Izolacja i oczyszczanie neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania magnetycznego z użyciem kulek

Podsumowanie

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji i oczyszczania neuronów obwodowych Drosophila z wykorzystaniem strategii szybkiego sortowania komórek wspomaganego magnetycznymi kulkami. RNA uzyskane z wyizolowanych komórek może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach, w tym w badaniach mikromacierzy.

Streszczenie

TheDrosophilaobwodowy układ nerwowy (PNS) stanowi potężny model do badania złożonych procesów rozwoju neuronów oraz morfogenezy dendrytów na poziomie funkcjonalnym i molekularnym. Aby wspomóc te analizy, opracowaliśmy strategię izolacji podklasy neuronów PNS zwanych neuronami arboryzacji dendrytycznej (da), które są szeroko wykorzystywane do badania morfogenezy dendrytów^1,2Neurony te są bardzo trudne do wyizolowania jako czysta populacja, co wynika częściowo z ich niezwykle niskiej liczebności oraz trudno dostępnej lokalizacji pod twardą chitynową kutykulą larwy. Opracowana przez nas nowa metoda pozwala pokonać te trudności i opiera się na szybkim oraz specyficznym wzbogacaniu komórek przy użyciu magnetycznych kulek pokrytych przeciwciałami. W badaniach nad sortowaniem za pomocą kulek magnetycznych wykorzystaliśmy larwy w trzecim stadium rozwoju o tym samym wieku, wykazujące ekspresję białka fuzyjnego GFP z tagiem mysiego CD8 (UAS-mCD8-GFP)³pod kontrolą specyficznych dla neuronów dendrytycznych klasy IV (da)pickpocket (ppk)-GAL4sterownik⁴dla kontroli pan-da neuron-specyficznego GAL4^21-7sterownik⁵Choć niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem izolacji komórek PNS przytwierdzonych do wewnętrznej ściany kutykuli larwy, poprzez zmianę kilku parametrów ten sam protokół można wykorzystać do izolacji wielu różnych typów komórek przytwierdzonych do kutykuli w stadiach larwalnym lub pupalnym rozwoju (np. nabłonków, mięśni, oenocytów itp.) lub innych typów komórek z organów larwalnych, w zależności od wzorca ekspresji specyficznego drivera GAL4. RNA wyizolowane tą metodą charakteryzuje się wysoką jakością i może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach genomicznych, takich jak badania profilowania ekspresji genów metodą mikromacierzy. Podejście to stanowi potężne nowe narzędzie do przeprowadzania badań na wyizolowanychDrosophilaarboryzację dendrytyczną (da) neuronów, dostarczając tym samym nowych informacji na temat molekularnych mechanizmów leżących u podstaw morfogenezy dendrytów.

Protokół

Uwagi ogólne dotyczące sortowania magnetycznego neuronów obwodowych Drosophila (całkowity czas wykonania protokołu: 2,5-3 godziny)

Należy przez cały czas przestrzegać standardowych procedur laboratoryjnych mających na celu utrzymanie czystego środowiska wolnego od RNaz, aby zapobiec degradacji RNA.

Kiedy kutykula larwy Drosophila zostaje poddana sekcji i umieszczona w buforze do dysocjacji komórek, neurony obwodowe są jednymi z ostatnich komórek odrywających się od kutykuli. Wykorzystaliśmy tę właściwość i opracowaliśmy niniejszy protokół, aby usunąć większość nieswoistych komórek z kutykuli, takich jak tkanka mięśniowa i tłuszczowa, przed izolacją neuronów da.

Dzięki praktyce cały protokół można pomyślnie zrealizować w ciągu około 2,5 godziny. Przygotowanie kulek pokrytych przeciwciałami musi zostać zakończone przed rozpoczęciem eksperymentu.

1. Przygotowanie kulek magnetycznych do wiązania komórek:

Ten krok należy wykonać przed rozpoczęciem eksperymentu. Przygotowane koraliki można przechowywać w temperaturze 4°C do momentu ich użycia.

