie wkapać zawartości jednej próbki do drugiej. Podczas wszystkich kolejnych inkubacji i płukań w podobny sposób przenosić komory tkankowe do czystej płytki z odpowiednim roztworem. Monitorować sekcje w komorach podczas procedury, aby upewnić się, że nie przywarły do ścianek komór tkankowych.
11. Utrwalić sekcje w świeżym 4% paraformaldehydzie w buforze PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przemyć zimnym PBS-H 2X po 5 min każdorazowo.
12. Inkubować z króliczymi przeciwciałami anty-FITC, np. Biodesign 1:10 000, w roztworze blokującym przez okres od jednego do trzech dni. W przypadku podwójnego znakowania w tej inkubacji można również zastosować przeciwciała niekrólicze skierowane przeciwko epitopom wewnątrzkomórkowym. W takim przypadku, jeśli jest to konieczne, odsłonić epitopy, a następnie permeabilizować i blokować komórki przed drugą inkubacją.
13. W przypadku stosowania przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom wędzkomórkowym, które wymagają odzyskiwania antygenów po utrwalaniu formaldehydem, odsłonić epitopy poprzez gotowanie 3 razy w 0,01 M moczniku, po 10 sekund za każdym razem, w kuchence mikrofalowej. Odczekać 2 minuty między kolejnymi podgrzewaniami. Zachować szczególną ostrożność, ponieważ wrzący roztwór może wypchnąć sekcje z dołków. Jeśli tak się stanie, użyć pędzla, aby przesunąć sekcje ze ścianek komory tkankowej lub z pokrywki płytki z powrotem na dno odpowiedniej komory. Jeśli przeciwciała nie wymagają odzyskiwania antygenów, pominąć ten krok.
14. W przypadku stosowania przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom wewnątrzkomórkowym, przed drugą inkubacją permeabilizować i blokować komórki w sekcjach tkanek w PBS-H zawierającym 0,3% triton X-100 i 2% normalnego surowicy koziej przez jedną godzinę. Następnie przeprowadzić pozostałe inkubacje przeciwciał w PBS-H zawierającym 0,3% triton X-100 i 2% normalnej surowicy koziej.
15. Po drugiej inkubacji przemywać sekcje w PBS-H od 20 minut do kilku godzin. Powtórzyć dwukrotnie, łącznie wykonując trzy płukania. Przeprowadzić końcową inkubację z odpowiednimi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie. Na przykład kozi anty-rabbit-Cy3 i kozi anty-mouse-Alexa 488 rozcieńczone 1:1000 każdy w roztworze blokującym. Inkubować od jednego do trzech dni. Chronić sekcje przed światłem, owijając płytki folią aluminiową podczas tej inkubacji i później, ponieważ światło gasi fluorofory.
16. Przemywać sekcje w PBS-H od 20 minut do kilku godzin. Powtórzyć dwukrotnie, łącznie wykonując trzy płukania.
17. W przypadku połączenia IST z ISH, poddać sekcje ponownemu utrwaleniu w 4% paraformaldehydzie przez 1 godzinę, aby unieruchomić tetramery i przeciwciała, a następnie ponownie opłukać sekcje w PBS-H i zamontować.
18. Użyć pędzla do przeniesienia sekcji na szkiełko mikroskopowe. Pokryć każdą sekcję gliceryną/żelatyną zawierającą 4 mg/ml n-propylan gallate lub innym medium montażowym zawierającym konserwant fluoroforu i przykryć szkiełkiem cover slip. Przechowywać preparaty w pojemniku chroniącym przed światłem w temperaturze -20°. Opłukać płytki do hodowli tkanek i usunąć etykiety z pokrywek za pomocą alkoholu. Płytki można ponownie wykorzystać.
19. Przeanalizować zabarwione sekcje tkanek za pomocą mikroskopu konfokalnego. Następnie można przystąpić do ISH.

2. Wykrywanie komórek zainfekowanych wirusem RNA+ za pomocą hybrydyzacji in situ.

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ został zmodyfikowany z naszych wcześniej opublikowanych protokołów^4,5 w następujący sposób:

1. Ponowne wycinanie sekcji o grubości 5-8 µm z grubych sekcji barwionych tetramerem in situ.
   1. Sekcje o grubości 200 µm podgrzewa się w temperaturze 70°C przez 5 min, aby oddzielić preparat od szkiełka.
   2. Następnie sekcję zatapia się w OCT na suchym lodzie.
   3. Z grubych sekcji za pomocą kriotomu wycina się sekcje o grubości 8 µm i przykleja je do zsilanizowanych szkiełek.
   4. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80°C w szczelnym pudełku do późniejszej hybrydyzacji in situ.
2. Hybrydyzacja in situ
   1. Rehydratyzację sekcji tkanek przeprowadza się poprzez zanurzenie szkiełek na 3 min każdorazowo w 90% etanolu i wodzie traktowanej DEPC.
   2. Permeabilizację sekcji tkanek wykonuje się poprzez podgrzewanie w 10mM buforze cytrynianowym (pH 6.0) w temperaturze 98°C w kąpieli wodnej przez 15 min.
   3. Sekcje tkanek chłodzi się w temperaturze pokojowej przez 20-30 min.
   4. Przemywa się dwukrotnie wodą traktowaną DEPC przez 3 min.
   5. Acetylację sekcji tkanek przeprowadza się poprzez zanurzenie szkiełek w 0,25% bezwodniku octowym w 0,1 M TEA (trietanolaminie, pH 8.0) przez 10 min.
   6. Szkiełka przenosi się do 0,1 M TEA (pH 8.0) na 5 min.
   7. Sekcje hybrydyzuje się z oznakowaną ³⁵S specyficzną dla wirusa (np. HIV-1, SIV) sondą antysensowną lub sensowną (kontrola negatywna dla HIV-1, SIV), lub oznakowanymi ³⁵S ryboprobami LCMV (połączone sensowne i antysensowne).
   8. Po nocnej hybrydyzacji w 42°C sekcje przemywa się dwukrotnie 2xSSC przez 5 min.
   9. Sekcje przemywa się w STE (0,5 M NaCl, 1mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7.5) przez 5 min.
   10. Sekcje trawi się RNazami A i T1 w STE w 37°C przez 30 min.
   11. Sekcje przemywa się w 2x SSC z dodatkiem 50% formamidu przez 5 min.
   12. Sekcje przemywa się w 1x SSC przez 10 min.
   13. Sekcje przemywa się w 0,5 x SSC przez 15 min.
   14. Sekcje dehydratyzuje się w 70%, 80% i 100% etanolu zawierającym 0,3 M octanu amonu, po 5 min w każdym roztworze.
   15. Sekcje pokrywa się emulsją śladów jądrowych.
   16. Suszy się w ciemni przez 1 godzinę.
   17. Ekspozycję sekcji przeprowadza się w 4°C przez 11 dni (SIV) i 3 dni (LCMV).
   18. Sekcje wywołuje się w D19 (Kodak, Kat# 146 4593) przez 3 min, przemywa w dH2O przez 30 sekund, utrwala w Rapid Fixer (Kodak, Kat# 146 4106) przez 4 min i przemywa w dH2O 3 razy po 5 min.
   19. Dehydratyzuje się w 70%, 80% i etanolu absolutnym, po 5 min w każdym.
   20. Szkiełka montuje się w kompatybilnym z fluorescencją medium Permount.

3. Pozyskanie obrazów za pomocą mikroskopu konfokalnego.

1. Należy wykonać obrazy ISTH za pomocą konfokalnego mikroskopu Bio-Rad MRC 1000 lub dowolnego innego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w urządzenie Epi2-Blue Reflection.
2. Należy użyć Epi1-605 dla czerwonego fluorochromu tetrameru, Epi2-522 DF32 dla zielonego fluorochromu CD8 oraz Epi2-Blue Reflection dla ziaren srebra (sygnał ISH w wywołanych radiogramach) przy powiększeniu 20x (dla SIV) lub 60x (dla LCMV).
3. Należy sekwencyjnie gromadzić obrazy seryjne w osi Z w odstępach 1-mikronowych w trzech kanałach każdego pola.
4. Należy pozyskiwać obrazy z każdego przekroju od lewej do prawej i od góry do dołu, a następnie nazwać każdy obraz zgodnie z jego wierszem i kolumną w pliku Excel.
5. Każdy obraz należy uchwycić z około 20% nakładaniem na obrazy sąsiednie, aby uniknąć luk w zrekonstruowanym obrazie montażowym.

4. Analizy obrazów: rekonstrukcja obrazu mozaikowego, obliczanie centroidów komórek i analiza przestrzenna.

1. Rzutuj obrazy Z-serialne w jeden obraz dla każdego kanału za pomocą programu Confocal Assistant (wersja 4.02.).
2. Automatycznie połącz rzutowany obraz z trzech kanałów w jeden obraz RGB, stosując procedurę Action w programie Photoshop 7.0.
3. Utwórz obraz montażowy poprzez zszywanie połączonych obrazów w warstwach w programie Photoshop 7.0.
4. Przypisz poszczególne ziarna srebra i barwienie tetramerem do komórek oraz wyznacz współrzędne X,Y środków (centroidów) komórek SIV RNA+ i tetramer+, używając programu MetaMorph (wersja 7.1.3.) lub Photoshop (dostępny u autora).
5. Eksportuj dane centroidów do plików Excel jako wartości numeryczne dla każdej komórki. Stosunki E:T są wyznaczane na podstawie plików Excel z całkowitej liczby komórek tetramer+ i viral RNA+ w preparacie.

Relacje przestrzenne między czerwonymi komórkami tetramer+ a niebieskimi komórkami SIV RNA+ rejestruje się poprzez kopiowanie i wklejanie odpowiednich wykresów z plików Excel do dokumentu Photoshop. Po zmniejszeniu nieprzezroczystości warstwy w celu wyrównania i przeskalowania siatek tak, aby się pokrywały, wybraniu koloru oraz skopiowaniu i wklejeniu pozycji niebieskich komórek RNA+ do nowej warstwy, a następnie usunięciu warstwy służącej do wyrównania siatek, pozycje komórek tetramer+ i viral RNA+ zostaną ujawnione na spłaszczonym obrazie.

5. Uwagi dodatkowe

W przypadku cięcia tkanki zakaźnej:

Pracuj w laboratorium klasy BSL2.5. Zachowaj szczególną ostrożność podczas posługiwania się żyletkami. Umieść żyletkę w uchwycie noża wibratomu za pomocą pęsety. Jeśli nie możesz założyć ostrza pęsetą, zrób to przed dodaniem tkanki do kąpieli i nie wymieniaj ostrza w trakcie pracy. Po zakończeniu krojenia usuń ostrze pęsetą. Przed usunięciem spryskaj ostrze 70% EtOH lub DMQ. Jak zawsze, utylizuj ostrza w pojemniku na odpady ostre. Zmieniaj zewnętrzne rękawiczki lub płucz je w środku dezynfekującym po każdym kontakcie z tkanką lub zanieczyszczonym PBS w zbiorniku. Po zakończeniu pracy, jeśli używany był materiał zakaźny, dodaj środek dezynfekujący DMQ do PBS w zbiorniku i odczekaj kilka minut przed usunięciem. Zdekontaminowany PBS wylej do odpływu. Następnie wypłucz zbiornik wodą, aby usunąć sól i środek dezynfekujący. Oczyść miejsce pracy i przyrządy za pomocą DMQ. Wypłucz przyrządy wodą.

Aby przygotować tetramery z biotynylowanych monomerów MHC:

Należy pozyskać biotynilowane cząsteczki MHC klasy I, takie jak cząsteczki HLA-A *0201/B₂m/peptyd wytwarzane z peptydami Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV) lub nieistotnym peptydem MART (ELAGIGILTV) z firmy Beckman Coulter. Biotynilowane cząsteczki HLA-A *0301/B₂m/peptyd wytwarzane z Gag (KIRLRPGGK) lub Nef (QVPLRPMTYK) można pozyskać z zakładu tetramerów NIAID. Tetramery generuje się poprzez dodawanie 6 aliquotów ExtraAvidyny (Sigma) znakowanej FITC do biotynilowanych monomerów Mamu A*01/B₂m/peptyd w ciągu 8 godzin, aż do uzyskania końcowego stosunku molowego 4,5:1. Uzasadnieniem powolnego dodawania ExtraAvidyny jest fakt, że w początkowych punktach czasowych występuje nadmiar monomeru, co zapewnia, że cała dodana ExtraAvidyna wiąże wszystkie cztery miejsca biotyny. W późniejszej fazie reakcji proces ten jest mniej efektywny, ponieważ pozostaje mniej monomeru i wzrasta prawdopodobieństwo, że ExtraAvidyna nie będzie miała związanych wszystkich 4 miejsc. Gdyby dodać całą ExtraAvidynę naraz, reakcja byłaby mniej wydajna, a więcej cząsteczek ExtraAvidyny miałoby przyłączone tylko 2 lub 3 monomery.

Dyskusja

Ponieważ w niniejszym raporcie RNA wirusa służy jako marker komórek zainfekowanych wirusem, wszystkie odczynniki stosowane przed hybrydyzacją powinny być wolne od RNazy. Opisana tutaj procedura hybrydyzacji in situ została zmodyfikowana w celu zachowania sygnału fluorescencyjnego z barwienia tetramerem in situ. Ponieważ sygnał radioautograficzny z komórek zainfekowanych wirusem wykrytych metodą hybrydyzacji in situ znajduje się na głębokości około średnicy jednej komórki, grube skrawki użyte do barwienia tetramerem in situ muszą zostać ponownie pocięte na skrawki o grubości 5-8 µm.

Opisana tutaj nowatorska technika łącząca tetramery in situ oraz hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia jednoczesną wizualizację, mapowanie i analizę relacji przestrzennych między swoistymi dla wirusa limfocytami T CD8+ a zainfekowanymi wirusem komórkami docelowymi. Metoda ta może być stosowana do oceny szczepionek opartych na limfocytach T CD8+ oraz w badaniach innych interakcji między gospodarzem a patogenami niebędącymi wirusami. Opisana tutaj metoda analizy obrazu może zostać również dostosowana do badania relacji przestrzennych dowolnych dwóch populacji komórek oddziałujących in situ; na przykład niedawno zastosowaliśmy procedurę mapowania centroidów w badaniu transmisji HIV-1 drogą płciową w modelu małp niehumanoidalnych zakażonych wirusem niedoboru odporności u małp u makaków rhesus⁶

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwory i odczynniki:
PBS-H: roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo z dodatkiem heparyny (100 µg/ml lub 18,7 U/ml) w celu zahamowania aktywności RNaz pożywka do hodowli tkankowych RPMI zawierająca heparynę (100 µg/ml lub 18,7 U/ml) w celu zahamowania aktywności RNaz 4% nisko topiąca się agaroza w PBS PBS z 2% normalnym surowicą kozią (lub surowicą gatunku, z którego pochodziły przeciwciała koniugowane z fluoroforem) PBS z 2% normalną surowicą kozią i 0,3% Triton X-100 tetramery MHC klasy I koniugowane z FITC przeciwciała anty-FITC, np. królicze anty-FITC firmy BioDesign koniugowane z fluoroforem przeciwciała anty-królicze IgG, silnie adsorbowane krzyżowo względem IgG innych gatunków, do zastosowania w wielokrotnym znakowaniu, np. kozie anty-królicze Cy3 koniugowane z fluoroforem przeciwciała anty-mysie IgG, silnie adsorbowane krzyżowo względem IgG innych gatunków, do zastosowania w wielokrotnym znakowaniu świeżo przygotowana 4% paraformaldehyd w buforze PBS 0,01 M mocznika mieszanina glicerolu i żelatyny zawierająca 4 mg/ml n-propylogalanianu
Specjalistyczny sprzęt
Wibratom Skalpel Żyletki Nożyczki chirurgiczne Błyskawiczny klej Loctite Quick Set (produkt nr 46551) Pinceta Pędzle z włosia wielbłądziego nr 2. Można przyciąć żyletką do pożądanej grubości 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowej z płaskim dnem, np. Falcon katalog nr 353226 Komory tkankowe Folia aluminiowa Tekturowe etui na szkiełka, np. Fisher katalog nr 12-587-10 Mikroskop konfokalny
Szybka referencja odczynników IST
PBS-H (roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo z heparyną)
450 ml 1X PBS 50 ml 1X PBS + 10X heparyny
1x PBS + 10X heparyny
500 ml 1X PBS 500 mg heparyny w proszku (przechowywanej na półce z odczynnikami suchymi)
PBS-H/ 2% NGS (normalna surowica kozia)
49 ml PBS-H w probówce Falcon 1 ml NGS (dostępne w 1 ml alikwotach w zamrażarce -20°C)
PBS-H/ 2% NGS/ 0,3% Triton X-100
49 ml PBS-H/ 0,3% Triton X-100 w probówce Falcon 1 ml NGS (dostępne w 1 ml alikwotach w zamrażarce -20°C)
PBS-H/ 0,3% Triton X-100
500 ml PBS-H 1,5 ml Triton X-100 (jest to gęsta ciecz przechowywana na półkach z odczynnikami suchymi)
4% LMP Agaroza
2 g proszku LMP agarozy 50 ml PBS Wstrząsać do wymieszania, podgrzewać w mikrofalówce do rozpuszczenia proszku.
GG-NPG (glicerol żelatyna z n-propylogalanianem)
Umieścić butelkę glicerolożelatyny w kąpieli wodnej o temperaturze 50°C w celu stopienia Dodać 0,06 g propylogalanianu (znajdującego się na półce Terri), dobrze wstrząsnąć Przechowywać w kąpieli wodnej, okresowo wstrząsając do czasu rozpuszczenia. Rozdzielić do probówek 1 ml (brązowe probówki)
4% paraformaldehyd
4 g proszku paraformaldehydu (znajdującego się na półkach z odczynnikami suchymi) Wlać około 10 ml PBS-H do cylindra miarowego, dodać proszek paraformaldehydu Dolewać wodę, aż objętość osiągnie około 70 ml Dodać jedną kroplę NaOH. Mieszać do rozpuszczenia (zwykle około 20-30 minut) Dodać HCl, aż pH osiągnie wartość między 7 a 8. Dopełnić objętość wodą do 100 ml.
Mocznik 0,01 M
0,3 g mocznika (znajdującego się na półkach z odczynnikami suchymi) 500 ml wody