Wychwyt poprzez elongację starterów: celowane odzyskiwanie sekwencji z silnie zdegradowanych źródeł DNA

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę ukierunkowanego odzyskiwania sekwencji starożytnego DNA, którą wykorzystaliśmy do rekonstrukcji kompletnych genomów mitochondrialnych pięciu osobników neandertalczyków. Porównanie tych sekwencji z genomami współczesnych ludzi sugeruje, że neandertalczycy przez długi czas charakteryzowali się niską efektywną wielkością populacji.

Streszczenie

Przedstawiamy metodę ukierunkowanego odzyskiwania sekwencji DNA z materiałów DNA, które są silnie zdegradowane i zanieczyszczone DNA drobnoustrojów, co jest typowe dla kości starożytnych. Metoda ta znacząco ogranicza niszczenie próbek oraz zapotrzebowanie na sekwencjonowanie w porównaniu do podejść opartych na bezpośredniej reakcji PCR lub sekwencjonowaniu typu shotgun. Wykorzystaliśmy tę metodę do rekonstrukcji pełnych genomów mitochondrialnego DNA (mtDNA) pięciu neandertalczyków z całego ich zasięgu geograficznego. Różnorodność genetyczna mtDNA późnych neandertalczyków była około trzy razy niższa niż współczesnych ludzi. Dane te, wraz z analizami ewolucji białek mtDNA, sugerują, że długoterminowa efektywna wielkość populacji neandertalczyków była mniejsza niż u ludzi współczesnych oraz żyjących obecnie wielkich małp.

Protokół

Metoda ta została wykorzystana w badaniach opisanych w pracy Briggs et al., Science 325 (5938). 318-321 (2009).

Wymagane odczynniki:

• Polimeraza DNA AmpliTaq Gold
• 10x bufor PCR GeneAmp PCR Buffer II
• MgCl₂ 25mM
• mieszanina dNTP, każde 25 mM
• BSA, 10 mg ml-¹ w wodzie
• Woda klasy biologii molekularnej
• bufor EB (dołączony do zestawu MinElute PCR Purification); 10 mM Tris HCl, pH 8.5
• Zestaw MinElute PCR Purification Kit
• Kuleczki streptawidynowe Dynabeads M-270
• 2x bufor do wiązania i przemywania (BW) (2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% Tween 20)
• 1x bufor do wiązania i przemywania (BW) (bufor 2x BindWash rozcieńczony 2X w wodzie)
• bufor do gorącego przemywania (HW) (2.5mM MgCl, 1X bufor Taq Gold, 0.1% Tween 20)

Informacje o producentach niestandardowych odczynników i sprzętu znajdują się w poniższej tabeli.

1) Amplifikacja biblioteki

1. Matryca DNA użyta w tym przypadku to biblioteka 454 przygotowana z próbki DNA o niskiej liczbie kopii, zgodnie z opisem w (Rohland and Hofreiter, 2007a, 2007b) oraz (Maricic and Pääbo, 2009). Aby amplifikować całą bibliotekę, należy przygotować następującą mieszaninę PCR:

   Odczynnik	μl na reakcję
   Woda	45
   bufor do PCR 10X Gene Amp PCR buffer II	10
   MgCl22 (25 mM)	10
   BSA (10 mg/ml)	2
   dNTP (po 25 mM każdy)	1
   454 emPCR starter bezpośredni/10uM	3
   454 emPCR primer rvs/10uM	3
   polimeraza DNA AmpliTaq Gold (5 U / μl)	1
   matryca biblioteki DNA 454	25
   Suma	100

2. W termocyklerze należy zastosować następujący program PCR dla 14 cykli amplifikacja
   1. 95°C 12 min
   2. 95°C 30 s
   3. 60°C (lub pożądana temperatura przyłączania) 1 min
   4. 72°C 1 min
   5. Przejdź do 2 (x 13)
   6. 72°C 5 min
   7. 10°C ∞
3. Oczyść produkt reakcji przy użyciu kolumny wirówkowej Qiagen MinElute zgodnie z instrukcjami producenta. Eluuj w 50 μl buforu EB.
4. Ilość oczyszczonego produktu amplifikacji oraz alikwot nieamplifikowanej biblioteki należy określić za pomocą qPCR (Meyer et al., 2007). Jeśli produkt amplifikacji ma więcej niż 1 X 10¹² kopii na µl, zmniejszyć ilość matrycy w następnym kroku wydłużania starterów, aby upewnić się, że nie przekroczy ona 2 x 10¹² kopie dodaje się do reakcji wydłużania startera.

