Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Podsumowanie

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Streszczenie

Sekwencjonowanie RNA współwytrącanych immunochemicznie (co-IP) z białkami wiążącymi RNA zwiększyło naszą wiedzę na temat splicingu, wykazując, że miejsce wiązania często wpływa na funkcję czynnika splicingu. Jednakże, jak w przypadku każdej strategii próbkowania, prawdopodobieństwo zidentyfikowania RNA związanego z czynnikiem splicingu jest proporcjonalne do jego obfitości komórkowej. Opracowaliśmy nowatorskie podejście in vitro do badania specyficzności wiązania w przypadku przejściowego pre-mRNA. Podejście to wykorzystuje specjalnie zaprojektowaną pulę oligonukleotydów, które pokrywają w sposób kafelkowy introny, eksony, miejsca złączeń splicingu lub inne fragmenty pre-mRNA. Pula ta jest poddawana określonej selekcji molekularnej. W niniejszej pracy demonstrujemy tę metodę poprzez rozdzielenie oligonukleotydów na frakcję związaną i niezwiązaną, a następnie wykorzystujemy strategię matrycy dwukolorowej do rejestracji wzbogacenia każdego oligonukleotydu we frakcji związanej. Dane z matrycy pozwalają na wygenerowanie map wysokiej rozdzielczości z możliwością identyfikacji sekwencyjnych i strukturalnych determinant wiązania rybonukleoprotein (RNP) na pre-mRNA. Wyjątkową zaletą tej metody jest możliwość uniknięcia błędu próbkowania w kierunku mRNA, który występuje w aktualnych technikach IP i SELEX, ponieważ pula jest specjalnie projektowana i syntetyzowana na podstawie sekwencji pre-mRNA. Kolejną zaletą jest elastyczność puli oligonukleotydów, ponieważ badacz sam wybiera regiony do analizy i pokrycia, dostosowując pulę do indywidualnych potrzeb. Wykorzystując tę technikę, można na dużą skalę badać wpływ polimorfizmów lub mutacji na wiązanie lub klonować bibliotekę do funkcjonalnego reporteru splicingu i identyfikować oligonukleotydy wzbogacone we frakcji włączonej. Ten nowatorski schemat mapowania wysokiej rozdzielczości in vitro stanowi unikalny sposób badania oddziaływań RNP z przejściowymi cząsteczkami pre-mRNA, których niska obfitość utrudnia badanie przy użyciu obecnych technik in vivo.

