Opisano metodologię izolacji wysokiej jakości genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mikrobiologicznej społeczności glebowej.
Artykuł metodologiczny
Ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleb i osadów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikrobiom gleby stanowi ogromny i stosunkowo słabo zbadany rezerwuar różnorodności genomicznej i innowacji metabolicznych, który jest ściśle powiązany z przepływem składników odżywczych i energii w ekosystemach lądowych. Podejścia genomiczne środowiskowe niezależne od hodowli, znane również jako metagenomiczne, obiecują bezprecedensowy dostęp do tych informacji genetycznych w zakresie rekonstrukcji szlaków oraz przesiewu funkcjonalnego w poszukiwaniu wysokowartościowych procesów terapeutycznych i konwersji biomasy. Niemniej jednak, mikrobiom gleby wciąż stanowi wyzwanie, głównie ze względu na trudności w pozyskiwaniu wysokocząsteczkowego DNA o jakości wystarczającej do produkcji bibliotek z dużymi insertami. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół ekstrakcji wysokocząsteczkowego DNA genomicznego społeczności drobnoustrojów z gleb i osadów. Jakość wyizolowanego DNA genomicznego jest optymalna do konstruowania środowiskowych bibliotek genomicznych z dużymi insertami, przeznaczonych do późniejszego sekwencjonowania i analiz przesiewowych.
Procedura rozpoczyna się od lizy komórek. Ściany komórkowe i błony mikroorganizmów są lizowane zarówno za pomocą sił mechanicznych (rozcieranie), jak i chemicznych (β-merkaptoetanol). Następnie DNA genomowe jest izolowane przy użyciu buforu ekstrakcyjnego, chloroformu z alkoholem izoamylowym oraz alkoholu izopropylowego. Bufory stosowane w etapach lizy i ekstrakcji zawierają izotiocyjanian guanidyny oraz bromek cetylotrimetylammonium (CTAB), aby zachować integralność wysokocząsteczkowego DNA genomowego. W zależności od planowanych dalszych analiz, wyizolowane DNA genomowe może zostać dodatkowo oczyszczone metodą ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu (CsCl), co pozwala na usunięcie zanieczyszczeń, w tym kwasów huminowych. Pierwsza procedura, czyli ekstrakcja, trwa około 8 godzin, z wyłączeniem etapu kwantyfikacji DNA. Ultrawirowanie w gradiencie CsCl jest procesem dwudniowym. Przez cały czas trwania procedury z DNA genomowym należy obchodzić się delikatnie, aby zapobiec jego fragmentacji; należy unikać intensywnego mieszania w wirówce (vortexowania) oraz wielokrotnego, gwałtownego pipetowania.
Protokół
Część I: Ekstrakcja DNA
Procedura
1. Przetwarzanie 6 próbek wymaga 8 godzin, z wyłączeniem kwantyfikacji DNA.
Przed rozpoczęciem ekstrakcji należy schłodzić moździerz, tłuczek i szpatułkę w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub przy użyciu ciekłego azotu. Należy również schłodzić na lodzie probówki 50 ml zawierające 20 ml chloroformu z alkoholem izoamylowym (24:1). Piec do hybrydyzacji należy ustawić na 65 °C w celu wstępnego podgrzania. Należy sprawdzić roztwór CTAB; jeśli uległ krystalizacji, należy go podgrzać do 60 °C, aby rozpuścić kryształy. Roztwór denaturujący oraz bufor do ekstrakcji należy przygotować, dodając ostatnie składniki bezpośrednio przed rozpoczęciem ekstrakcji (patrz przepis poniżej). Wszystkie procedury ekstrakcyjne należy przeprowadzać w dygestorium.
2. Przygotuj bufor denaturujący i bufor do ekstrakcji.
Uwaga: Aby zmaksymalizować wydajność DNA, kluczowe jest precyzyjne przygotowanie buforów zgodnie z instrukcjami.
3. Umieść 2 g gleby w schłodzonym wcześniej moździerzu.
Uwaga: Gleba pobrana w terenie powinna być zamrożona na suchym lodzie podczas transportu i przechowywana w temperaturze -80 °C. Przed ekstrakcją DNA glebę należy rozmrozić i przesiać przez sito o oczkach 2 mm. Można zwiększyć początkową ilość gleby do 10 g.