1. Przemyć 100 μl kulek Dynabeads M-280 pokrytych streptawidyną trzykrotnie w PBS, resuspendując je w 500 μl świeżego PBS i każdorazowo pelletując w silnym polu magnetycznym.
2. Na koniec resuspendować kulki bezpośrednio w 100 μl nierozcieńczonego biotynilowanego przeciwciała szczurzego anty-mysiego CD8a (stężenie przeciwciała wynosi 100 μg/ml).
3. Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę na lodzie, sporadycznie delikatnie mieszając w wortexie, aby zapobiec sedymentacji. [1 μl Dynabeads M-280 może związać 0,05-0,10 μg biotynilowanego przeciwciała].
4. Przemyć mieszaninę kulek z przeciwciałami trzykrotnie zgodnie z opisem w kroku 1.1, aby usunąć nadmiar przeciwciał. Kulki magnetyczne są teraz pokryte przeciwciałami i gotowe do użycia. Przechowywać mieszaninę kulek z przeciwciałami w 100 μl 1X PBS w temperaturze 4°C do momentu użycia.

2. Wybór i płukanie larw: (10-15 minut)

1. Odbierz 30-50 larw trzeciego stadium o zbliżonym wieku i umieść je w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 ml zawierającej 1-1,2 ml 1X soli fizjologicznej fosforanowej (PBS). (3-5 minut)
2. Zamknij probówkę i wymieszaj ją na wortexie z maksymalną prędkością trzy razy przez 1 sekundę za każdym razem.
3. Za pomocą wypalanej pipety Pasteura całkowicie odlej nadsącz. Powtórz etapy płukania (2.1) i mieszania na wortexie (2.2) 3-4 razy, aż nadsącz będzie wyraźnie wolny od cząstek pokarmu i zanieczyszczeń.
4. Krótko powtórz płukanie przy użyciu 1 ml 70% etanolu, a następnie odlej nadsącz.
5. Przepłucz larwy dwukrotnie 1 ml ddH2O i odlej nadsącz.
6. Krótko powtórz płukanie jeszcze raz przy użyciu 1 ml RNase-AWAY, a następnie odlej nadsącz.
7. Przepłucz larwy trzy razy w 1 ml ddH2O, aby zapewnić całkowite usunięcie RNase-AWAY.

3. Disekcja: (10-12 minut)

1. Umieść 10-12 larw w centrum 35-milimetrowej płytki Petri powlekanej Sylgardem. Rozmieść je w niewielkich odstępach od siebie. [Krok krytyczny: Odrzuć wszystkie larwy, które wydają się nie być na odpowiednim etapie rozwoju]
2. U wszystkich larw przetnij przedni koniec ciała za pomocą cienkich nożyczek do sekcji.
3. Używając tępych pincet Dumont nr 5, wywiń larwy na drugą stronę. Wsuń jedną pincetę do wnętrza kutykuli larwy aż do końca tylnego odcinka ciała. Zaciśnij końcówki pincety, aby uchwycić tylny koniec kutykuli (Rysunek 1a) (można spróbować docisnąć kutykulę do powierzchni Sylgardu, aby ułatwić ten proces). Drugą pincetą wypchnij kutykulę larwy na zewnątrz. [Krok krytyczny: Przed przystąpieniem do eksperymentu z izolacją komórek warto kilkakrotnie przećwiczyć tę metodę. Należy dążyć do całkowitego wywinięcia larw, aby upewnić się, że wszystkie miękkie tkanki są wystawione na działanie roztworu w celu łatwej dysocjacji.]
4. Po zsekcjonowaniu 3-4 larw natychmiast przenieś je do świeżego, lodowatego PBS (umieść probówkę na lodzie) w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,6 ml.
5. Powtarzaj kroki 3.1 do 3.4, aż do momentu zebrania wszystkich wymaganych larw (w tym protokole od 30 do 40 larw). [Krok krytyczny: Należy przewidzieć stratę na poziomie 10-20% podczas sekcji i dysocjacji i odpowiednio zaplanować liczbę próbek.]

4. Usuwanie słabo przylegających komórek nieswoistych: (2-3 minuty)

[Ten krok ułatwia usunięcie słabo przylegających tkanek nieswoistych, takich jak ciała tłuszczowe i OUN.]

1. Wziąć probówkę do wirówki o pojemności 1,6 ml zawierającą odwrócone kutykule larwalne i zastąpić supernatant około 700-800 μl świeżego, lodowatego PBS.
2. Wymieszać zawartość probówki w wstrząsającym wirówce (vortex) w trybie pulsacyjnym 5 razy (3 sekundy na puls) przy pełnej prędkości.
3. Odlać supernatant i zastąpić go około 700-800 μl świeżego, lodowatego PBS.
4. Powtórzyć kroki 4.2 i 4.3 trzy razy.
5. Resuspender kutykule larwalne w 400 μl świeżego, lodowatego PBS.

5. Dysocjacja tkanki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek: (18-20 minut)

[Krok krytyczny: Nadmierna dysocjacja może spowodować utratę markerów powierzchniowych komórek, co prowadzi do niskiej wydajności i słabej żywotności komórek. Tkankę larwalną można dysocjować za pomocą dysocjacji mechanicznej (sonikacja, dounce), enzymatycznej (trypsyna, kolagenaza itp.) lub kombinacji obu tych metod. Ponieważ tkanki larwalne są trudne do dysocjacji, ustaliliśmy, że połączenie dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej daje najlepsze rezultaty.]

1. Dodaj 1,5 μl 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch units/vial) do kutykuli larwalnej zawieszonej w 400 μl PBS.
2. Wymieszaj roztwór w vortexerze 2-3 razy po 1 sekundzie na maksymalnym ustawieniu (powinno to usunąć słabo przylegające komórki z kutykuli do roztworu).
3. Inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej (22-25°C) przez 5 minut. [Kluczowy krok: Czas inkubacji ma ogromny wpływ na końcową wydajność sortowania komórek. Zalecany czas inkubacji powinien być wystarczający do rozluźnienia tkanki. Nie przekraczaj 15 minut.]
4. Wymieszaj probówkę w vortexerze pulsacyjnie 20-30 razy na maksymalnych ustawieniach, przez 2 sekundy na każdy puls przy pełnej prędkości. Powinno to uwolnić mięśnie i inne tkanki do roztworu. Na każdym etapie badaj małą próbkę roztworu pod fluorescencyjnym stereomikroskopem. (Z doświadczeniem powinno być możliwe określenie stopnia dysocjacji poprzez bezpośrednią obserwację probówki do mikrocentryfugi pod stereomikroskopem z funkcją fluorescencji).
5. Przemyj kutykule larwalne 2-3 razy świeżym, schłodzonym do temperatury lodu PBS, a następnie zawieś je w 500 μl świeżego, schłodzonego do temperatury lodu PBS zawierającego 1% BSA.
6. Aby zapobiec przywieraniu kutykuli larwalnej do szklanej powierzchni 2 ml homogenizatora tkanek Kontes i szerokiego tłuczka, pokryj uprzednio homogenizator i tłuczek roztworem 1% BSA w PBS, a po krótkim płukaniu wylej roztwór BSA. Następnie, używając wypalanej pipety Pasteura, przenieś kutykule z kroku 5.5 do pokrytego BSA homogenizatora. [Kluczowy krok: Wychłodź homogenizator i tłuczek, umieszczając je na lodzie przez kilka minut, aby zapobiec uszkodzeniu lub lizie komórek].
7. Homogenizuj tkankę wolnymi i jednostajnymi ruchami, unikając pienienia (około 20-30 ruchów). [Kluczowy krok: Homogenizuj powoli i jednostajnie, w przeciwnym razie komórki mogą ulec lizie.]
8. Aby ocenić stopień dysocjacji komórek, przetrzyj zewnętrzną ściankę homogenizatora czystą chusteczką Kimwipe i obejrzyj ją pod fluorescencyjnym stereomikroskopem. Neurony powinny oddzielić się od kutykuli i być widoczne w roztworze. Jeśli jest to trudne, można alternatywnie pobrać pipetą małą próbkę roztworu i zbadać ją pod fluorescencyjnym stereomikroskopem. Dobrym wskaźnikiem dysocjacji komórek jest brak neuronów w kutykuli larwalnej. Jeśli jednak nadal obserwuje się neurony przytwierdzone do kutykuli lub niedysocjowane całkowicie komórki, kontynuuj homogenizację do momentu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
9. Wykonaj triturację roztworu 5 razy wypalaną pipetą Pasteura, której końcówka została zwężona do około 50% standardnej średnicy, a następnie 10 razy pipetą Pasteura zwężoną do około 25% standardnej średnicy. [Kluczowy krok: Zbyt gwałtowna trituracja może uszkodzić komórki. Monitoruj stan komórek pomiędzy etapami i odpowiednio dostosuj procedurę].
10. Przefiltruj roztwór przez filtr komórkowy 30 μm i zbierz filtrat komórkowy do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 ml. Otrzymany roztwór powinien stanowić zawiesinę pojedynczych komórek i jest teraz gotowy do magnetycznego sortowania komórek.

