Historyczne ujęcie i demonstracja fizjologii złącza neuromięśniowego mięśnia otwieracza raków

Podsumowanie

Mięsień otwierający odnóża raków został zaprezentowany ze względu na jego historyczne znaczenie oraz wszechstronność eksperymentalną w badaniach nad fenotypem mięśni, fizjologią synaptyczną i plastycznością.

Streszczenie

Przedstawiamy tutaj niektóre z kluczowych odkryć dokonanych z wykorzystaniem preparatu złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ) skorupiaków z otwieracza oraz wykazujemy, że model ten wciąż dostarcza wielu cennych informacji. Zrozumienie historii tego modelu pozwala docenić, dlaczego nawet dzisiaj NMJ to wciąż obszerny poligon doświadczalny do badania pytań dotyczących funkcji i plastyczności presynaptycznej oraz postsynaptycznej. Istotnymi zaletami są żywotność oraz łatwy dostęp do zakończenia nerwowego w celu prowadzenia elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej i zewnątrzkomórkowej, a także obrazowania. Mechanizmy leżące u podstaw modulacji kinetyki pęcherzykowej i fuzji w zakończeniach o wysokiej i niskiej wydajności wymagają dalszych badań. Preparat ten stanowi również testowalny system modelowy dla oceny obliczeniowej i manipulacji w celu zbadania kluczowych zmiennych w teoretycznych modelach funkcji synaptycznej, na przykład dynamiki wapnia podczas krótkotrwałego ułatwienia. Złożoność synaptyczna strefy aktywnej oraz statystyczna natura uwalniania kwantowego stanowią również otwarte obszary przyszłych badań, zarówno eksperymentalnych, jak i obliczeniowych.

Protokół

Wstęp

Złącza nerwowo-mięśniowe skorupiaków wniosły przez lata istotny wkład w rozwój fizjologii, a w szczególności fizjologii synaptycznej. Łatwość preparowania oraz żywotność tkanek są prawdopodobnie kluczowymi czynnikami, które skłoniły wczesnych anatomów, a później fizjologów, do wykorzystania skorupiaków w preparatach eksperymentalnych. Rakowate są szczególnie łatwo dostępne w większości słodkowodnych strumieni i jezior, a ponadto są łatwiejsze w utrzymaniu w warunkach laboratoryjnych w porównaniu do skorupiaków wymagających zimnego, słonego środowiska wodnego.

Pod koniec XIX wieku zoolog szczególnie zainteresował się konkretnymi gatunkami skorupiaków (tj. rakami) i napisał książkę zatytułowaną The Crayfish ( T.H. Huxley, 1879). Tekst ten przez lata służył jako podręcznik dotyczący tych organizmów i do dziś jest uznawany za kompleksowe opracowanie poświęcone wyłącznie rakom, obejmujące ich historię życia, anatomię i fizjologię. Huxley postrzegał raka jako zwierzę modelowe pozwalające zgłębić wszystkie aspekty zoologii, co tłumaczy wyczerpujący charakter jego książki. Moment publikacji był korzystny, ponieważ pod koniec lat 80. XIX wieku fizjologia przeżywała rozkwit, czego przykładem było zrozumienie przez Ringera roli jonów niezbędnych do utrzymania preparatów serca żaby (Ringer, 1882a,b). Prawdopodobnie była to jedna z przyczyn szybkiego postępu eksperymentów fizjologicznych u innych gatunków, w tym u raków. Ponadto w 1936 roku van Harreveld opisał roztwór soli fizjologicznej do utrzymania preparatów skorupiaków.

Co zaskakujące, w tym samym czasie w historii charakteryzowano również unerwienie mięśnia otwierającego w odnóżach raków (Biedermann, 1887). Jeszcze bardziej zdumiewające jest to, że badania fizjologiczne mięśni raków były już prowadzone przez Charlesa Richeta we Francji. W rzeczywistości eksperymenty na rakach mogły być pierwszymi, które wykazały facylitację w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) (Richet, 1879; patrz również Richet, 1881). W ciągu kolejnych kilku dekad NMJ u raków opisywano anatomicznie i fizjologicznie pod kątem rozwoju napięcia oraz budowy anatomicznej (Van Harreveld i Wiersma, 1936).

