Nieinwazyjne in vivo MRI i MRS małych zwierząt: Podstawowe procedury eksperymentalne

Podsumowanie

Niniejsza praca opisuje podstawowe procedury nieinwazyjnego obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) oraz spektroskopii rezonansu magnetycznego (MRS) małych zwierząt in vivo.

Streszczenie

Badania z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego (MR) małych zwierząt stały się istotnym elementem nowoczesnych badań biomedycznych ze względu na ich nieinwazyjny charakter oraz bogactwo dostarczanych informacji biologicznych. MR nie wymaga zastosowania promieniowania jonizującego i może nieinwazyjnie zapewnić wyższą rozdzielczość oraz lepszy stosunek sygnału do szumu w porównaniu z innymi metodami tomograficznymi lub spektroskopijnymi. W niniejszym protokole skupimy się na obrazowaniu MR oraz spektroskopii MR (MRI/MRS) małych zwierząt w celu nieinwazyjnego pozyskania danych ważonych przez relaksację¹Obrazy H myszy i aby uzyskać³¹Widma P mięśni mysich. Niniejsza praca nie ma na celu omówienia każdego aspektu MRI/MRS u małych zwierząt, lecz wprowadza podstawowe procedury eksperymentów MRI/MRS u myszy. Głównym celem tej pracy jest poinformowanie badaczy o podstawowych procedurach dotyczącychin vivoEksperymenty MR u małych zwierząt. Celem jest zapewnienie lepszego zrozumienia podstawowych procedur eksperymentalnych, aby badacze nowi w dziedzinie MR mogli lepiej zaplanować komponenty ich badań niezwiązane z MR, tak aby procedury MR i procedury poza-MR były ze sobą płynnie zintegrowane.

Protokół

Część 1: Bezpieczeństwo pracy z magnesami

Zarówno MRI, jak i MRS wykorzystują silne pole magnetyczne, co wymaga zachowania szczególnej ostrożności. Przykładowo, aparat 4,7 T użyty w niniejszej pracy wytwarza pole magnetyczne około 90 000 razy silniejsze od ziemskiego pola magnetycznego. Wysokie pole magnetyczne działa nieprzerwanie, nawet gdy skaner MR nie jest używany. Każdy metalowy przedmiot, który znajdzie się w tak silnym polu magnetycznym, zostanie gwałtownie i z dużą siłą przyciągnięty przez magnes. Jest to niezwykle niebezpieczne, jeśli badany lub operator znajduje się na torze lotu metalowego przedmiotu wciąganego przez magnes. Dlatego personel przeprowadzający eksperymenty MR powinien zadbać o usunięcie wszelkich metalowych przedmiotów z odzieży przed zbliżeniem się do urządzenia oraz dbać o to, aby w otoczeniu nie było takich przedmiotów. Bardziej szczegółowe informacje na temat bezpieczeństwa pracy z magnesem znajdują się w literaturze¹ oraz na następującej stronie internetowej: http://www.imrser.org/ . Obecność materiałów metalicznych może nie tylko powodować wspomniane problemy z bezpieczeństwem, ale także zakłócać wyniki eksperymentów poprzez indukowanie artefaktów obrazowania lub spektroskopowych. Materiał metaliczny znajdujący się w pobliżu lub wewnątrz obrazowanego obiektu może zmienić pole magnetyczne w jego sąsiedztwie, co prowadzi do powstawania artefaktów na uzyskanych obrazach lub poszerzenia szerokości linii widm.

W związku z tym, podczas pracy ze zwierzętami w procedurach MR, należy pozostawić portfel, klucze, długopisy itp. poza obszarem działania magnesu.