6. Sortowanie komórek za pomocą kulek magnetycznych: (45 – 75 minut, w zależności od czasu inkubacji z przeciwciałem)

1. Dodaj 15 μl kulek magnetycznych powlekanych przeciwciałami do 500 μl zawiesiny komórkowej (krok 5.10). Pozostałe kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami można przechowywać do czasu kolejnych izolacji komórek.
2. Inkubuj komórki z kulkami magnetycznymi powlekanymi przeciwciałami przez 30-60 minut na lodzie, sporadycznie mieszając ręcznie. [Krok krytyczny: Inkubacja w wyższej temperaturze lub przez dłuższy czas może prowadzić do niespecyficznego wiązania przeciwciał.]
3. Umieść probówkę do mikrowirówki w silnym polu magnetycznym na 2 minuty. Wszystkie komórki wyselekcjonowane pozytywnie wraz z niewiązanymi kulkami oddzielą się przy ściance probówki.
4. Powoli odpipetuj nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
5. Przemyj komórki 3-4 razy świeżym, schłodzonym do temperatury lodowej PBS, aby usunąć pozostałe niespecyficzne komórki.
6. Resuspenduj komórki w 30 μl świeżego, schłodzonego do temperatury lodowej PBS.
7. Aby oszacować czystość i wydajność uzyskania komórek, nanieś 5 μl zawiesiny komórkowej na wypolerowaną powierzchnię komory licznikowej (hemocytometru) i policz wszystkie widoczne fluorescencyjne komórki pod fluorescencyjnym stereomikroskopem. Sprawdź również liczbę komórek niefluorescencyjnych oraz wszelkie oznaki zanieczyszczeń. Zazwyczaj próbka będzie silnie wzbogacona w komórki fluorescencyjne.

7. Izolacja RNA z komórek sortowanych za pomocą kulek magnetycznych: (60 – 75 minut)

1. Po policzeniu komórek należy je sgranulować w polu magnetycznym, odrzucić nadsącz i dodać 20 μl buforu do ekstrakcji z zestawu PicoPure™ RNA Isolation Kit (Molecular Devices). W zależności od liczby komórek może być konieczne dodanie większej objętości buforu do ekstrakcji.
2. Przemieszać zawartość probówki w wstrząsarze Vortex z maksymalną prędkością, aby umożliwić wymieszanie granulatu komórek z buforem do ekstrakcji.
3. Inkubować probówkę w temperaturze 42°C przez 30 minut.
4. Aby zapewnić usunięcie kulek magnetycznych przed oczyszczaniem RNA na kolumnie (patrz krok 7.5), probówkę należy krótko odwirować przy 2,000 (x) g przez 2 minuty w celu sgranulowania kulek magnetycznych. Następnie probówkę umieszcza się w silnym polu magnetycznym w celu zatrzymania granulatu, a nadsącz przenosi do nowej probówki do mikrocentryfugi.
5. Wyekstrahować i oczyścić RNA na kolumnie zgodnie z instrukcją producenta zestawu PicoPure RNA extraction kit. Opracowanie DNaza jest opcjonalne i może zostać przeprowadzone na kolumnie podczas oczyszczania RNA, zależnie od wymagań analizy. Na koniec eluować związane całkowite RNA w małej objętości (11-30 μl) buforu do elucji i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia. W razie potrzeby można pobraćアリkot 1 μl do oceny jakości całkowitego RNA za pomocą urządzenia Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.).