Wprowadzenie rejestracji wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroelektrod ostrych (Ling and Gerard, 1949) ożywiło tę dziedzinę, pozwalając na zgłębienie nowych zagadnień. Znano już fakt, że mięśnie skorupiaków generują skurcze stopniowane (Katz & Kuffler 1946; Katz, 1949; Wiersma, 1949), jednak dopiero w 1953 roku Fatt i Katz zarejestrowali potencjały błonowe krótkotrwałej facylitacji w włóknach mięśniowych kraba.

Mięsień otwierający w odnóżach raków został ponownie wyróżniony w 1961 roku, kiedy Dudel i Kuffler wykazali facylitację w tym mięśniu i po raz pierw^szy zaprezentowali zjawisko hamowania presynaptycznego (1961a,b; Dudel, 1963, 1965a). Raportowali oni również o kwantowej naturze przekaźnictwa synaptycznego w tym złączu NMJ (1961b). W ciągu ostatnich 50 lat poświęcono sporo uwagi tej preparacji oraz różnym technikom wykorzystywanym do monitorowania fizjologii synaptycznej. W krótkim przeglądzie badań z wykorzystaniem tej preparacji zaczniemy od uwagi, że cały mięsień jest unerwiony przez jeden akson pobudzający i jeden hamujący, które można stymulować selektywnie. Atwood (1964) wykazał, że serie stymulacji powodują facylitację pobudzających potencjałów postsynaptycznych i wywołują napięcie mięśniowe. Iravani (1965) donosił o regionalnych różnicach w odpowiedziach synaptycznych w zależności od obszaru mięśnia. Wkrótce potem Dudel (1965a,b) zarejestrował potencjały wzdłuż zakończeń nerwowych mięśnia otwierającego i wykazał, że neuromodulator serotonin zwiększa przekaźnictwo synaptyczne poprzez zwiększenie średniej zawartości kwantowej.

Do tego czasu ustalono, że mięśnie skorupiaków reagują na glutaminian i różne aminokwasy, a także na GABA (Van Harreveld i Mendelson, 1959; Robbins, 1959; Kerkut et al., 1965). Hamujące odpowiedzi na GABA zostały zidentyfikowane przez Floreya (Bazemore et al., 1956, 1957) oraz innych badaczy (Boistel i Fatt, 1958). Później GABA została wyizolowana i potwierdzona przez Kravitza (Kravitz i Potter, 1965; Kravitz et al., 1963a,b; Kravitz, 1962) z aksonów w preparatach mięśnia otwieracza homara.

Mięśnie raków zapewniają nie tylko łatwo dostępne preparaty, ale pozwalają również badać, w jaki sposób pojedyncze, zidentyfikowane neurony ruchowe mogą wywoływać zróżnicowane odpowiedzi postsynaptyczne na poziomie fizjologicznym i strukturalnym. W szczególności mięsień otwierający jest unerwiony przez pojedynczy pobudzający neuron ruchowy, jednak pobudzeniowe potencjały postsynaptyczne (EPSPs) w różnych lokalizacjach mogą różnić się ponad 50-krotnie w grzbietowych włóknach powierzchownych (Bittner, 1968a,b) i aż 8-krotnie w brzusznych włóknach powierzchownych (Iravani, 1965).