2 ) Wydłużanie startera

1. Przygotować mieszankę główną (master mix) dla wymaganej liczby reakcji.

   Odczynnik	μl na reakcję
   Woda	45
   10X Gene Amp PCR buffer II	10
   MgCl2 (25mM)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (po 25 mM każdy)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR rvs primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA polymerase (5 U / μl)	1
   Matryca biblioteki DNA 454	25
   Suma	100

2. Przeprowadzić w termocyklerze następujący program dla reakcji podłużania pojedynczego primera:
   1. 95°C 12min
   2. 60°C (lub temperatura przyłączania primera PEC, jeśli jest inna) 1 min
   3. 72°C 5 min
   4. 72°C stale!
      
      KROK KRYTYCZNY Utrzymać reakcję po podłużaniu w temperaturze 72 °C. Następnie, przed wyjęciem z bloku grzewczego, bezpośrednio pipetować 150ul buforu PBI lub PB do oczyszczania QIAGEN MinElute do probówek. Jest to istotne, aby uniknąć niespecyficznego przyłączania i wychwytywania primerów podczas ochładzania mieszaniny.
3. Oczyścić produkt reakcji za pomocą kolumny wirnikowej Qiagen MinElute zgodnie z instrukcją producenta. Eluować w 50 μl EB.

3) Wychwytywanie produktu elongacji

1. Resuspendować roztwór stokowy kulek M-270 za pomocą wortexa. Odpiąć 25 μl zawiesiny kulek na każdą próbkę. Przemyć kulki dwukrotnie 500 μl buforem 2x BW i resuspendować w 25 μl buforze 2xBW na próbkę.
2. Do 25 μl zawiesiny kulek z kroku 3.1 dodać 25 μl eluatu z kroku 2.3. Wymieszać, a następnie inkubować w rotatorze przez 15 min w temperaturze pokojowej.
   
   Zalecane: zachować pozostałe 5 μl eluatu z kroku 2.3 do ilościowego oznaczenia metodą qPCR.
   
   
3. Przenieść całą mieszaninę do nowej probówki 1,5 ml (pomaga to ograniczyć przeniesienie fragmentów biblioteki niebędących celem). Odwirować osad z supernatantu za pomocą magnetycznego kolektora cząsteczek (MPC) i usunąć supernatant.
4. Przemyć 5 razy 500 μl buforem 1xBW (wielokrotne przemywanie pomaga usunąć jak największą ilość tła). Po ostatnim etapie przemywania krótko odwirować i usunąć ostatnie ślady supernatantu.
5. Dodać 500 μl buforu 1x Hot Wash (HW). Mieszać przez 2 min w 65 °C (lub 5 °C powyżej Tm primera PEC) na bloku termicznym. Szybko usunąć supernatant po tej operacji, aby zminimalizować schładzanie. (Krok ten służy do usunięcia fragmentów tła, które wciąż wiążą się z primerami PEC, ale nie zostały faktycznie przedłużone podczas etapu elongacji). Usunąć ostatnie ślady supernatantu.
6. Resuspendować osad kulek w 30 μl buforze EB. Przenieść całą mieszaninę do nowej probówki 1,5 ml (pomaga to ograniczyć przeniesienie fragmentów biblioteki niebędących celem). Inkubować w 95 °C przez 3 minuty w termocyklerze w celu elucji. Umieścić w MPC i usunąć supernatant, dbając o to, aby nie usunąć kulek.