Reprezentatywne wyniki:

Do izolacji neuronów da Drosophila wykorzystano sortowanie za pomocą kulek magnetycznych (Rycina 1). RNA oczyszczone z tych izolowanych neuronów da (Rycina 2a) charakteryzowało się doskonałą jakością, co potwierdziła obecność ostrych pików rybosomalnego RNA 5.8S, 18S i 28S podczas analizy na Bioanalyzerze Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc.) (Rycina 2b). Rozpoczynając od 30-40 larw trzeciego stadium rozwojowego, byliśmy w stanie wyizolować średnio 300-500 neuronów da klasy IV przy użyciu drivera ppk-GAL4 oraz 1500-2000 neuronów da (klasy I, II, III i IV) przy użyciu pan-da neuron-specyficznego drivera GAL4^21-7. Aby ocenić specyficzne dla neuronów wzbogacenie wyizolowanych komórek, przeprowadziliśmy ilościową reakcję PCR z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) z użyciem dwóch markerów specyficznych dla genów neuronalnych (elav i futsch). Analizy te wykazały znaczący wzrost krotności wzbogacenia obu genów markerowych, co wskazuje na wysoką specyficzność wzbogacenia neuronów da w porównaniu z frakcją przepływową otrzymaną przy zastosowaniu naszego protokołu (Rycina 3). Ostatecznie wyizolowane RNA z neuronów pan-da oraz neuronów da klasy IV wykorzystano do profilowania ekspresji transkrypcyjnej na mikrotablicach oligo całego genomu Drosophila melanogaster firmy Agilent (4 x 44K) (Rycina 4). Analizy te zidentyfikowały liczne wcześniej opisane regulatory morfogenezy dendrytów neuronów da, a także szeroki wachlarz wcześniej nieopisanych cząsteczek i domniemanych szlaków transdukcji sygnału, które potencjalnie pełnią istotne role funkcjonalne w rozwoju neuronów da. Obecnie prowadzone są badania mające na celu ocenę potencjalnej roli tych nieopisanych wcześniej cząsteczek w pośredniczeniu rozwoju neuronów da, a w szczególności morfogenezy dendrytów.

Rycina 1: Schemat sortowania magnetycznego neuronów da Drosophila. (a) Larwy trzeciego stadium o tym samym wieku, niosące specyficzny dla neuronów da transgen reporterowy GAL4,UAS-mCD8-GFP, są preparowane poprzez wywinięcie kutykuli larwalnej na drugą stronę w celu odsłonięcia PNS na bufor dysocjujący i przechowywane w lodowatym PBS. (b) Dysocjacja enzymatyczna jest przeprowadzana poprzez dodanie Liberase Blendzyme 3 do roztworu zawierającego kutykulę larwalną. (c) Tkanki larwalne są dalej dysocjowane poprzez kombinację wortexowania, tryturacji i douncingu w celu usunięcia niespecyficznie znakowanych tkanek, takich jak ciała tłuszczowe, jelito i CNS. (d,e) Komórki są następnie filtrowane za pomocą filtra komórkowego 30 μm. Roztwór zawiera zawiesinę pojedynczych komórek różnych typów, w tym nabłonka, mięśni i neuronów. (f) Do zawiesiny komórkowej dodaje się Dynabeads M-280 pokryte przeciwciałem anty-mysim CD8a i inkubuje na lodzie przez 30-60 minut. (g) Kuleczki magnetyczne wiążą się z neuronami da, które wykazują ekspresję białka fuzyjnego GFP znakowanego mysim CD8. (h,i) Komórki pokryte kuleczkami magnetycznymi są oddzielane poprzez umieszczenie roztworu w silnym polu magnetycznym. Nadpłyn jest odrzucany, a komórki są przemywane trzy razy w celu usunięcia wszelkich pozostałych niespecyficznych komórek, co skutkuje (j) wysoko oczyszczonymi populacjami neuronów da. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję ryciny 1.

Rysunek 2: (a) Reprezentatywny obraz pozytywnie wyselekcjonowanych, fluorescencyjnych GFP neuronów da klasy IV wyizolowanych poprzez dysocjację komórek i sortowanie za pomocą kulek magnetycznych. Ustalono, że otrzymana populacja neuronów jest silnie wzbogacona w neurony da klasy IV, z niewielką ilością lub brakiem zanieczyszczeń innymi komórkami. (b) Elektroferogram z analizatora Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) całkowitego RNA wyizolowanego z sortowanych kuleczkami magnetycznymi neuronów da, wykazujący doskonałą jakość całkowitego RNA, co potwierdza obecność rRNA 5.8S, 18S i 28S. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku 2.