4. Dodaj 1 ml roztworu denaturującego do gleby.
5. Zamrozić i zmielić glebę w ciekłym N2 za pomocą moździerza z tłuczkiem, aż cząsteczki gleby staną się sypkie i homogenne. Powtórzyć proces mrożenia i mielenia dwukrotnie.
Uwaga: Próbkę gleby należy utrzymywać w stanie zamrożenia podczas mielenia, stosując odpowiednią ilość ciekłego azotu, aby całkowicie przykryć próbkę. Lekkie roztopienie podczas mielenia jest dopuszczalne.
6. Przenieś zmieloną glebę do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, używając schłodzonej wcześniej szpatułki.
Uwaga: Na tym etapie próbkę zmielonej gleby można przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli jest to konieczne.
7. Dodać 9 ml buforu do ekstrakcji. Aby wymieszać roztwór z glebą, krótko wierzbać przy niskiej prędkości.
Uwaga: Aby zapewnić jednorodność buforu, należy go ogrzać do 60 °C przez 10-15 minut przed użyciem. Pozostałą część buforu należy utrzymywać w temperaturze 60 °C przez cały czas trwania ekstrakcji. Wierzbać z prędkością 8 (w skali, w której 10 jest wartością maksymalną).
8. Inkubować przez 40 min w temperaturze 65°C w piecu do hybrydyzacji. Podczas inkubacji stale obracać probówki z najniższą prędkością lub delikatnie odwracać je co 10 min.
Uwaga: Umieścić probówkę poziomo w piecu do hybrydyzacji, aby bufor miał kontakt z glebą na dużej powierzchni. Roztwór może wydawać się nieco lepki podczas inkubacji.
9. Wirować przy 1800 ×g przez 10 min w temperaturze 10 - 14 °C. Przenieść nadsącz do schłodzonej wcześniej stożkowatej probówki 50 ml zawierającej 20 ml chloroformu i alkoholu izoamylтельного (24:1), przechowywać na lodzie.
Uwaga: Podczas przenoszenia nadsączu należy uważać, aby nie zakłócić warstwy organicznej (warstwy dolnej). W razie potrzeby pozostawić 1-2 ml nadsączu, aby zebrać wyłącznie czysty nadsącz. Na powierzchni nadsączu często widoczna jest beżowa warstwa (o grubości około 1-3 mm). Nie należy naruszać tej warstwy podczas zbierania nadsączu. Należy starać się prowadzić końcówkę pipety wzdłuż ścianki probówki, aby zapobiec przerwaniu tej beżowej warstwy. Jeśli nadsącz jest zbyt mętny, należy powtórzyć ekstrakcję chloroformem i alkoholem izoamyltelowym jeszcze raz na nadsączu. Podczas przenoszenia chloroformu nie należy używać jednorazowych pipet plastikowych, ponieważ chloroform topi plastik. Należy użyć pipety szklanej, szklanego cylindra miarowego lub wlać chloroform bezpośrednio do stożkowatych probówek 50 ml.
10. Wykonaj ekstrakcję osadu glebowego jeszcze 2 razy;
10.1. Do osadów glebowych dodać 5 ml buforu do ekstrakcji, delikatnie wymieszać za pomocą końcówki 1 ml, a następnie krótko wierzchołkować przy niskiej prędkości.
Uwaga: Przed użyciem wstrząsnąć i wymieszać bufor.
10.2. Inkubować w 65°C przez 10 min w piecu do hybrydyzacji. Odwirywać przy 1800 xg przez 10 min w temperaturze 10 - 14 °C.
Przenieść nadsącz do probówki z kroku 9. Przechowywać probówkę z zebranym nadsączem i chloroformem z alkoholem izoamylowym na lodzie podczas ekstrakcji.
Uwaga: Należy upewnić się, że nadsącz jest dodawany do właściwej probówki, aby uniknąć krzyżowania próbek.
10.3. Powtórz kroki 9.1 i 9.2 jeszcze raz.
11. Używając rotatora, bardzo delikatnie kołysz probówkę zawierającą zebrany nadsącz (14-19 ml) i chloroform-alkohol izoamylowy z prędkością 1,25 rpm przez 10 min.