Protokół

Projektowanie puli i odzyskiwanie oligonukleotydów

1. Pierwszym krokiem jest zaprojektowanie puli pre-mRNA przeznaczonej do badań. Można to zrobić za pomocą przeglądarki UCSC Genome Browser, pobierając dane dotyczące konkretnych genów, miejsc splice’ingu lub innych obszarów zainteresowania.
2. Po wybraniu interesujących okien, należy przeprowadzić obliczeniowe zakładanie płytek (tiling) zgodnie z następującymi warunkami: długość odczytu powinna wynosić 30 nukleotydów z 10-nukleotydowym zakładem, w związku z czym każdy oligonukleotyd jest przesunięty o 20 nukleotydów względem poprzedniego. Zakład oligonukleotydów powinien zostać zwiększony w pobliżu miejsc splicingowych, aby zapewnić odpowiednie pokrycie; można to osiągnąć poprzez zwiększenie zakładu z 10 do 20 nukleotydów.
3. Każdy 30-nukleotydowy oligonukleotyd należy flankować uniwersalnymi sekwencjami starterów, które zostaną wykorzystane do późniejszej amplifikacji puli. Zamówienia na mozaikowe (tiled) oligonukleotydy należy składać w firmie Agilent, gdzie sekwencje zostaną naniesione na niestandardową matrycę oligonukleotydową.
4. Aby odzyskać oligonukleotydy DNA z powierzchni macierzy, należy rozpocząć od umieszczenia szkiełka przedmiotowego z macierzą w komorze do hybrydyzacji macierzy i delikatnego pipetowania 500 μL z dH₂na preparat
5. Umieść matrycę na szkiełku nakrywkowym, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza, które mogłyby zakłócić proces. Upewnij się, że matryca jest ułożona stroną aktywną do dołu, tak aby strona z oligosami dotykała powierzchni wody. Praktyczną zasadą jest „Agilent dotyka Agilent”, co oznacza, że etykieta Agilent na matrycy powinna być skierowana w stronę etykiety Agilent na szkiełku nakrywkowym.
6. Zamknąć komorę do hybrydyzacji i inkubować z rotacją przez noc w temperaturze 99°C w inkubatorze do hybrydyzacji
7. Następnego dnia ostrożnie wyjmij matrycę z komory i odlej wodę, która zawiera teraz oligonukleotydy uwolnione z powierzchni matrycy. Jest to pula oligonukleotydów.
8. Przenieść pulę do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml i poddać sonikacji przy amplitudzie 50% w impulsach trwających od 3 do 5 sekund.
9. Następnie należy namnożyć pulę za pomocą PCR z małą liczbą cykli, wykorzystując primery uniwersalne z dołączonym na końcu tagiem T7. W pierwszej rundzie denaturację przeprowadza się w 94°C przez 1 minutę, przeprowadzić annealing w temperaturze 55°C przez 20 sekund, a następnie przeprowadzić elongację przez 1 minutę w 72°CW kolejnych cyklach należy zastosować czas 10 sekund, 20 sekund i 10 sekund w odpowiednio przypisanych temperaturach, a następnie przeprowadzić końcowy etap elongacji trwający 5 minut w temperaturze 72°CPonieważ liczba cykli niezbędna do amplifikacji puli zależy od wydajności odzyskiwania oligonukleotydów, może być konieczne przetestowanie różnych liczb cykli. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernej amplifikacji puli, co objawia się rozmytym prążkiem w żelu akrylamidowym. Próbki amplifikowane metodą PCR można przechowywać w 4°C do momentu użycia.
10. Ostatnim etapem przygotowania oligonukleotydów jest transkrypcja RNA przy użyciu zestawu MEGAshortscript™ firmy Ambion. *Poniższy protokół został opracowany na podstawie wytycznych firmy Ambion
    1. Odmrozić 10x bufor reakcyjny T7, cztery roztwory rybonukleotydów oraz wodę w temperaturze pokojowej, utrzymując mieszankę enzymów T7 na lodzie.
    2. Przygotuj mieszaninę reakcyjną w probówce do mikrocentryfugi wolnej od RNaz w temperaturze pokojowej. Składniki buforu reakcyjnego mogą spowodować wytrącenie matrycy DNA, jeśli mieszanie reakcji odbywa się w lodzie.
    3. Pipetować w następującej kolejności: 3 μL woda wolna od nukleaz, 2 μL buforu reakcyjnego 10x, 2 μL z każdego 75 mM roztworu nTP, 5 μL matrycowego DNA (puli oligonukleotydów amplifikowanych metodą PCR) i 2 μL enzymu T7, do uzyskania objętości końcowej wynoszącej 20 μL
