Nieinwazyjne in vivo MRI i MRS małych zwierząt: Podstawowe procedury eksperymentalne

Podsumowanie

Niniejsza praca opisuje podstawowe procedury nieinwazyjnego obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) oraz spektroskopii rezonansu magnetycznego (MRS) małych zwierząt in vivo.

Streszczenie

Badania z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego (MR) małych zwierząt stały się istotnym elementem nowoczesnych badań biomedycznych ze względu na ich nieinwazyjny charakter oraz bogactwo dostarczanych informacji biologicznych. MR nie wymaga zastosowania promieniowania jonizującego i może nieinwazyjnie zapewnić wyższą rozdzielczość oraz lepszy stosunek sygnału do szumu w porównaniu z innymi metodami tomograficznymi lub spektroskopijnymi. W niniejszym protokole skupimy się na obrazowaniu MR oraz spektroskopii MR (MRI/MRS) małych zwierząt w celu nieinwazyjnego pozyskania danych ważonych przez relaksację¹Obrazy H myszy i aby uzyskać³¹Widma P mięśni mysich. Niniejsza praca nie ma na celu omówienia każdego aspektu MRI/MRS u małych zwierząt, lecz wprowadza podstawowe procedury eksperymentów MRI/MRS u myszy. Głównym celem tej pracy jest poinformowanie badaczy o podstawowych procedurach dotyczącychin vivoEksperymenty MR u małych zwierząt. Celem jest zapewnienie lepszego zrozumienia podstawowych procedur eksperymentalnych, aby badacze nowi w dziedzinie MR mogli lepiej zaplanować komponenty ich badań niezwiązane z MR, tak aby procedury MR i procedury poza-MR były ze sobą płynnie zintegrowane.

Protokół

Część 1: Bezpieczeństwo pracy z magnesami

Zarówno MRI, jak i MRS wykorzystują silne pole magnetyczne, co wymaga zachowania szczególnej ostrożności. Przykładowo, urządzenie 4,7 T użyte w niniejszej pracy generuje pole magnetyczne około 90 000 razy silniejsze od ziemskiego pola magnetycznego. Wysokie pole magnetyczne jest obecne stale, nawet gdy skaner MR nie jest używany. Każdy metalowy przedmiot, który znajdzie się w tak silnym polu magnetycznym, zostanie gwałtownie i silnie przyciągnięty przez magnes. Jest to skrajnie niebezpieczne, jeśli osoba badana lub operator znajduje się na torze lotu metalowego przedmiotu wciąganego przez magnes. Dlatego personel przeprowadzający eksperymenty MR powinien zadbać o usunięcie wszelkich metalowych przedmiotów z odzieży przed zbliżeniem się do urządzenia oraz dbać o to, aby w otoczeniu nie było takich przedmiotów. Bardziej szczegółowe informacje na temat bezpieczeństwa pracy z magnesami znajdują się w literaturze¹ oraz na poniższej stronie internetowej: http://www.imrser.org/. Obecność materiałów metalowych może nie tylko powodować wspomniane problemy z bezpieczeństwem, ale także zakłócać wyniki eksperymentów poprzez indukowanie artefaktów obrazowania/spektroskopowych. Materiał metalowy znajdujący się w pobliżu lub wewnątrz obrazowanego obiektu może zmienić pole magnetyczne w najbliższym otoczeniu, co prowadzi do powstania artefaktów na uzyskanych obrazach lub poszerzenia szerokości linii widm.

W związku z tym, jeśli zajmujesz się zwierzętami podczas procedur MR, pozostaw portfel, klucze, długopisy itp. poza obszarem działania magnesu.