Uwaga: Bardzo szczelnie zamknij zakrętkę, aby zapobiec wyciekowi. Przed umieszczeniem probówki na rotatorze połóż na nim ręcznik papierowy, aby można było łatwo wykryć ewentualne wycieki.
12. Wirować przy 1800 xg przez 20 min w temperaturze 10 - 14 °C.
13. Przenieś fazę wodną do nowej probówki.
Uwaga: Podczas przenoszenia supernatantu nie naruszaj interfazy między fazą wodną (warstwa górna) a fazą organiczną (warstwa dolna). Pozostaw około 1,5- 2 ml supernatantu, aby zapewnić zebranie wyłącznie czystego supernatantu.
14. Odzyskaj DNA, używając alkoholu izopropylowego (krok 15.a - 21.a). Alternatywnie, jeśli spodziewasz się bardzo niskiej ilości biomasy w próbce, co w przypadku wytrącania alkoholem izopropylowym doprowadzi do powstania ledwo widocznego i trudnego do odzyskania osadu, zastosuj wirówki membranowe Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Devices (krok 15.b - 21.b).
15.a. Przenieś nadsącz do nowej probówki do ultrawirówki.
16.a. Do zebranego supernatantu dodać alkohol izopropylowy w stosunku objętości 0,6:1. Delikatnie odwrócić probówki kilka razy, aby wymieszać zawartość.
17.a Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
18.a. Odwiruj z prędkością 16000 ×g przez 20 min w temperaturze 20 - 25 °C. Przed etapem wirowania upewnij się, że masy wszystkich probówek są dobrze zrównoważone.
Uwaga: Zaznacz na probówce kierunek siły odśrodkowej, aby łatwiej zlokalizować osad DNA w przypadku niskiej wydajności izolacji DNA.
19.a. Usuń alkohol izopropylowy poprzez odlanie lub odsysanie próżniowe. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu DNA.
Uwaga: Usuń alkohol izopropylowy niezwłocznie po zakończeniu wirowania. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zgubić osadu DNA. Wielkość osadu DNA może się znacznie różnić w zależności od rodzaju gleby – od wyraźnie widocznego (średnica ~9 mm) do prawie niewidocznego. Zaleca się usuwanie pozostałości alkoholu izopropylowego poprzez ostrożne odsysanie wzdłuż ścianki probówki, aby nie odessać osadu DNA.
20.a. Suszyć osad DNA w temperaturze pokojowej przez 5 – 20 min.
Uwaga: Nie należy nadmiernie wysuszać osadu DNA, w przeciwnym razie ponowne rozpuszczenie DNA będzie utrudnione.
21.a. Osad DNA resuspendować w 200 μl TE. Wymieszać delikatnie, opukując probówkę. Roztwór DNA przenieść do probówki 1,5 ml. Probówkę przechowywać w temperaturze 4°C przez noc, aby całkowicie rozpuścić DNA.
Uwaga: W zależności od wielkości osadu można dostosować objętość dodawanego TE. Zazwyczaj odpowiednia objętość TE to 200 - 400 μl.
*Alternatywnie należy wykonać kroki 15.b – 21.b.
15.b. Wstępnie przemyć urządzenia do filtrowania odśrodkowej Amicon® Ultra-15; dodać do urządzenia 15 ml TE i wirować przy 3500 xg przez 10 min. Odrzucić filtrat.
16.b. Przenieś roztwór DNA z kroku 13 do uprzednio wypłukanego filtra Amicon. Wiruj przy 3500 xg do momentu, aż objętość DNA zostanie zredukowana do 200 - 500 μl. Odrzuć filtrat.
17.b. Przemyj DNA dwukrotnie buforem TE; dodaj 10 ml TE do urządzeń filtrujących Amicon. Wirowaj z prędkością 3500 xg do czasu, aż objętość DNA zostanie zredukowana do około 200 μl. Odrzuć filtrat. Powtórz czynność jeszcze raz.
18.b. Przenieś roztwór DNA z filtra do nowej probówki 1,5 ml.