Po przełomowym odkryciu, że złącze neuromięśniowe (NMJ) mięśnia otwieracza u raka wykazuje długotrwałe ułatwienie (LTF) (Sherman and Atwood, 1971), oprócz ułatwienia krótkotrwałego, konieczne stało się zbadanie mechanizmów leżących u podstaw tych zjawisk. Warto zauważyć, że długotrwałe wzmocnienie synaptyczne (LTP) odkryto w mózgach kręgowców dwa lata później (Bliss and L mo, 1973), bez powołania się na pierwotne odkrycie tego zjawiska w NMJ raka. Od tego czasu wielu badaczy skupiało się na cechach STF i LTF, wykorzystując NMJ mięśnia otwieracza raka do badania mechanizmów komórkowych (Atwood, 1973, 1976, 1982; Atwood et al., 1994; Zucker, 1973, 1974a,b; Bittner and Sewell, 1976; Parnas et al., 1982a,b,c,d; Dudel et al., 1983; Vyshedskiy and Lin, 1997a,b,c). Punktem ciężkości było również zrozumienie, w jaki sposób pojedynczy neuron ruchowy, unerwiający różne włókna mięśniowe w mięśniu otwieraczu, może generować tak zróżnicowane odpowiedzi synaptyczne (Linder, 1974; G¨nzel et al., 1993; Govind et al., 1994; Iravani, 1965; Atwood, 1967; Bittner, 1968a,b; Sherman and Atwood, 1972; Zucker, 1974a; Parnas et al., 1982a; Zucker and Haydon, 1988; Dudel, 1989a,b,c,d).

Strukturę synaptyczną odpowiedzialną za różnice w odpowiedziach synaptycznych można badać za pomocą analizy ultrastrukturalnej (Jahromi i Atwood, 1974). Różnice w stężeniu jonów wynikające z aktywności można badać poprzez aksonalne wstrzykiwanie wskaźników Ca2+ i Na+ oraz buforów Ca2+ (Mulkey i Zucker 1993; Winslow et al., 2002), a przepływy te można modelować w obrębie zakończenia nerwowego (Winslow et al., 1994; Cooper et al., 1996b). Badano również zależne od aktywności adaptacje (Atwood et al., 1991) oraz farmakologiczną identyfikację podtypów receptorów neuromodulatorowych (Dropic et al., 2005; Ruffner et al., 1999; Sparks i Cooper, 2004; Sparks et al., 2004; Tabor i Cooper, 2002; ), które wpływają na pule i kinetykę pęcherzyków synaptycznych (Logsdon et al., 2005; Southard et al., 2000; Sparks et al., 2003), co prowadzi do stawiania nowych pytań badawczych. Koncepcje roli wapnia podczas STF w przeciwieństwie do depolaryzacji błony w przekazywaniu synaptycznym w otwartym NMJ prowadzą do pewnych rozbieżności w opiniach (Mulkey i Zucker, 1991; Hochner et al, 1989).

Stosunkowo niedawno zajęto się kwestią regionalnego zróżnicowania siły synaptycznej i facylitacji w obrębie pojedynczego motoneuronu, co zdaje się wynikać z lokalnych zmian presynaptycznych w strukturze i fizjologii synapsy (Atwood et al., 1994; Atwood and Cooper, 1995, 1996a,b; Cooper et al., 1995b, 1996a,b). Analiza ultrastrukturalna przeprowadzona na podstawie badań mikroskopii elektronowej wykazała, że w żargonach (varicosities) znajduje się większość kontaktów synaptycznych (Florey and Cahill, 1982; Cooper et al., 1995b). Siła przekaźnictwa synaptycznego maleje wzdłuż długości pojedynczego zakończenia, co zdaje się wynikać ze złożoności struktury synaptycznej (Cooper et al., 1996a; Govind et al., 1994). Różnice w strukturze synaptycznej mogą częściowo wyjaśniać różnice w napływie Ca2+ podczas stymulacji o różnych częstotliwościach (Cooper et al., 1995b, 1996b).

Z uwagi na regionalne różnice w fenotypie i biochemii mięśni pomiędzy włóknami mięśniowymi mięśnia otwieracza (G¨nzel, et al., 1993; Mykles et al., 2002), które są podzielone na regiony, można by wyjaśnić istnienie regulowanego rozwojowo fenotypu mięśnia, który wpływa na regionalne różnice neuronów ruchowych i je utrzymuje (Mykles et al., 2002). Koncepcja wpływów wstecznych była badana w mięśniach szkieletowych żaby (Nudell and Grinnell, 1983), u homara (Katz et al., 1993) oraz u raków (Lnenicka and Mellon, 1983), przy czym uzyskano dość przekonujące dowody. Lokalna regulacja zakończeń w pojedynczym neuronie, bez wpływania na inne zakończenia, jest przestrzennie możliwa w neuronach ruchowych skorupiaków, ponieważ zakończenia te mogą być oddalone od siebie od 1cm do 10cm. W przeciwieństwie do kręgowców, jednostka ruchowa u bezkręgowców może obejmować więcej niż jeden mięsień (patrz przegląd Atwood, 1973). Pobudzający neuron ruchowy, który unerwia cały mięsień otwieracz, unerwia również mięsień rozciągacz w bardziej proksymalnym segmencie nogi. Pomiary facylitacji pomiędzy włóknami mięśniowymi mięśnia otwieracza wykazały różnice, które mogą być związane z poziomem spoczynkowym jonów Ca2+ (Cooper et al., 2005b) i/lub ewentualną kooperatywnością uwalniania (Parnas et al., 1982a,b)

Zbadano różnice w złożoności strukturalnej między synapsami o wysokim i niskim stopniu uwalniania wzdłuż zakończeń mięśnia otwierającego pod kątem sygnatur kwantowych w odniesieniu do rekrutacji stref aktywnych w synapsach podczas STF, jednak ustalenie tego okazało się trudne (Lancaster et al., 2007; Viele et al., 2003, 2006). Możliwe, że pule pęcherzyków w synapsach o wysokim i niskim stopniu uwalniania wykazują różnice w kinetyce regulacji, ponieważ wiadomo, że neuromodulatory mają odmienne działanie na zakończenia o niskim i wysokim stopniu uwalniania (Logsdon et al., 2005; Sparks and Cooper, 2004; Cooper et al., 2003).

Przyszłe możliwości wykorzystania preparatu mięśnia otwieracza u raków są tak szerokie, jak 50 czy 100 lat temu. Preparat ten pozostaje bardzo wytrzymały w porównaniu z wieloma innymi preparatami synaptycznymi. Odpowiedzi kwantowe mogą być rejestrowane elektrofizjologicznie bezpośrednio w kontaktach synaptycznych, a także obrazowane pod kątem dynamiki pęcherzyków w różnych typach dobrze zdefiniowanych zakończeń. Preparat nie stracił swoich zalet, takich jak obecność pojedynczych, identyfikowalnych neuronów dla wejść pobudzających i hamujących. Mimo że raki nie nadają się do manipulacji genetycznych, możliwe jest badanie roli białek synaptycznych, podobnie jak w przypadku Drosophila. W zakresie funkcji synaptycznych istnieje wiele podobieństw do złączy neuromięśniowych (NMJ) Drosophila (Atwood i Cooper, 1995, 1996a,b), które można badać za pomocą iniekcji białek (He et al., 1999). Regulacja pul pęcherzyków synaptycznych w obrębie zakończeń nerwów ruchowych stanowi równie obiecujący obszar przyszłych badań, podobnie jak studia mechanistyczne mające na celu zrozumienie regulacji wapniowej podczas STF (Desai-Shah et al., 2008; Desai-Shah i Cooper, 2009), co pozwoli wyjaśnić wiele pozostałych zagadek dotyczących podstaw przekazywania synaptycznego.

Metody

Disekcja

Rak amerykański, Procambarus clarkii, o długości ciała 6-10 cm (Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA), zostaje poddany indukcji autotomii pierwszej lub drugiej odnóży krocznej poprzez silne ściśnięcie w obrębie segmentu ischiopodite.

Obróć odnoga tak, aby mieć pewność, że strona zewnętrzna (boczna) jest skierowana ku górze na płytce sekcyjnej. Zazwyczaj jest to strona wypukła. Położenie odnogi na kawałku ręcznika papierowego ułatwia obracanie preparatu podczas wykonywania tych cięć.

Za pomocą łamacza i uchwytu ostrzy skalpela używa się ostrego ostrza do nacięcia kutykuli, aż do całkowitego przecięcia, zgodnie ze schematem przedstawionym na tej figurze dla segmentu meropoditu. Należy zachować ostrożność, aby nie naciąć zbyt daleko dystalnie podczas cięcia od strony grzbietowej do brzusznej w stawie meropoditu z karpopoditem. Na razie pozostaw kutykulę w niezmienionej pozycji.

Za pomocą ostrza skalpela naciąć kutykulę propodytu, wykonując cięcia zgodnie z wzorem przedstawionym na powyższej rycinie dla segmentu propodytu po jednej stronie, a następnie powtórzyć czynność po drugiej stronie, łącząc cięcia proksymalne. Należy zachować ostrożność, aby nie przeciąć mięśnia otwierającego. Można tego dokonać, przechylając ostrze w stronę mięśnia położonego bliżej podczas przecinania kutykuli. Podczas wykonywania cięcia od strony grzbietowej do brzusznej, łącząc je po stronie brzusznej, należy uważać, aby nie ciąć zbyt proksymalnie, ponieważ połączenie stawowe jest wąskie i łatwo ulega uszkodzeniu. Na razie pozostawić kutykulę w miejscu.

Preparaty należy umieścić w roztworze soli fizjologicznej. Pojemnik do sekcji powinien mieć na dnie warstwę Sylgard (Dow Corning) o grubości 1cm. Sylgard stosuje się po to, aby móc wbijać w niego szpilki entomologiczne w celu unieruchomienia preparatu. W tym momencie należy wbić szpilkę w grzbietowy kąt końcowy, w obrębie nacięcia okna wykonanego w meropodzie.
Za pomocą precyzyjnej pęsety (#5) należy lekko unieść kutykulę od strony dystalnej, a następnie za pomocą żyletki odciąć włókna mięśnia zginacza od kutykuly, przecinając je w kierunku od strony dystalnej do proksymalnej. Następnie należy zdjąć okno kutykularne.

Następnie przetnij apodema (ścięgno) w stawie meropoditu z karpopoditem (pokazano poniżej). Należy bardzo uważać, aby odciągnąć ścięgno od jamistej części nogi przed wykonaniem cięcia oraz przeciąć wyłącznie ścięgno, a nie główny nerw nogi, który znajduje się po wewnętrznej stronie ścięgna. Chwyć pęsetą ścięgno w miejscu cięcia i oddziel mięsień zginacz, unosząc go w kierunku ogonowym. Teraz odsłonięte są główny nerw nogi oraz mięsień prostownik.

Przejdź do segmentu propodytu i wykonaj cięcie w stawie propodytowo-daktylopodycie. W tym miejscu ścięgno mięśnia przywodzącego może zostać odcięte od przyczepu kutykuli. Odciągnij brzuszny (strona mięśnia przywodzącego) segment propodytu w dół i ku tyłowi, tak aby widoczny był mięsień przyczepiony w obszarze kądowym. Przetnij te mięśnie żyletką. Należy uważać, aby nie przeciąć mięśnia zbyt blisko stawu, co mogłoby spowodować uszkodzenie gałęzi nerwu ruchowego prowadzącego do mięśnia odwodzącego. Mięsień odwodzący jest teraz wystawiony na działanie soli fizjologicznej.