Rycina 3: Analizę qRT–PCR ekspresji genów markerów neuronalnych w izolowanych neuronach da (GAL421-7,UAS-mCD8-GFP) oraz w frakcji przepływowej wykonano w trzech powtórzeniach. Poziomy ekspresji dwóch specyficznych markerów neuronalnych (elav i futsch) oceniono za pomocą qRT–PCR. Wartości uzyskane z tych analiz znormalizowano względem kontroli endogennej (rp49), a poziomy względne do tych zaobserwowanych w frakcji przepływowej obliczono metodą ΔΔCτ⁶. Zarówno elav, jak i futsch były znacznie wzbogacone w populacji izolowanych neuronów da w porównaniu z frakcją przepływową.

Rycina 4: Reprezentatywny plik obrazu z mikromacierzy z użyciem znacznika Cy3, specyficzny dla neuronów da klasy IV. Przedstawiono tutaj pełnogenomową mikromacierz oligo *Drosophila melanogaster* marki Agilent (4 x 44K) zhybrydyzowaną z całkowitym RNA znakowanym Cy3, wyizolowanym z neuronów da klasy IV oczyszczonych metodą sortowania za pomocą kulek magnetycznych. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 4.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół został zoptymalizowany pod kątem izolacji i oczyszczania neuronów obwodowych, które ściśle przylegają do wewnętrznej powierzchni kutykuli larwy Drosophila w trzecim stadium rozwojowym, z wykorzystaniem strategii sortowania komórek za pomocą kulek magnetycznych. Choć w tym protokole wykorzystaliśmy go do specyficznej izolacji neuronów da Drosophila, można go zaadaptować do izolacji innych typów komórek przylegających do kutykuli w stadiach larwalnych lub poczwarkowych (np. nabłonka, mięśni, in...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10X roztwór soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS)	MP Biomedicals	PBS10X02	Rozcieńczone do 1X roztworu roboczego
10X Liberase Blendzyme 3	Grupa Roche	11814176001	Rozcieńczone do 1X roztworu roboczego (28 Wüjednostek/fiolkę)
RNase-AWAY	Sigma-Aldrich	83931
Biotynilowane przeciwciało szczurze anty-mysie CD8a	Invitrogen	MCD0815	100 μstężenie roztworu zapasu w g/ml
BSA (albumina surowicy bydlęcej), frakcja V	GIBCO, by Life Technologies	11018-017	Przygotować 1% roztwór BSA w PBS
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11205D	1 μmoże wiązać 0,05–0,10 μg biotynilowanego przeciwciała
Zestaw do izolacji RNA PicoPure	Molecular Devices	KIT0204	Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta’instrukcje
Sprzęt (10) Neodymowe magnesy blokowe (K & J Magnetics, Inc., kat. nr B444B), alternatywnie DynaMag™Można zastosować -2 (Invitrogen, kat. nr 123-21D). szkło do rozcierania tkanek Kontes, pojemność robocza 2 ml, z tłuczkiem o dużym prześwicie (Kat. nr 885300-0002) Filtry do komórek, np. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, kat. nr 130-041-407) szalki Petri o średnicy 35 mm powlekane Sylgardem (Dow Corning Corporation, nr kat. 3097358-1004) Narzędzia do sekcji: dwie pary pęset Dumont nr 5 (Fine Science Tools, kat. nr 11251-20) Mikro-nożyczki do sekcji wiosenne Vannasa (Fine Science Tools, nr kat. 15000-08) Pipety (P-1000, P-100, P-10) z jednorazowymi końcówkami Standardowy hemocytometr do liczenia komórek i oceny czystości preparatu Pipety Pasteura z końcówkami polerowanymi ogniowo o standardowej średnicy, zwężone do ok. 50% średnicy standardowej oraz zwężone do ok. 25% średnicy standardowej do tryturacji Mikrowirówka stołowa (1-16 000 (x) g) Wymieszać w wstrząsarce (vortex) Fluorescencyjny stereomikroskop (w niniejszym protokole zastosowano model Leica MZ16FA)