19.b. Do filtra Amicon dodać 40 μl TE. Obie strony membran filtru należy przemyć, pipetując roztwór w górę i w dół, aby odzyskać wszelkie pozostałości DNA z filtra. Ten roztwór płuczący należy dodać do probówki z kroku 18.b.
20.b. W razie potrzeby DNA można dodatkowo zagęścić za pomocą odwirującego urządzenia filtrującego Microcon® Ultracel YM-30; należy wstępnie przemyć filtr, dodając 200 μl TE i wirując przy 10000 xg przez 7 minut. Do filtra należy dodać roztwór DNA i wirować przy 5000 xg przez 1 min. Wirowanie należy powtarzać do momentu, aż objętość roztworu DNA na filtrze zmniejszy się do około 50 μl.
Uwaga: Maksymalna początkowa objętość próbki dla filtra Microcon wynosi 500 μl. Nie wirować z prędkością przekraczającą 14000 x g. Należy unikać nadmiernego wirowania, które doprowadziłoby do całkowitego wyschnięcia membrany. Należy upewnić się, że po wirowaniu filtr jest wciąż przykryty niewielką ilością cieczy. W przypadku nadmiernego wirowania i wyschnięcia membrany należy dodać 15 μl TE, delikatnie mieszać przez 30 sekund i przejść do kroku 21.b.
21.b. Umieść jednostkę filtrującą do góry dnem w nowej probówce Microcon i wiruj przy 1000 x g przez 3 min, aby odzyskać DNA.
22. Ilościowo określ zawartość DNA za pomocą żelu TAE (0,8%, 0,5xTAE, 50 V przez 4 godziny) oraz za pomocą spektrofotometru Nanodrop lub testu Pico-green i czytnika płytek.
Uwaga: Ilość DNA można oszacować, porównując prążek próbki z prążkiem markera o znanym stężeniu (marker DNA wysokocząsteczkowego lub λHindIII) na żelu.
23. Sprawdzić integralność wysokocząsteczkowego DNA za pomocą elektroforezy w polu pulsacyjnym (PFGE) z użyciem żelu 1% 1xTAE (szczegóły znajdują się w Etapie II, część 2 pod adresem https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387, doi: 10.3791/1387 opracowanym przez Taupp et al. 2009).
Uwaga: Do kontroli jakości można użyć zwykłego żelu agarozowego zamiast agarozy niskotopliwej. W skrócie, warunki elektroforezy są następujące: 2-250 kb, 6 V, początkowy czas przełączenia: 5 s, końcowy czas przełączenia: 15 s, czas przebiegu: 12 h w temperaturze 14 °C. Barwienie SYBR Gold przez jedną godzinę w celu wizualizacji DNA na żelu.
24. Jeśli masy cząsteczkowe wyekstrahowanego DNA są satysfakcjonujące, należy przejść do następnego etapu wirowania w gradiencie CsCl. Alternatywnie DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C przed wirowaniem w CsCl.
Mediana wielkości DNA powinna być równa lub przekraczać 36 Kb, jeżeli celem jest stworzenie metagenomicznej biblioteki DNA z dużymi insertami.
Część II. Oczyszczanie DNA przy użyciu ultrawirówki z gradientem chlorku cezu
Przygotowanie wirówki: 1,5 - 2 godziny
Etap wirowania: 18 godzin
Usuwanie bromku etydyny (EtBr) i zagęszczanie DNA po wirowaniu: 3 godziny
Procedura
Szczegóły znajdują się w publikacji Wright et al. 2009. https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352, doi: 10.3791/1352
Reprezentatywne wyniki/rezultaty
Całkowita ilość genomowego DNA wyizolowanego z 2 g organicznego horyzontu leśnego (horyzont O) oraz horyzontów mineralnych (horyzonty Ae, AB i Bt) (pobranych z obszaru Long Term Soil Productivity (LTSP) położonego nad jeziorem Skulow, BC, Kanada, zarządzanego przez BC Ministry of Forests and Range) wynosiła od 10 mg do 180 mg. Mediana wielkości wyizolowanego DNA zazwyczaj mieściła się w zakresie 40 – 60 kb (Rysunek 1). Stosunek absorbancji przy 260 nm/280 nm wynosił od 1,3 do 1,6, a przy 230 nm zaobserwowano piki, co może wskazywać na zanieczyszczenie kwasami huminowymi często występujące w próbkach gleby. Centryfugacja w gradiencie CsCl drastycznie zredukowała to zanieczyszczenie i zwiększyła stosunek 260/280 do 1,8 – 1,9, jak pokazano na Rysunku 2a i 2b.