4) Amplifikacja produktu wychwytu

1. Przygotować mieszaninę PCR (master mix) dla wymaganej liczby próbek.

   Odczynnik	μl na reakcję
   Woda	45
   10X Gene Amp PCR buffer II	10
   MgCl2 (25mM)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (po 25 mM każdy)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR rvs primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA polymerase (5 U / μl)	1
   Eluowany produkt wychwytu	25
   Suma	100

2. W termocyklerze zastosować następujący program PCR dla 14 cykli amplifikacji:
   1. 95°C 12min
   2. 95°C 30s
   3. 60°C (lub wybrana temperatura przyłączania) 1 min
   4. 72°C 1 min
   5. Powrót do punktu 2 (x 13)
   6. 72°C 5min
   7. 10°C ∞
3. Oczyścić produkt reakcji za pomocą kolumny żelowej Qiagen MinElute silica spin zgodnie z instrukcją producenta. Eluować w 50 μl buforu EB. Produkt można teraz wykorzystać albo do drugiej rundy wychwytu, zaczynając od kroku 2.1, albo wprowadzić bezpośrednio do protokołu 454 emulsion PCR w celu sekwencjonowania.

Reprezentatywne wyniki:

Przy rozpoczynaniu pracy z protokołem PEC zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie najpierw reakcji wychwytu, w której niewielka ilość „sekwencji docelowej kontroli pozytywnej” (np. produktu PCR o długości ~100bp – 1 picogram jest w zupełności wystarczający) zostaje zmieszana z normalnie zalecaną ilością matrycy z amplifikowanej biblioteki 454 (patrz krok 2.1), a wychwyt jest przeprowadzany przy użyciu pojedynczego primera PEC zaprojektowanego do wychwycenia produktu kontroli pozytywnej. Jeśli przeprowadzono tę reakcję kontrolną, qPCR z zastosowaniem par primerów specyficznych zarówno dla kontroli pozytywnej, jak i dla adapterów 454 może zostać wykorzystany do ilościowego oznaczenia zawartości „celu kontrolnego” w stosunku do tła w oczyszczonej reakcji wydłużania primera (1.3), produkcie wydłużania primera (2.3) oraz eluowanym produkcie wychwytu na kulekach (3.6). W ten sposób w danych warunkach eksperymentalnych można bezpośrednio zmierzyć zarówno skuteczność usuwania tła („specyficzność”), jak i wydajność odzyskiwania celu („czułość”).

Prawidłowo przeprowadzony protokół PEC zazwyczaj charakteryzuje się następującymi cechami –

Czułość (mierzona ilością docelowego kontrolera zachowanego w trakcie protokołu):
Całkowita ilość docelowego kontrolera w eluatach z kulek (3.6) =~ 1-20% całkowitej ilości w oczyszczonej reakcji wydłużania starterów (2.3).

Tło (mierzone za pomocą pary starterów emPCR 454):
Całkowita ilość tła w produkcie wychwytanym na kuleczkach po elucji (3.6) < 0,01% całkowitej ilości w oczyszczonej reakcji wydłużania starterów (2.3).

Jeśli w produkcie końcowym pozostaje mniej niż 1% celu, etap wydłużania startera mógł zakończyć się niepowodzeniem i wymaga zbadania.

Jeśli w produktach końcowych pozostaje znacznie więcej niż 0,01% tła, kroki płukania mogły zostać wykonane nieprawidłowo i należy je sprawdzić.

Dyskusja

Metoda PEC jest prosta, szybka, czuła i specyficzna. W związku z tym autorzy przewidują liczne zastosowania poza analizami ancient DNA, takie jak wychwyt małych fragmentów RNA z biblioteki RNA, badanie zmienności strukturalnej w próbce pulowanej lub wychwyt różnorodności 16S (lub innych locus) z próbki metagenomicznej. Należy wspomnieć, że czułość wychwytu maleje wraz ze wzrostem liczby starterów PEC w reakcji wychwytu multipleksowego. PEC nie jest zatem idealnie dostosowany do wychwytu bardzo dużych regionów (np. megabazy lub więcej), ale doskonale sprawdza się w szybkim wychwycie małych regionów docelowych, a nawet pozycji SNP u wielu osobników.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polimeraza AmpliTaq Gold z buforem GeneAmp PCR buffer II i MgCl2	Applied Biosystems	N8080241
Zestaw do oczyszczania PCR QIAGEN MinElute	Qiagen	28004
Kuleczki streptawidynowe M-270	Invitrogen	653.05
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
Separator cząstek magnetycznych DynaMag-2	Invitrogen	120.02D