Część 2: Obrazowanie MRI in vivo myszy w magnesie z poziomym otworem

Przygotowanie zwierząt do MRI

1. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt powinny zostać zatwierdzone przez instytucjonalną komisję ds. opieki i użytkowania zwierząt (IACUC) przed przystąpieniem do jakichkolwiek działań związanych z obsługą zwierząt.
2. Do znieczulania zwierząt w eksperymentach MRI stosujemy odparowany izofluran. Znieczulenie zwierząt można przeprowadzić również za pomocą innych środków znieczulających, takich jak awertyn (2,2,2-tribromoetanol lub TBE) oraz mieszanka ketaminy i ksylazyny. Informacje dotyczące dawkowania każdego z tych środków znajdują się w Tabeli 1.
3. Wyłożyć komorę indukcyjną podkładem chłonnym z plastikowym spodem (podkład niebieski lub typu chuck). Umieścić mysz (lub kilka myszy w przypadku obrazowania wielu osobników) w komorze indukcyjnej.
4. Ustawić przepływomierz waporyzatora izofluranu na 0.8 1.5 L/min. Następnie ustawić waporyzator izofluranu na 4 % na około 2 3 minuty.
5. Po osiągnięciu poziomu znieczulenia chirurgicznego (tj. braku reakcji na uciśnięcie palca u nogi), umieścić mysz w uchwycie dla zwierząt, wkładając nos do stożka nosowego (lub maski). Do obrazowania głowy można użyć stabilizatora głowy, a do obrazowania ciała – uchwytu do ciała.
6. Uchwyty dla zwierząt są stosowane w celu zapobiegania potencjalnym ruchom; dostępne jest kilka rodzajów uchwytów komercyjnych. Można również wykonać uchwyt na specjalne zamówienie, aby dostosować go do wszelkich specyficznych wymagań zestawu eksperymentalnego. W przypadku uchwytu wykonanego na zamówienie należy upewnić się, że użyto wyłącznie materiałów niemagnetycznych.
7. W trakcie obrazowania ustawić przepływomierz na 0.4 0.8 mL/min i zmniejszyć ustawienie waporyzatora izofluranu do 1.2 1.5 %. Gaz wydychany ze stożka nosowego myszy jest zbierany przez pompę i odprowadzany do wewnętrznego systemu próżniowego.
8. Oczy zwierzęcia należy utrzymywać w wilgotnym stanie za pomocą sterylnej maści nawilżającej do oczu. Podczas eksperymentu zwierzę jest utrzymywane w temperaturze 35-37° C w systemie cyrkulacji ciepłej wody. Można stosować inne źródła ciepła, takie jak podgrzewane podkładki lub ciepłe powietrze wdmuchiwane do cewki wysokoczęstotliwościowej (RF).
9. Zastosowany jest system monitorowania zwierząt w celu kontroli temperatury ciała, cyklu oddechowego/sercowego oraz synchronizacji bramkowania oddechowego/sercowego z akwizycją obrazów.
10. Obok zwierzęcia umieszcza się standardową próbkę wykonaną z agarozy w celu monitorowania gwałtownych zmian sygnału. Ta standardowa próbka agaru jest szczególnie przydatna przy obrazowaniu wielowarstwowym i w wielu punktach czasowych. W przypadku wykrycia nieoczekiwanej zmiany sygnału w warstwie z uzyskanych obrazów, warstwa ta może zostać odrzucona. Ponadto, podczas analizy obrazów, natężenie sygnału może zostać skorygowane na podstawie zmiany sygnału próbki standardowej.
11. Po bezpiecznym umieszczeniu zwierzęcia i komponentów monitorujących w uchwycie, należy ustawić uchwyt w centrum cewki RF.
12. Przenieść cewkę RF do pomieszczenia z magnesem i włożyć ją do systemu cyrkulacji ciepłej wody znajdującego się wewnątrz magnesu. Rysunek 2 przedstawia poszczególne komponenty skanera MRI widziane z przodu otworu magnesu.