Rycina 1. Zdjęcia PFGE wyekstrahowanego DNA genomicznego przed ultrawirowaniem w CsCl. ścieżka 1: marker 1 kb 100 ng, ścieżka 2: marker λHind III 100 ng, ścieżka 3: marker λHind III 250 ng, ścieżka 4: marker λHind III 500 ng, ścieżka 5: marker Fosmid 36 kb 100 ng, ścieżki 6 i 7: DNA genomiczny wyizolowany z mineralnego horyzontu glebowego Ae, ścieżki 8 i 9: DNA genomiczny wyizolowany z mineralnego horyzontu glebowego AB w punkcie LTSP położonym nad jeziorem Skulow, BC
Rysunek 2. Chromatogramy DNA genomowego wykryte spektrofotometrem przed (A) i po ultrawirowaniu w gradiencie CsCl (B). Zwróć uwagę na obniżenie wartości absorbancji przy długości fali 230 nm po ultrawirowaniu w gradiencie CsCl, co wskazuje na poprawę jakości DNA genomowego. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku 2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Canadian Foundation for Innovation, British Columbia Knowledge Development Fund, Genome British Columbia oraz Ministerstwu Lasów i Pastwisk Kolumbii Brytyjskiej (British Columbia Ministry of Forests and Range) za wsparcie prowadzonych badań nad produktywnością gleb leśnych. S.L. otrzymał wsparcie w formie stypendium z Centrum Różnorodności i Ewolucji Mikrobowej (Centre for Microbial Diversity and Evolution), finansowanego przez fundację TULA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| *Roztwór denaturujący: łącznie 10 ml | |||
| IzKtyj Nowak izKtyjan guanidyny (MW 118,16), 4,73 g | |||
| 1M Tris-HCl (pH 7,0), 100 μl | |||
| 0,5 M EDTA, 20 μL | |||
| Dopełnić wodą do objętości całkowitej 9,95 ml. | |||
| Autoklaw. | |||
| Dodaj 50 μl 2-merkapto–etanol bezpośrednio przed użyciem. (5 μl 2-merkaptotrietanolu–etanol na 1 ml roztworu denaturującego) | |||
| Uwaga: Roztwór denaturujący należy przechowywać w temperaturze 4°C. °C. Nie należy używać buforu starszego niż jeden tydzień. Jeśli to możliwe, należy przygotować świeży bufor do użytku. | |||
| **Bufor do ekstrakcji** | |||
| Bufor fosforan sodu 1 M [pH 7,0]*, 100 ml | |||
| 1M Tris-HCl [pH 7,0], 100 ml | |||
| 0,5 M EDTA [pH 8,0], 200 ml | |||
| 5 M NaCl, 300 ml | |||
| Autoklawować i przechowywać w temperaturze pokojowej. | |||
| Tuż przed użyciem dodać 200 ml 5% bromku heksadecylotrimetylammonium (CTAB, autoklawowany) oraz 100 ml 20% SDS (autoklawowany). W przypadku wykrystalizowania CTAB, należy go rozpuścić w temperaturze 60°C. °C. | |||
| * Bufor fosforan sodu 1M: 57,7 ml, 1M fosforan sodu jednopodstawowy (NaH2PO4) oraz 42,3 ml 1 M fosforanu sodu dwuzasadowego (NaH2PO4). Dostosować pH do wartości 7,0 | |||
| Uwaga: Nie należy stosować 20% SDS, jeśli wystąpiło jego wytrącenie. Po dodaniu SDS do roztworu normalnym zjawiskiem jest powstanie mlecznej zawiesiny. Po dodaniu SDS należy umieścić bufor do ekstrakcji w temperaturze 60 °Mieszaj, aby zapewnić pełne zawieszenie SDS. |
Bibliografia
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie