Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Podsumowanie

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Streszczenie

Komórkę macierzystą definiuje się jako komórkę zdolną zarówno do samoodnawiania, jak i do generowania wielu zróżnicowanych potomków. Embrionalne komórki macierzyste (ESC) pochodzą z blastocysty wczesnego zarodka i charakteryzują się pluripotencją w zakresie zdolności do różnicowania. Ich ogromny potencjał różnicowania sprawił, że stały się one przedmiotem licznych badań skoncentrowanych na opracowaniu metod skłaniania ich do generowania klinicznie użytecznych typów komórek. Niedawno udało się pomyślnie wydzielić krwiotwórcze komórki macierzyste (HSC) z mysich ESC, co zostało zaprezentowane w niniejszym protokole wideo. HSC, będące prawdopodobnie najszerzej wykorzystywaną klinicznie populacją komórek, są stosowane w leczeniu wielu nowotworów i schorzeń układu krwiotwórczego. Jednakże wielu pacjentów, którzy mogliby odnieść korzyść z terapii HSC, nie ma dostępu do odpowiednich dawców. ESC mogłyby stanowić alternatywne źródło HSC dla takich pacjentów. Poniższy protokół ustanawia podstawę, dzięki której można badać ESC-HSC i wspierać wysiłki zmierzające do izolacji HSC z ludzkich ESC. W tym protokole ESC są różnicowane w formie ciał embrionalnych (EB) przez 6 dni w dostępnej komercyjnie surowicy, wstępnie przeselekcjonowanej pod kątem optymalnego różnicowania krwiotwórczego. Następnie EB są dysocjowane i zarażane retrowirusowym genem HoxB4. Zainfekowane komórki pochodzące z EB są wysiewane na podłoże z komórkami stromy OP9 (linia komórek stromy szpiku kostnego pochodząca z czaszki myszy M-CSF-/-) i współhodowane przez dziesięć dni w obecności cytokin promujących hematopoezę. Podczas tej współhodowli zainfekowane komórki ulegają znacznej ekspansji, co prowadzi do wytworzenia heterogenicznej puli setek milionów komórek. Komórki te mogą być następnie wykorzystane do ratowania i rekonstytucji układu krwiotwórczego u myszy poddanych dawce letalnej napromieniowania.

Protokół

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych

1. Zebrać niemal zrastne komórki macierzyste zarodkowe (ESC) z kolby poprzez traktowanie trypsyną do ESC.
2. Resuspendować komórki w 5 mL pożywki różnicującej i przenieść do naczynia T25 bez powłoki żelatynowej. Inkubować w temperaturze 37°C przez 45 minut. Odzyskać nadosad i zebrać komórki poprzez wirowanie.
   
   Uwaga: Fibroblasty zarodkowe myszy (MEF) z kultur ESC łatwo przywierają do naczynia T25 bez powłoki żelatynowej, dzięki czemu zostają usunięte z kultury podczas tego etapu wysiewania. Jeśli ESC nie są hodowane na MEF, można pominąć ten etap wstępnego wysiewania.
   
   
3. Resuspendować ESC pozbawione MEF w pożywce różnicującej w stężeniu 333 333 komórek/50 mL. Stężenie to pozwala uzyskać 100 ESC/15 µL.
4. Używając pipety wielokanałowej, wysiać ESC w ilości 100 komórek/15 µL kropli na szalkach Petriego o powierzchni 15 cm². Przy użyciu pipety 8-kanałowej powinno być możliwe rozmieszczenie około 18-22 rzędów kropli na szalkę (około 5 mL na szalkę).
   
   Uwaga: Dla tego protokołu 2-5 szalek o powierzchni 15 cm² z kroplami będzie w zupełności wystarczające i powinno pozwolić na uzyskanie 2-5 x 10⁶ komórek pochodzących z ciał embroidalnych (EB) w szóstym dniu.
   
   
5. Delikatnie odwrócić szalki, aby odwrócić krople. Inkubować w 37°C i 5% CO₂ przez 48 godzin.
6. Zebrać krople poprzez delikatne zamieszanie szalek i przenieść do stożkowej probówki 15 mL. Przepłukać szalki 4-6 mL PBS i dodać do tej samej probówki 15 mL.
   
   Uwaga: Można połączyć zawartość do pięciu szalek z kroplami wiszącymi. EB będą rosnąć w miarę dalszego różnicowania i jeśli będą zbyt skoncentrowane, mogą tworzyć duże skupiska.
   
   
7. Pozostawić połączone EB do osadzenia pod wpływem grawitacji (około 10 minut). Odessać nadosad, nie niepokojąc EB. Delikatnie resuspendować w 10 mL pożywki różnicującej i przenieść na nieadhezyjną szalkę Petriego o średnicy 10 cm.
8. Umieścić szalkę Petriego na wytrząsarce w tempie 50 rpm i inkubować w 37°C i 5% CO₂.
9. Po 24 godzinach (czwarty dzień różnicowania) zamieszać szalki, aby skoncentrować EB w centrum szalki Petriego. Ostrożnie wymienić 50% pożywki (5 mL) na 5 mL świeżej pożywki różnicującej. Wrócić szalkę do inkubatora na kolejne dwa dni.