Eksperyment MRI

1. Dostrój cewkę RF do częstotliwości rezonansowej ¹H i dopasuj impedancję charakterystyczną cewki do 50 Ohm, korzystając z panelu strojenia w skanerze MR. Ma to na celu uzyskanie optymalnych warunków odbioru sygnału. Większość ludzkich skanerów MRI nie wymaga oddzielnego procesu strojenia i dopasowania, z wyjątkiem procedur MRS.
2. Przeprowadź proces shimowania (homogenizacji pola) przy użyciu pojedynczej sekwencji impulsów. Sygnał MR zależy od jednorodności zewnętrznego pola magnetycznego. Proces shimowania pozwala na uzyskanie jak największej jednorodności pola magnetycznego w obszarze zainteresowania. Każdy skaner MR posiada własną metodę wykonywania procesu shimowania, w tym automatyczne, szybkie procesy shimowania, takie jak fast map oraz shimowanie gradientowe.
3. Zoptymalizuj impuls RF poprzez maksymalizację jednowymiarowego profilu obrazu. Moc impulsów RF można układać w szereg, utrzymując stałą długość impulsu oraz wystarczająco długi TR (czas repetycji), który wynosi około 3 - 5x T₁ tkanki.
4. Nabyj obrazy orientacyjne (scout images) w trzech ortogonalnych orientacjach w celu utworzenia obrazów w płaszczyźnie osiowej, czołowej i strzałkowej. Do nabycia obrazów orientacyjnych można użyć szybkiej sekwencji akwizycji obrazu (np. sekwencji gradient echo lub szybkiej sekwencji spin echo). Nabyte obrazy posłużą do zaplanowania właściwego obrazowania wraz z wyznaczeniem płaszczyzn obrazowania.
5. Przełącz się na sekwencję spin echo. Wybierz odpowiednie parametry sekwencji: TR (czas repetycji) powinien być od trzech do pięciu razy dłuższy niż T₁ tkanki, aby uzyskać obrazy w pełnym relaksowaniu, takie jak obrazy gęstości protonowej lub obrazy ważone T₂. TE (czas echa) to czas pomiędzy pierwszym impulsem RF a centrum sygnału echa. Wartość TE można dobrać w zależności od kontrastu obrazu, jak podsumowano w Tabeli 2. Rysunek 2 przedstawia obrazy in vivo uzyskane przy różnych efektach relaksacji T₁, T₂ i T₂* dla myszy nagoj z ksenoprzeszczepem guza na grzbiecie.
6. Pomiary T₂ można przeprowadzić albo za pomocą obrazowania wieloechowego (multiecho imaging), albo obrazowania pojedynczego echa z wieloma wartościami TE.
7. Po zakończeniu eksperymentu MRI/MRS in vivo należy monitorować zwierzęta przez cały proces rekonwalescencji. Po obrazowaniu MR zwierzęta zostaną wyjęte z cewki RF i monitorowane, aby upewnić się, że całkowicie odzyskały sprawność przed powrotem do klatki. U znieczulonych myszy utrata ciepła następuje szybko. Należy utrzymywać zwierzęta w cieple, przykrywając je gazikami lub ręcznikami i/lub zapewniając źródło ciepła, aż zwierzęta wybudzą się z narkozy.

Przetwarzanie obrazu

1. Przejrzyj pozyskane obrazy na konsoli MR i prześlij wybrane dane do komputera do postprocessingu.
2. Do analizy obrazów zazwyczaj używamy programu ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Analiza obrazu obejmuje skalowanie/filtrowanie obrazów, obliczenia T₁, T₂ i dyfuzji, pomiary objętości guza oraz segmentację guzów.

Część 3. In Vivo MRS mięśni szkieletowych kończyn tylnych myszy w magnesie z pionowym otworem

Konstrukcja mankietu do indukowania odwracalnego niedokrwienia

1. Należy rozpocząć od przygotowania kawałka rurki PVC o szerokości około 5-7 mm i średnicy wewnętrznej (i.d.) 12-15 mm. W ściance tego elementu należy wywiercić mały otwór i przygotować gwint.
2. Należy wyciąć fragment balonu w taki sposób, aby był on otwarty z obu stron (najlepiej sprawdzają się balony do helu). Fragment ten należy przełożyć przez rurkę PVC, zawinąć z powrotem i przymoczyć końce taśmą do zewnętrznej ścianki rurki PVC.
3. Aby uszczelnić końce balonu wokół rurki, należy użyć folii termokurczliwej. W efekcie powstanie mankiet z twardą ścianą zewnętrzną i nadmuchiwaną ścianą wewnętrzną.
4. Wokół otworu z gwintem należy wyciąć fragment folii termokurczliwej i balonu, dbając o to, aby między otworem a krawędzią rurki PVC pozostało wystarczająco dużo materiału. W otwór w PVC należy wkręcić 1,5 cm elementu z metalu nieferro-magnetycznego (np. mosiądzu). Pozwoli to na napompowanie mankietu. Miejsce to należy uszczelnić szybkoschnącą żywicą epoksydową (5-minutową).
5. Mankiet należy zamocować obok cewki RF w sondzie MRS i podłączyć do zewnętrznego sfigmomanometru.

Własny monitor oddychania

1. Stosujemy monitor oddychania wykonany na zamówienie, który został zaprojektowany tak, aby był kompatybilny z ograniczoną przestrzenią i dostępem do otworu magnesu. Dostępne są również kilka modeli komercyjnych.
2. Do końca odpornego na rozciąganie przewodu wprowadzonego do sondy przywiąż mały balonik.
3. Podłącz drugi koniec przewodu do przetwornika ciśnienia.
4. Upewnij się, że w przewodzie i baloniku nie ma pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki te osłabią sygnał wynikający ze ściskania balonika spowodowanego ruchem ciała myszy podczas oddychania.