Część 2: Obrazowanie MRI in vivo myszy w magnesie z poziomym otworem

Przygotowanie zwierząt do badania MRI

1. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt powinny zostać zatwierdzone przez instytucjonalną komisję ds. opieki i wykorzystania zwierząt (IACUC) przed przystąpieniem do jakichkolwiek czynności związanych z obsługą zwierząt.
2. Do znieczulania zwierząt w eksperymentach MRI stosujemy odparowany izofluran. Znieczulenie zwierząt można przeprowadzić za pomocą innych środków, takich jak avertin (2,2,2-tribromoetanol lub TBE) oraz mieszaniny ketaminy i ksylazyny. Informacje dotyczące dawkowania każdego z leków znieczulających znajdują się w Tabeli 1.
3. Komorę indukcyjną wyłóż chłonną podkładką z plastikowym podkładem (niebieska podkładka lub podkładka typu chuck). Umieść mysz (lub kilka myszy w przypadku obrazowania wielu osobników) w komorze indukcyjnej.
4. Ustaw przepływomierz waporyzatora izofluranu na 0,8–1,5 L/min. Następnie ustaw waporyzator izofluranu na 4% przez około 2–3 minuty.
5. Po osiągnięciu chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia (tj. braku reakcji na uciśnięcie palca u nogi), umieść mysz w uchwycie dla zwierząt, wkładając jej nos do stożka nosowego (lub maski). Do obrazowania głowy można użyć stabilizatora głowy, a do obrazowania ciała – uchwytu do ciała.
6. Uchwyty dla zwierząt są stosowane w celu zapobiegania potencjalnym ruchom; dostępne są różne typy uchwytów komercyjnych. Można również wykonać uchwyt na specjalne zamówienie, aby dostosować go do szczególnych wymagań układu eksperymentalnego. W przypadku uchwytu projektowanego na zamówienie należy upewnić się, że zastosowano wyłącznie materiały niemagnetyczne.
7. W czasie obrazowania ustaw przepływomierz na 0,4–0,8 mL/min i zmniejsz dawkę z waporyzatora izofluranu do 1,2–1,5%. Gazy wydychane z nosa myszy są zbierane przez pompę i usuwane do wewnętrznego systemu próżniowego.
8. Oczy zwierzęcia należy utrzymywać w wilgotności za pomocą sterylnej maści nawilżającej do oczu. Podczas eksperymentu zwierzę jest utrzymywane w temperaturze 35-37°C w systemie cyrkulacji ciepłej wody. Można stosować inne źródła ciepła, takie jak podgrzewane podkładki oraz ciepłe powietrze wdmuchiwane do cewki częstotliwości radiowej (RF).
9. Zastosowano system monitorowania zwierząt w celu kontroli temperatury ciała, cyklu oddechowego/sercowego oraz synchronizacji bramkowania oddechowego/sercowego z akwizycją obrazów.
10. Obok zwierzęcia umieszcza się standardową próbkę z agarozy w celu monitorowania nagłych zmian sygnału. Ta standardowa próbka agaru jest szczególnie użyteczna przy obrazowaniu wielowarstwowym i wielopunktowym w czasie. W przypadku wykrycia nieoczekiwanej zmiany sygnału w warstwie z pozyskanych obrazów, taką warstwę można wyeliminować. Ponadto natężenie sygnału można skorygować na podstawie zmiany sygnału próbki standardowej podczas analizy obrazów.
11. Po bezpiecznym umieszczeniu zwierzęcia i komponentów monitorujących w uchwycie, ustaw uchwyt w centrum cewki RF.
12. Przenieś cewkę RF do pomieszczenia z magnesem i włóż ją do systemu cyrkulacji ciepłej wody znajdującego się wewnątrz magnesu. Rysunek 2 przedstawia kilka komponentów skanera MRI widzianych z przodu otworu magnesu.