Dysocjacja ciałek zarodkowych (EB) i infekcja wektorem MSCV-HoxB4-IRES-GFP

1. Szóstego dnia różnicowania przenieść ciała emboidalne (EBs) do probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Pozostawić do osadzenia grawitacyjnego.
2. Odssać medium i resuspender w 10 mL PBS. Pozostawić EBs do ponownego osadzenia grawitacyjnego. Odssać PBS.
3. Dodać 250 µL mieszaniny enzymów dysocjujących i 1 mL PBS. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 20 minut, sporadycznie obracając probówkę w celu wymieszania enzymów i EBs.
4. Dodać 8 mL buforu do dysocjacji wolnego od enzymów.
5. Triturować mieszaninę za pomocą pipety 5 mL, aż EBs zostaną całkowicie zdysocjowane (około 10 razy; nadmierne pipetowanie zwiększy śmiertelność w preparacie komórek pochodzących z EBs).
   1. W miarę dysocjacji EBs mieszanina stanie się mętna od komórek.
   2. Przystawienie końcówki pipety do dna probówki stożkowej podczas triturowania wytworzy siłę ścinającą, która znacznie ułatwi dysocjację.
6. Zebrać komórki poprzez wirowanie.
7. Resuspender komórki pochodzące z EBs w 5 mL 10% IMDM i policzyć je metodą wykluczania błękitu trypanu.
   
   Uwaga: Między czwartym a szóstym dniem różnicowania w EBs tworzą się jamistości, co prowadzi do znacznej apoptozy i śmierci komórek. W związku z tym w szóstym dniu nawet do 30% komórek pochodzących z EBs może barwić się błękitem trypanu.
   
   
8. Resuspender komórki pochodzące z EBs w zagęszczeniu 100 000 komórek/2 mL 10% IMDM + supernatant wirusowy, tak aby uzyskać MOI na poziomie 5-10. Dodać siarczan protaminy do stężenia końcowego 8 mg/mL.
   
   Uwaga: Przygotować odpowiednią ilość mieszaniny EBs/supernatantu wirusowego, aby wypełnić cztery płytki 6-dołkowe (zakładając 2 mL/dołek).
   
   
9. Wyasiać 2 mL mieszaniny EBs/supernatantu wirusowego na każdy dołek czterech płytek 6-dołkowych uprzednio wysianych z komórkami stromy OP9 (patrz poniżej).
10. Wirować płytki przy 2500 rpm w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Przenieść płytki do inkubatora w 37°C, 5% CO₂.
11. Po 4-6 godzinach zebrać supernatant z płytek i odzyskać ewentualne komórki pozostające w zawiesinie poprzez wirowanie.
12. Resuspender osad (może być niewielki) w 48 mL 10% IMDM + cytokiny. Rozlać 2 mL/dołek resuspensji do pierwotnych czterech płytek 6-dołkowych, w których przeprowadzono infekcję i zebrano supernatant.
    
    Uwaga: 10% IMDM + cytokiny należy zawsze przygotowywać świeżo przed użyciem.
    
    
13. Inkubować płytki w 37°C, 5% CO₂ przez siedem dni. Kolonie powinny być widoczne do czwartego dnia po infekcji, a do siódmego dnia powinny być duże i dobrze uformowane. Intensywna ekspansja powinna dać 40-60 kolonii/dołek w siódmym dniu.
14. Siódmego dnia po infekcji zebrać i połączyć wszystkie komórki (w tym stromę OP9) ze wszystkich dołków poprzez traktowanie trypsyną.
    
    Uwaga: NIE wylewać supernatantu ani płukanek z PBS stosowanych podczas traktowania trypsyną. Na tym etapie hodowli niektóre kolonie mogą być tylko słabo przylegające, a wiele komórek może unosić się w zawiesinie. Należy zebrać i połączyć wszystkie płukanki oraz supernatant, aby upewnić się, że żadne potencjalnie cenne komórki nie zostały utracone.
    
    
15. Resuspender komórki w 8 mL świeżego 10% IMDM + cytokiny. Rozdzielić 2 mL/kolbę do czterech kolb T75. Do każdej kolby dodać dodatkowe 13 mL 10% IMDM + cytokiny. Inkubować w 37°C, 5% CO₂ przez trzy dni (łącznie dziesięć dni po infekcji).

 

Kultywowanie i wysiewanie stromy OP9

1. Utrzymuj podłoże stromalne OP9 zgodnie ze standardowymi protokołami w 20% a-MEM. Komórki OP9 zmieniają swoje właściwości po osiągnięciu pełnej konfluencji. Zawsze pasażuj komórki przy 80% konfluencji, stosując rozcieńczenie nie większe niż 1:3.
2. Na 24 godziny przed infekcją komórek pochodzących z EB szóstego dnia wektorem MSCV-HoxB4-IRES-GFP, wysiej 25 000 komórek OP9/dołek do czterech płytek 6-dołkowych w 20% a-MEM.