Pozycjonowanie myszy w sondzie MRS

1. Zpodaj myszy znieczulenie 5% Avertinem (0,010 ml/g masy ciała).
2. Po osiągnięciu chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia umieść mysz w sondzie MRS, kładąc ją na plecach na wsporniku dla myszy. Umieść wypełniony cieczą balon po stronie brzusznej myszy i zabezpiecz go pasami wspornika.
3. Umieść mysz wraz ze wspornikiem ciała w sondzie MRS.
4. Przewlecz jedną tylną kończynę przez mankiet niedokrwienny i cewkę MRS. Noga powinna być w miarę możliwości wycentrowana w cewce. Taki układ pozwala na poziome ustawienie ciała myszy w magnesie z pionowym otworem (Rycina 3).
5. Utrzymaj nogę w stałej pozycji, przyklejając stopę taśmą do sztywnego wspornika.
6. Umieść termoparę podskórnie w tylnej kończynie, poza obszarem rejestrowanym przez cewkę.
7. Nawilż oczy maścią lubrykującą, aby zapobiec ich wysychaniu. Przykryj oczy i pyszczek myszy, aby zapobiec ocieraniu się lub podrażnieniu ściankami sondy.
8. W zależności od specyficznych potrzeb eksperymentu można dodać inne sondy monitorujące.

Przygotowanie eksperymentu MRS

1. Podłącz przepływ powietrza do elementu grzejnego sondy MRS.
2. Ustaw jednostkę sterowania temperaturą zmienną w oprogramowaniu VNMR tak, aby utrzymać temperaturę kończyny w zakresie 35-37 °C.
3. Dostrój częstotliwość cewki i dopasuj impedancję za pomocą panelu strojenia w oprogramowaniu MRS dla rezonansów ¹H i ³¹P.
4. Wyreguluj obwody shimowania, aby zoptymalizować jednorodność pola magnetycznego B1 w obszarze zainteresowania, wykorzystując spektroskopię ¹H.
5. Przełącz na częstotliwość ³¹P, aby określić szerokość impulsu RF niezbędną do uzyskania maksymalnego sygnału z jednego wolnego zaniku indukcji (FID) (czas 90°).
6. Zbierz widma w stanie pełnego relaksowania (FRS) o wysokim stosunku sygnału do szumu, aby określić stosunki fosforanu nieorganicznego (P_i) i fosfokreatyny (PCr) do ATP w warunkach pełnego relaksowania. Widma te są zbierane przy użyciu czasu 90° z czasem między akwizycjami FID (TR) wynoszącym około 5x T₁ dla PCr (20 sec. przy 7 T). Będą one służyć do ilościowego oznaczenia poziomów PCr i P_i z widm MR.

Eksperyment niedokrwienny

1. Prosta perturbacja niedokrwienna pozwala na określenie spoczynkowej i maksymalnej produkcji mitochondrialnego ATP poprzez pomiar zmian poziomu fosfokreatyny podczas oraz bezpośrednio po niedokrwieniu.
2. Skonfiguruj macierz w celu zebrania wielu widm, stosując szerokość impulsu 45° (tj. 0,5 x czas impulsu 90°) oraz TR wynoszące 0,5x T₁ (~1,5 sec.). Zazwyczaj zbieramy 4 sygnały FID dla każdego widma (liczba uśrednień (na) = 4 w oprogramowaniu VNMR), co zapewnia rozdzielczość czasową wynoszącą około 6 sekund. Taka rozdzielczość czasowa jest wystarczająca do dokładnego określenia spoczynkowej i maksymalnej produkcji mitochondrialnego ATP.
3. Zbieraj widma spoczynkowe przez około 5 minut.
4. Wywołaj niedokrwienie, napompowując mankiet do ciśnienia 270-300 mmHg na 10-12 minut.
5. Zwolnij mankiet i zbieraj widma regeneracyjne przez 5 minut.
6. Wyjmij sondę z magnesu, a mysz z sondy. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu w odpowiednich warunkach. Eksperymenty można powtarzać w kolejnych dniach. Po ostatnim badaniu spektroskopowym mięśnie kończyn dolnych myszy zostają pobrane i natychmiast zamrożone w ciekłym N₂ w celu analizy stężeń ATP metodą HPLC.

Analiza danych

1. Dane analizuje się w trybie offline, korzystając z jednego z kilku programów do analizy widm NMR. W naszym laboratorium do kwantyfikacji pól powierzchni pików zazwyczaj stosujemy fit to standard ² oraz jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml).
2. Wstępne szybkości rozpadu PCr podczas niedokrwienia stanowią miarę mitochondrialnej produkcji ATP w warunkach normoksji, co opisano w kilku publikacjach ^3-5. Szybkości regeneracji PCr mogą być wykorzystane do określenia maksymalnej wydajności mitochondrialnej produkcji ATP w oparciu o podejście opisane wcześniej ^4,6.