Należy powrócić do regionu meropoditu, aby wyizolować wiązki nerwowe zawierające pobudzające i hamujące neurony ruchowe mięśnia otwieracza. W najbardziej kaudalnym regionie segmentu meropoditu wiązka nerwów nogi zazwyczaj zawiera oddzielną wiązkę nerwową. Ten krótki obszar, w którym widoczne są dwie wiązki, jest miejscem, w którym można przeciąć wiązkę grzbietową za pomocą cienkich nożyczek. Przecięty koniec można następnie chwycić pęsetą nr 5 i delikatnie pociągnąć dystalnie, aż do osiągnięcia około połowy długości segmentu meropoditu. Ta długa gałąź nerwowa zawiera pobudzający nerw otwieracza, a większa wiązka nerwów zawiera hamujący neuron ruchowy mięśnia otwieracza.

Preparat w segmencie meropoditu należy teraz przeciąć ukośnie w taki sposób, aby przez jego grzbietową stronę można było wbić szpilkę entomologiczną. Pozwala to na ustawienie brzusznej strony mięśnia otwierającego do góry, tak aby była ona skierowana w stronę obserwatora (jak pokazano poniżej).

Pozostałe włókna mięśnia przyciągającego, które zasłaniają widok na mięsień rozwierający, można teraz usunąć, przesuwając je w kierunku kutykuli i poza jamę propodytu. Czasami mięsień rozwierający jest pokryty tkanką łączną, którą można usunąć, ostrożnie używając pęsety nr 5. Główny nerw nogi, który biegnie wzdłuż mięśnia rozwierającego i wchodzi do daktylopodytu, można przeciąć na początku stawu daktylopodytu lub po prostu wyciągnąć za pomocą precyzyjnej pęsety. Ten główny nerw nogi oraz czasami wyraźnie widoczne związane z nim naczynie krwionośne można teraz delikatnie pociągnąć w kierunku proksymalnym na całej długości mięśnia rozwierającego, a następnie odciąć.

Obecnie mięsień otwierający jest odsłonięty, bez żadnych tkanek, które mogłyby przeszkadzać w dostępie elektrody wewnątrzkomórkowej lub ogniskowej elektrody macropatch.

Aby pobudzić nerw pobudzający mięsień otwierający, preparat przenosi się teraz do komory rejestracyjnej wyposażonej w plastikową elektrodę ssącą. Dzięki wbudowaniu elektrody stymulującej w komorze nie ma konieczności używania mikromanipulatora do jej umieszczenia. Przymocuj preparat szpilkami w naczyniu rejestracyjnym i umieść odgałęźnię nerwu zawierającą nerw pobudzający w elektrodzie ssącej.

(pobrano z: Mykles, D.L., Medler, S.A., Koenders, A., and Cooper, R.L. (2002) Myofibrillar protein isoform expression is correlated with synaptic efficacy in slow fibres of the claw and leg opener muscles of crayfish and lobster. Journal of Experimental Biology 205 (4): 513-522.)

Sól fizjologiczna

Preparaty po sekcji utrzymuje się w soli fizjologicznej dla raka, która jest zmodyfikowanym roztworem Van Harrevelda (w mM: 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl2.2H2O; 2,45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES z pH dostosowanym do 7,4).

Rejestracja wewnątrzkomórkowych EPSP

Aby wywołać odpowiedź, akson pobudzający jest selektywnie stymulowany za pomocą stymulatora Grass. W obszar mięśnia otwierającego wprowadza się ostrą elektrodę wewnątrzkomórkową (oporność od 20 do 30 mOhm) wypełnioną 3 M KCl. Można zastosować standardową głowicę i wzmacniacz do rejestracji wewnątrzkomórkowej; w naszym przypadku wykorzystano wzmacniacz modelu Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) oraz głowicę 1 X LU. Ułatwienie krótkotrwałe (STF) lub inne pożądane rodzaje odpowiedzi można uzyskać poprzez zmianę warunków stymulacji. STF uzyskuje się poprzez podanie serii 10 lub 20 impulsów w odstępach odpowiednio 10 lub 20 sekund do nerwu pobudzającego. Częstotliwość stymulacji w obrębie serii może być zmienna (40, 60 i 80 Hz). Rejestracje wewnątrzkomórkowe EPSP są rutynowo przeprowadzane zgodnie z tymi standardowymi procedurami (Crider & Cooper, 1999, 2000; Cooper et al. 1995b; Dudel, 1983; Sparks and Cooper, 2004; Desai-Shah and Cooper, 2009).