Eksperyment MRI

1. Dostrój cewkę RF do częstotliwości rezonansowej ¹H i dopasuj impedancję charakterystyczną cewki do 50 Ohm, korzystając z panelu strojenia w skanerze MR. Ma to na celu uzyskanie optymalnych warunków odbioru sygnału. Większość ludzkich skanerów MRI nie wymaga oddzielnego procesu strojenia/dopasowania, z wyjątkiem procedur MRS.
2. Przeprowadź proces shimowania (homogenizacji pola) przy użyciu pojedynczej sekwencji impulsów. Sygnał MR zależy od jednorodności otaczającego pola magnetycznego. Proces shimowania sprawia, że pole magnetyczne w obszarze zainteresowania jest jak najbardziej jednorodne. Każdy skaner MR posiada własny sposób wykonywania procesu shimowania, w tym automatyczne szybkie procesy, takie jak fast map i shimowanie gradientowe.
3. Zoptymalizuj impuls RF poprzez maksymalizację jednowymiarowego profilu obrazu. Można dobierać poziomy mocy impulsu RF, utrzymując stałą długość impulsu oraz odpowiednio długi TR (czas powtórzenia), który wynosi około 3 - 5x T₁ tkanki.
4. Pozyskaj obrazy zwiadowcze (scout images) w trzech ortogonalnych orientacjach, aby utworzyć obrazy w płaszczyźnie osiowej, czołowej i strzałkowej. Do pozyskania obrazów zwiadowczych można użyć szybkiej sekwencji akwizycji obrazu (np. sekwencji gradient echo lub fast spin echo). Pozyskane obrazy posłużą do zaplanowania właściwego obrazowania wraz z wyznaczeniem płaszczyzn obrazowania.
5. Zmień sekwencję na spin echo. Wybierz odpowiednie parametry sekwencji: TR (czas powtórzenia) powinien być od trzech do pięciu razy dłuższy niż T₁ tkanki, aby uzyskać obrazy w pełni zrelaksowane, takie jak obrazy gęstości protonowej lub obrazy ważone T₂. TE (czas echa) to odstęp czasu między pierwszym impulsem RF a centrum sygnału echa. Wartość TE można dobrać w zależności od kontrastu obrazu, jak podsumowano w Tabeli 2. Rysunek 2 przedstawia obrazy in vivo pozyskane przy różnych efektach relaksacji T₁, T₂ i T₂* dla myszy nagoj z ksenoprzeszczepem guza na grzbiecie.
6. Pomiary T₂ można przeprowadzić albo za pomocą obrazowania wieloechowego (multiecho), albo obrazowania pojedynczego echa z wieloma wartościami TE.
7. Po zakończeniu eksperymentu MRI/MRS in vivo zwierzęta powinny być monitorowane przez cały proces wybudzania. Po obrazowaniu MR zwierzęta zostaną wyjęte z cewki RF i monitorowane, aby upewnić się, że w pełni odzyskały sprawność po powrocie do klatki. U znieczulonych myszy utrata ciepła następuje szybko. Należy utrzymać zwierzęta w cieple, przykrywając je gazikami lub ręcznikami i/lub zapewniając źródło ciepła, aż zwierzęta wybudzą się z narkozy.

Przetwarzanie obrazów

1. Przejrzyj pozyskane obrazy na konsoli MR i prześlij wybrane dane do komputera do postprocessingu.
2. Do analizy obrazów zazwyczaj używamy programu ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Analiza obrazu obejmuje skalowanie/filtrowanie obrazu, obliczenia T₁, T₂ oraz dyfuzji, pomiary objętości guza oraz segmentację guzów.

Część 3. Spektroskopia rezonansu magnetycznego (MRS) in vivo mięśni szkieletowych kończyny tylnej myszy w magnesie z pionowym otworem

Konstrukcja mankietu do indukowania odwracalnego niedokrwienia

1. Zacznij od kawałka rurki PVC o szerokości około 5-7 mm i średnicy wewnętrznej 12-15 mm. Wywierć mały otwór w ściance tego elementu i wykonaj gwint.
2. Wytnij fragment balonu w taki sposób, aby był otwarty z obu stron (najlepiej sprawdzają się balony do helu). Przełóż ten fragment przez rurkę PVC, owiń go wokół niej i zaklej końce taśmą na zewnętrznej ściance rurki.
3. Użyj koszulki termokurczliwej, aby uszczelnić końce balonu wokół rurki. Powstanie mankiet z solidną ścianą zewnętrzną i nadmuchiwalną ścianą wewnętrzną.
4. Wytnij fragment koszulki termokurczliwej i balonu wokół otworu z gwintem, dbając o to, aby między otworem a krawędzią rurki PVC pozostało wystarczająco dużo materiału. Wkręć 1,5 cm element z metalu niemagnetycznego (np. mosiądzu) w otwór w PVC. Umożliwi to napompowanie mankietu. Uszczelnij ten obszar szybkoschnącą żywicą epoksydową (5-minutową).
5. Zamocuj ten mankiet obok cewki RF w sondzie MRS i podłącz go do zewnętrznego sfigmomanometru.

Własny monitor oddychania

1. Używamy monitora oddychania wykonanego na zamówienie, który został zaprojektowany tak, aby był kompatybilny z ograniczoną przestrzenią i dostępem do otworu magnesu. Dostępne są również kilka modeli komercyjnych.
2. Przywiąż mały balonik do końca odpornej na rozciąganie rurki wprowadzonej do sondy.
3. Podłącz drugi koniec rurki do przetwornika ciśnienia.
4. Upewnij się, że w rurce i baloniku nie ma pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki te spowodują tłumienie sygnału wynikającego z kompresji balonika wywołanej ruchami ciała myszy podczas oddychania.