Rysunek 1. Układ MRI in vivo widziany z przodu otworu magnesu. Układ składa się z cewki RF, systemu ogrzewania zwierząt (lub systemu cyrkulacji ciepłej wody) oraz wkładki gradientowej. Wszystkie te komponenty są umieszczone w poziomym magnesie. Ciepła woda jest podgrzewana w zbiorniku z wodą poza pomieszczeniem z magnesem i wprowadzana do systemu ogrzewania zwierząt za pomocą rurki Tygon (zielona taśma). Po cyrkulacji w cylindrze woda jest odprowadzana z systemu ogrzewania z powrotem do zbiornika w celu ponownego podgrzania. Rurka z izofluranem i rurka próżniowa są wykorzystywane do znieczulania myszy podczas eksperymentów MRI.
Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2. Obrazy in vivo myszy nagoj z ksenoprzeszczepem nowotworu (nowotwór D282) na grzbiecie (strzałka) przy różnych efektach relaksacji: A. Obraz T₁-zależny (TR/TE=500/14,2ms). B. Obraz T₂-zależny (TR/TE=2s/40ms). Zarówno obrazy T₁, jak i T₂-zależne zostały pozyskane za pomocą sekwencji spinowego echa. C. Mapa T₂ przetworzona z 4 zestawów obrazów pozyskanych przy różnych wartościach TE w zakresie od 20 do 80 ms. D. Obraz T₂*-zależny (TR/TE=180/7,39ms, kąt odchylenia = 20 stopni) pozyskany za pomocą sekwencji gradientowego echa. Dla wszystkich obrazów MR pole widzenia wynosi 35 x 35 mm².
Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3. Ilustracja myszy umieszczonej w poziomym uchwycie do ciała z nogą unieruchomioną w cewce RF.
Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Widma ³¹P in vivo podczas jednego cyklu niedokrwienia i reperfuzji. Dane zostały zebrane przy użyciu magnesu z pionowym otworem o natężeniu 7 T i poszerzone liniowo za pomocą filtra wykładniczego 20 Hz. TR=1, na=4, wykreślono co 20 widm.
Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1. Dawkowanie środka anestetycznego do MRI/MRS u myszy.

Zwierzę Gatunek	Środek anestetyczny	Dawka (mg/kg dla preparatów do wstrzykiwania)	Droga podania
Mysz	Gaz izofluranowy	4.0% przez 2-3 min (indukcja), następnie 1.2 do 1.5% w sposób ciągły (podtrzymanie)	Wdechowo przez stożek nosowy
Mysz	Awertyna	5%, 10ml/kg masy ciała	dosytnnowlewowo (IP)
Mysz	Ketamina/Ksylazyna	100 mg/kg i 10 mg/kg	IP

Tabela 2. Obraz z ważeniem czasów relaksacji

Kontrast obrazu	TR (czas powtórzenia)	TE (czas echa)
T1	Krótki (krótszy niż T1)	Krótki (krótszy niż T2)
T2	Długi (3 ~ 5 razy T1)	Długi (około T2)
PD (gęstość protonów)	Długi (3 ~ 5 razy T1)	Krótki (krótszy niż T2)

T1: czas relaksacji spin-sieć (lub relaksacja podłużna)
T2: czas relaksacji spin-spin (lub relaksacja poprzeczna)

Dyskusja

Etapy poprzedzające akwizycję, takie jak dostrojenie/dopasowanie (tune/match) oraz shimowanie, są kluczowe dla uzyskania wysokiej rozdzielczości przestrzennej i wysokiego stosunku sygnału do szumu (SNR). Ważne jest również monitorowanie stanu zwierząt za pomocą systemu monitorowania, aby utrzymać stabilny stan fizjologiczny podczas akwizycji sygnałów, zgodnie z zasadami humanitarnego traktowania zwierząt oraz w celu zapobiegania potencjalnym pomiarom artefaktycznym. Procedury opisane w protokole mogą zostać zmodyfikowane...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Skaner MR Inova 200/4,7 T	Varian Inc., Agilent		Używany do obrazowania MRI myszy
Spektrometr NMR Inova 300/7 T	Varian Inc., Agilent		Używany do MRS mięśni szkieletowych myszy