    4. Lekko potrząsnij probówką, aby wymieszać odczynnik, a następnie krótko wiruj w mikrocentryfudze, aby zebrać mieszaninę na dnie probówki.
    5. Inkubować reakcję w termocyklerze w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Czas inkubacji będzie zależny od matrycy, w związku z czym może być konieczne przeprowadzenie eksperymentu w serii czasowej w celu wyznaczenia optymalnego czasu inkubacji dla uzyskania maksymalnej wydajności
    6. Po 2 godzinach usunąć matrycowy DNA poprzez dodanie 1 μL Turbo DNase do reakcji i inkubować w 37°C przez dodatkowe 15 minut
    7. Przerwać reakcję i odzyskać RNA poprzez ekstrakcję fenolowo-chloroformową oraz wytrącanie etanolem.
       1. Dla a 20 μL objętość reakcji, dodać 115 μL z dH₂O i 15 μL 3 M octanu sodu do mieszaniny reakcyjnej.
       2. Wymieszać dokładnie, a następnie dodać 75 μL z zakwaszonego fenolu i 75 μL chloroformu. Wymieszać roztwór za pomocą vortexa, a następnie wirować w mikrowirówce przez jedną minutę przy 13 000 obr./min w temperaturze pokojowej. Przenieść warstwę wodną do nowej probówki i powtórzyć ekstrakcję
       3. Przenieść warstwę wodną do nowej probówki i dodać 150 μL chloroformu. Mieszaninę wymieszać na wortexie i odwirować w ten sam sposób co wcześniej. Fazę wodną przenieść do nowej probówki.
    8. Odzyskaj RNA, dodając dwie objętości zimnego, 100% etanolu do warstwy wodnej i dokładnie mieszając. Schłodź mieszaninę przez co najmniej 15 minut w temperaturze -20°C następnie odwiruj przy 4°C przez 15 minut z maksymalną prędkością, aby wytrącić RNA w formie osadu. Ostrożnie usunąć nadsącz i zawiesić osad w 105 μL buforu Tris-EDTA (TE) 0,1x.
11. Trudno jest usunąć wszystkie wolne nukleotydy z reakcji z zestawu T7, dlatego w celu uzyskania najdokładniejszych wyników należy określić ilość RNA za pomocą RiboGreen.
    1. Aby rozpocząć oznaczanie ilościowe, należy najpierst przygotować odpowiednią ilość rozcieńczonego buforu 1x TE, 2,300 μL + 50μL/sample.
    2. Następnie przygotuj odczynnik RiboGreen. Będą potrzebne: 1000 μL + 50 μL/sampdla próbek o wysokim zakresie (1 μg/mL (do 20 ng/mL) zmieszać RiboGreen w stosunku 1:200 w 1x TE; dla próbek o niskim stężeniu (od 50 ng/mL do 1 ng/mL) zmieszać RiboGreen w stosunku 1:2000 w 1x TE; Pipetować 50 μL roztworu RiboGreen do każdej studzienki nieprzezroczystej płytki, zaczynając od A1 i przesuwając się w dół, a nie w poprzek
    3. Rozcień roztwór zapasowy RNA do 2 μg/mL dla próbek o wysokim stężeniu lub 100 ng/μL dla próbek o niskim zakresie stężeń
    4. Przy użyciu roztworów stokowych należy sporządzić krzywą standardową poprzez wykonanie sześciu następujących po sobie dwukrotnych rozcieńczeń (1:2) roztworu wyjściowego. 2 μg/mL lub roztwór zapasowy o stężeniu 100 ng/ml; Pipetować 240 μL roztworu zapasu do probówki w pasku PCR. Do pozostałych 7 probówek nanieść pipetą 120 μL 1x TE. Pobrać 120 μL z dołka z zapasem RNA i wymieszać w probówce 2. Pobrać 120 μL z probówki 2 i wymieszać z zawartością probówki 3. Powtarzać czynność aż do probówki 7. Probówka 8 będzie zawierać wyłącznie bufor TE i posłuży jako próba blank. Pipetować 50 μL roztworów krzywej wzorcowej do nieprzezroczystej płytki, pola A1:H2 (wykonać krzywą dwukrotnie)
    5. W nowej probówce wymieszać 45 μL TE z 5 μL z puli oligos i dodać wszystkie 50 μL do studzienki zawierającej 50 μL barwnika RiboGreen.
    6. Przy użyciu czytnika płytek należy ustawić urządzenie na odczyt fluorescencji od góry, po jednominutowym mieszaniu, przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 530 nm, a następnie odczytać płytkę.
    7. Wykorzystaj wygenerowaną krzywą standardową do ilościowego oznaczenia odzyskanego RNA, które należy przechowywać w temperaturze -20°C.