Pozycjonowanie myszy w cewce MRS

1. Zanurz mysz w narkozie, podając 5% Avertin (0,010 ml/g masy ciała).
2. Po osiągnięciu chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia, umieść mysz w sondzie MRS, kładąc ją na plecach na podkładce dla myszy. Umieść wypełniony płynem balon na stronie brzusznej myszy i zabezpiecz go pasami podkładki.
3. Umieść mysz wraz z podkładką dla ciała w sondzie MRS.
4. Przeciągnij jedną tylną kończynę przez mankiet niedokrwienny i cewkę MRS. Noga powinna być w miarę możliwości wycentrowana w cewce. Taki układ pozwala na poziome ustawienie ciała myszy w magnesie z pionowym otworem (Rycina 3).
5. Ustabilizuj nogę, przyklejając stopę taśmą do sztywnego wspornika.
6. Umieść termoparę podskórnie w tylnej kończynie, poza obszarem próbkowanym przez cewkę.
7. Nawilż oczy maścią smarującą do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu. Przykryj oczy i pysk myszy, aby zapobiec ocieraniu lub podrażnieniu ścianki sondy.
8. W zależności od konkretnych potrzeb eksperymentu można dodać inne sondy monitorujące.

Przygotowanie eksperymentu MRS

1. Podłącz dopływ powietrza do elementu grzejnego sondy MRS.
2. W oprogramowaniu VNMR ustaw jednostkę sterowania temperaturą zmienną tak, aby utrzymać temperaturę nogi w zakresie 35-37 °C.
3. Dostrój częstotliwość cewki i dopasuj impedancję za pomocą panelu strojenia w oprogramowaniu MRS dla rezonansów ¹H oraz ³¹P.
4. Wyreguluj obwody shimowania, aby zoptymalizować jednorodność pola magnetycznego B1 w obszarze zainteresowania, wykorzystując spektroskopię ¹H.
5. Przełącz na częstotliwość ³¹P, aby określić szerokość impulsu RF zapewniającą maksymalny sygnał z jednego zaniku indukcji swobodnej (FID) (czas 90°).
6. Zbierz widma w pełni zrelaksowane (FRS) o wysokim stosunku sygnału do szumu, aby określić stosunki fosforanu nieorganicznego (P_i) i fosfokreatyny (PCr) do ATP w warunkach pełnej relaksacji. Widma te są zbierane przy użyciu czasu 90° z czasem między akwizycjami FID (TR) wynoszącym około 5-krotność T₁ dla PCr (20 sec przy 7 T). Posłużą one do ilościowego oznaczenia poziomów PCr i P_i z widm MR.

Eksperyment niedokrwienny

1. Prosta perturbacja niedokrwienna pozwala na oznaczenie spoczynkowej i maksymalnej produkcji ATP w mitochondriach poprzez pomiar zmian poziomu fosfokreatyny podczas niedokrwienia i bezpośrednio po nim.
2. Skonfiguruj sekwencję pomiarową w celu zebrania wielu widm, stosując szerokość impulsu 45° (tj. 0,5 x czasu impulsu 90°) oraz TR wynoszące 0,5x T₁ (~1,5 s). Zazwyczaj zbieramy 4 sygnały FID dla każdego widma (liczba uśrednień (na) = 4 w oprogramowaniu VNMR), co daje rozdzielczość czasową około 6 sekund. Taka rozdzielczość czasowa jest wystarczająca do dokładnego określenia spoczynkowej i maksymalnej produkcji ATP w mitochondriach.
3. Zbieraj widma w stanie spoczynku przez około 5 minut.
4. Wywołaj niedokrwienie, napompowując mankiet do ciśnienia 270-300 mmHg na 10-12 minut.
5. Zwolnij ucisk mankietu i zbieraj widma podczas regeneracji przez 5 minut.
6. Wyjmij sondę z magnesu, a mysz z sondy. Pozostaw mysz do wybudzenia z narkozy w odpowiednich warunkach. Eksperymenty można powtarzać w kolejnych dniach. Po ostatnim badaniu spektroskopowym należy pobrać mięśnie kończyn dolnych myszy i natychmiast zamrozić je metodą freeze-clamp w ciekłym N₂ w celu analizy stężeń ATP za pomocą HPLC.

Analiza danych

1. Dane są analizowane w trybie offline przy użyciu jednego z kilku programów do analizy widm NMR. W naszym laboratorium do kwantyfikacji pól powierzchni piku zazwyczaj stosuje się fit to standard ² oraz jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml).
2. Wstępne szybkości rozpadu PCr podczas niedokrwienia są miarą mitochondrialnej produkcji ATP w warunkach normoksji, co opisano w kilku publikacjach ^3-5. Szybkości regeneracji PCr mogą być wykorzystane do określenia maksymalnej wydajności mitochondrialnej produkcji ATP w oparciu o podejście opisane wcześniej ^4,6.