Mięsień otwierający jest podzielony na trzy ogólne obszary: dystalny, centralny i proksymalny. Pomimo że cały mięsień otwierający jest unerwiony przez jeden neuron ruchowy, złącza neuromięśniowe (NMJ) różnią się pod względem strukturalnym i wykazują regionalne różnice w skuteczności synaptycznej w tych trzech obszarach (Cooper et al. 1995a,b). Wykazano również, że fenotyp włókien mięśniowych różni się w tych regionach (Mykles et al. 2002). Z tych powodów wykorzystuje się włókna najbardziej dystalne, ponieważ są one łatwo wyznaczone, co zapewnia spójność między preparatami.

Rejestracja ogniskowych kwantowych EPSP bezpośrednio nad zidentyfikowanymi obszarami zakończeń nerwowych

Zgrubienia synaptyczne są wizualizowane za pomocą barwnika witalnego 4-Di-2-Asp (Magrassi et al., 1987), który w zastosowanych stężeniach i czasach (5 μM, 5-minutowa inkubacja, Cooper et al., 1995b) nie wpływa na przekaźnictwo synaptyczne. Wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną, światło elektrody rejestrującej typu macro-patch (Cooper et al., 1995c; St¨hmer et al.,1983) można umieścić bezpośrednio nad pojedynczym, wyizolowanym zgrubieniem. W celu pobudzenia zakończenia nerwowego stymulowany jest pobudzający nerw ruchowy, zgodnie z opisaną wcześniej procedurą. Spontaniczne oraz wywołane odpowiedzi kwantowe można rejestrować wzdłuż szeregu zwizualizowanych zgrubień, delikatnie obniżając i podnosząc światło elektrody nad każdym z nich.

Potencjały synaptyczne są rejestrowane za pomocą elektrody macro-patch, zgodnie z opisem Dudela (1981), Wojtowicza et al. (1991) oraz Mallarta (1993). Szkło Kimax (średnica zewnętrzna: 1.5 mm) było dociągane i polerowane ogniowo w celu uzyskania końcówek patch o średnicach wewnętrznych od 10 do 20 μm. Światło elektrody jest wypełnione medium kąpielowym. Wzmacniacz jest taki sam, jak ten użyty do wspomnianych wyżej pomiarów wewnątrzkomórkowych. Rezystancję elektrody i uszczelnienia (seal resistance) można określić poprzez przepuszczenie impulsów prądu testowego przez elektrodę. Rezystancja uszczelnienia wynosiła od 0.3 do 1.0 MΩ, a rezystancja elektrody od 0.5 do 1.0 MΩ. Rezystancja uszczelnienia może być monitorowana przez cały czas trwania rejestracji.

Bezpośrednie zliczanie zdarzeń kwantowych jest możliwe przy niskich częstotliwościach stymulacji. Dla każdej odpowiedzi wywołanej można określić liczbę zdarzeń kwantowych. W przypadku serii odpowiedzi zlicza się całkowitą liczbę zdarzeń kwantowych, aby następnie oszacować średnią zawartość kwantową na podstawie tych bezpośrednich obliczeń. Jednym z podejść do obliczenia średniej zawartości kwantowej jest przyjęcie całkowitej liczby kwantów i podzielenie jej przez całkowitą liczbę odpowiedzi (del Castillo i Katz, 1954). Można również zastosować inne podejścia oparte na amplitudzie szczytowej lub polu powierzchni EPSP (Cooper et al., 1995b).