Pozyskiwanie, frakcjonowanie i transplantacja

1. Zebrać komórki namnażane na stromie OP9 przez dziesięć dni, stosując trypsynizację. Policzyć komórki.
   
   Uwaga: NIE należy wylewać nadsączu ani płukanek z PBS stosowanych podczas traktowania trypsyną. Na tym etapie hodowli niektóre kolonie mogą być słabo przylegające, a w zawiesinie może znajdować się wiele komórek. Należy zebrać i połączyć wszystkie płukanki oraz nadsącz, aby upewnić się, że żadne potencjalnie cenne komórki nie zostały utracone.
   
   Uwaga: Prawidłowa ekspansja powinna dać od 40-50 x 10⁶ komórek z jednej oryginalnej płytki 6-dołkowej poddanej infekcji, co daje łącznie 160-200 x 10⁶ komórek.
   
   
2. Na tym etapie protokołu komórki można frakcjonować za pomocą selekcji kulkami magnetycznymi lub FACS zgodnie ze standardowymi technikami.
3. W celu transplantacji podać komórki drogą zakroczną (retro-orbitalną) lub do żyły ogonowej biorcom z niedoborem Rag-2/gc (o masie od 15-22 gramów), którzy zostali poddani podzielonej dawce naświetlania 9.25 gy w odstępach 2.5 h.
   
   Uwaga: KLUCZOWE jest, aby masa zwierząt w momencie naświetlania mieściła się w przedziale 15-22 gramów. Jeśli zwierzęta ważą więcej niż 22 gramy, dawka 9.25 gy nie będzie wystarczająca, aby zapewnić odpowiednią ablację, a komórki mogą nie doprowadzić do uratowania przed letalnym naświetlaniem i/lub nie zasiedlić przedziału krwiotwórczego. W przypadku transplantacji do większych zwierząt odpowiednią dawkę naświetlania należy wyznaczyć eksperymentalnie.
   
   
4. Aby zagwarantować przeżycie po letalnym naświetlaniu, wymagana jest minimalna dawka 2-5 x 10⁶ komórek na zwierzę. W przypadku frakcjonowania komórek, należy wstrzyknąć równowartość 2-5 x 10⁶ komórek (np. jeśli interesująca populacja stanowi 10% niefrakcjonowanej puli komórek, należy wstrzyknąć 2-5 x 10⁵ komórek na zwierzę).
   
   Uwaga: W przypadku wstrzykiwania >2 x 10⁶ komórek, ZAWSZE należy stosować iniekcję do żyły ogonowej, aby uniknąć tworzenia się teratoma w oczodole, co może wystąpić przy podaniu dużej liczby komórek drogą zakroczną.
   
   
5. Biorców z niedoborem Rag-2^-/-/gc^-/- utrzymywać w autoklawowanych klatkach. W zależności od „czystości” zwierzęciaca, zwierzęta po transplantacji mogą wymagać podawania zakwaszonej wody lub trimetoprymu z sulfasoksazolem (Septra) przez 5 tygodni po letalnym naświetlaniu.
   
6. W 3. tygodniu po transplantacji w krwi obwodowej należy spodziewać się >90% leukocytów pochodzących z komórek ES z ekspresją GFP (GFP+). Zasiedlenie powinno być wieloliniowe, choć wiadomo, że limfocyty wyciszają retrowirusowy HoxB4-IRES-GFP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy C57Bl/6 z niedoborem Rag-2/gamma-c	Zwierzę	Taconic Farm
Wstrząsarka do płytek	Narzędzie	VWR international	33998-360	Wstrząsarka orbitalna firmy Ikaworks
Pipeta wielokanałowa	Narzędzie	VWR international	15000-174	ePet firmy BioHit
Trypsyna ES	Odczynnik	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsyna w PBS
Standardowa trypsyna	Odczynnik	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsyna-EDTA
PBS	Bufor	Invitrogen	20012-027
Bufor do dysocjacji bez enzymów	Bufor	Invitrogen	13151-014
Mieszanina enzymów do dysocjacji	Bufor	Invitrogen	17104-019	500 mg Kolagenazy IV
Hialuronidaza	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H2126	zamrozić w aliquotach 500 μL i unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
DNAza	Odczynnik	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Siarczan protaminy	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
Pożywka do różnicowania EB	pożywka			Proszę zapoznać się z recepturą w załączonym pliku Protocol.doc
10% IMDM	pożywka			Proszę zapoznać się z recepturą w załączonym pliku Protocol.doc
10% IMDM+cytokiny	pożywka			Proszę zapoznać się z recepturą w załączonym pliku Protocol.doc
20% anti-MEM				Proszę zapoznać się z recepturą w załączonym pliku Protocol.doc