Rysunek 1. Układ MRI in vivo widziany z przodu otworu magnesu. Układ składa się z cewki RF, systemu ogrzewania zwierząt (lub systemu cyrkulacji ciepłej wody) oraz wkładki gradientowej. Wszystkie te komponenty są wprowadzone do poziomego magnesu. Ciepła woda jest podgrzewana w zbiorniku na wodę poza pomieszczeniem z magnesem i wprowadzana do systemu ogrzewania zwierząt przez rurkę Tygon (zielona taśma). Po cyrkulacji w cylindrze woda jest odprowadzana z systemu ogrzewania z powrotem do zbiornika na wodę w celu ponownego podgrzania. Rurka do izofluranu i rurka próżniowa są używane do znieczulania myszy podczas eksperymentów MRI.
Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2. Obrazy in vivo myszy nude z ksenoprzeszczepem nowotworowym (nowotwór D282) na grzbiecie (strzałka) z różnymi efektami relaksacji: A. Obraz T₁-zależny (TR/TE=500/14,2ms). B. Obraz T₂-zależny (TR/TE=2s/40ms). Oba obrazy T₁ i T₂ zostały pozyskane za pomocą sekwencji spin echo. C. Mapa T₂ przetworzona z 4 zestawów obrazów pozyskanych przy różnych wartościach TE w zakresie od 20 do 80 ms. D. Obraz T₂*-zależny (TR/TE=180/7,39ms, kąt odchylenia = 20 stopni) pozyskany za pomocą sekwencji gradient echo. Pole widzenia 35 x 35 mm² zastosowano dla wszystkich obrazów MR.
Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3. Ilustracja myszy umieszczonej w poziomym uchwycie do ciała z nogą zabezpieczoną w cewce RF.
Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Widma ³¹P in vivo podczas jednego cyklu niedokrwienia i reperfuzji. Dane zebrano przy użyciu magnesu z pionowym otworem 7 T, a linie poszerzono za pomocą filtra wykładniczego 20 Hz. TR=1, na=4, wykreślono co 20 widm.
Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Dawkowanie środka znieczulającego do badania MRI/MRS u myszy.

Zwierzę Gatunek	Środek anestetyczny	Dawka (mg/kg dla preparatów do wstrzykiwania)	Droga podania
Mysz	Gaz izofluranowy	4.0% przez 2-3 min (indukcja), następnie 1.2 do 1.5% w sposób ciągły (podtrzymanie)	Inhalacyjnie przez stożek nosowy
Mysz	Avertin	5%, 10ml/kg masy ciała	doszpaniowo (IP)
Mysz	Ketamina/Ksylazyna	100 mg/kg i 10 mg/kg	IP

Tabela 2. Obraz z ważeniem czasu relaksacji

Kontrast obrazu	TR (czas repetycji)	TE (czas echa)
T1	Krótki (krótszy niż T1)	Krótki (krótszy niż T2)
T2	Długi (3 ~ 5 razy T1)	Długi (około T2)
PD (gęstość protonowa)	Długi (3 ~ 5 razy T1)	Krótki (krótszy niż T2)

T1: czas relaksacji spin-sieć (lub relaksacji podłużnej)
T2: czas relaksacji spin-spin (lub relaksacji poprzecznej)

Dyskusja

Etapy poprzedzające akwizycję, takie jak dostrojenie/dopasowanie (tune/match) oraz shimowanie, są kluczowe dla uzyskania wysokiej rozdzielczości przestrzennej i wysokiego stosunku sygnału do szumu (SNR). Ważne jest również monitorowanie stanu zwierząt za pomocą systemu monitorowania, aby utrzymać stabilny stan fizjologiczny podczas akwizycji sygnałów, zgodnie z zasadami humanitarnego traktowania zwierząt oraz w celu zapobiegania potencjalnym pomiarom artefaktycznym. Procedury opisane w protokole mogą zostać zmodyfikowane...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Skaner MR Inova 200/4,7 T	Varian Inc., Agilent		Używany do obrazowania MRI myszy
Spektrometr NMR Inova 300/7 T	Varian Inc., Agilent		Używany do MRS mięśni szkieletowych myszy