Koimmunoprecypitacja puli oligonukleotydów z badanym kompleksem RNP

1. Przed rozpoczęciem ko-immunoprecypitacji przygotować kulek Dynabeads Protein A i Protein G firmy Invitrogen, mieszając je w stosunku 1:1 do końcowej objętości 50 μL na reakcję. Na przykład dla dwóch reakcji należy dodać po 50 μL każdego rodzaju kulek.
2. Użyć statywu do separacji magnetycznej, takiego jak ten z firmy Novagen, aby unieruchomić kulki podczas usuwania naddatku i dwukrotnego przemywania kulek równą objętością zimnego 1x PBS
3. Po drugim przemyciu zawiesić ponownie kulki w równej objętości zimnego 1x PBS i dodać 2 ng przeciwciała na reakcję. Ilość ta może się różnić w zależności od przeciwciała, dlatego konieczne jest przeprowadzenie doświadczeń w celu znalezienia optymalnych warunków.
4. Mieszaninę przeciwciał i kulek inkubować przez noc w temperaturze 4°C na platformie rotacyjnej
5. Rano dodać 2 μg na reakcję sonikowanego całkowitego RNA drożdży, aby zablokować niespecyficzne wiązanie, i rotować przez kolejne 30 minut w temperaturze 4°C.
6. Używając statywu magnetycznego do unieruchomienia kulek, usunąć naddatek i przemyć kulki dwukrotnie zimnym 1x PBS, pozostawiając w probówce PBS z drugiego przemycia.
7. Przygotować nowe probówki, jedną dla każdej reakcji, i odmierzyć 50 μL mieszaniny kulek do każdej probówki. Pozostawić kulki w spoczynku podczas przygotowywania master mixu
8. Do każdej reakcji dodać 200 ng puli oligo, ekvimolarny stosunek starterów ochronnych, 2 μg sonikowanego całkowitego RNA drożdży, 20 μL ekstraktu jądrowego HeLa (jest to źródło RNP) oraz bufor E do osiągnięcia objętości 120 μL. Startery ochronne są wersjami RNA starterów uniwersalnych. Należy zamówić matryce transkrypcyjne starterów uniwersalnych z dołączonym na końcu tagiem T7, a następnie przeprowadzić transkrypcję RNA z matryc przy użyciu zestawu MEGAshortscript™.
9. Usunąć naddatek z alikwotów kulek i zawiesić ponownie kulki w 120 μL master mixu. Reakcje inkubować w temperaturze 4°C przez 1-2 godziny, delikatnie kołysząc probówkami.
10. Po inkubacji, dla każdej reakcji, pobrać mały alikwot (łącznie z kulkami) jako próbkę RNA „całkowitego”
11. Pozostałe reakcje umieścić na statywie do separacji magnetycznej i usunąć naddatek. Chociaż analiza tej próbki przepływowej na dalszych etapach nie jest konieczna, może być przydatne jej zachowanie.
12. Przemyć kulki 1-2 razy 50 μL zimnego 1x PBS. RNA związane z przeciwciałem na kulkach stanowi próbkę „IP”.
13. Zawiesić ponownie kulki „całkowite” oraz „IP” w 50 μL 1% SDS w buforze 0.1x TE i podgrzać próbki w temperaturze 65°C przez 15 minut, aby eluować RNA.
14. Usunąć naddatek, który zawiera teraz RNA wcześniej związane z kulkami, i oczyścić go poprzez ekstrakcję fenol/chloroform, a następnie wytrącenie etanolem. Osad wysuszyć i zawiesić ponownie w 50 μL buforu 0.1x TE.

Odwrotna transkrypcja i amplifikacja próbek co-IP w przygotowaniu do znakowania aminoallylowego

1. Następnie próbki RNA należy poddać odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR. Do reakcji odwrotnej transkrypcji należy użyć uniwersalnych starterów rewersyjnych.
2. Dla każdej próbki należy najpierw zmieszać 1 μL uniwersalnego startera rewersyjnego z 1 μL matrycowego RNA (z reakcji immunoprecypitacji) oraz 10 μL dH₂O. Reakcje należy ogrzewać w temperaturze 70°C przez 5 minut, a następnie schłodzić na lodzie lub przechowywać w 4°C.
3. Podczas chłodzenia próbek należy przygotować następującą mieszaninę master mix. Na każdą reakcję należy połączyć 4 μL 10 mM dNTPs, 2 μL buforu 10x Arrayscript, 1 μL inhibitora RNazy oraz 1 μL enzymu odwrotnej transkrypcji. Całość należy dokładnie wymieszać, a następnie dodać 8 μL mieszaniny master mix do każdej reakcji odwrotnej transkrypcji.
4. Próbki należy inkubować w termocyklerze w temperaturze 42°C przez 2 godziny, następnie w 95°C przez 5 minut, a potem w 4°C do momentu rozpoczęcia amplifikacji.
5. Po przeprowadzeniu odwrotnej transkrypcji próbek RNA należy poddać je amplifikacji PCR przy użyciu starterów uniwersalnych, z których jeden zawiera tag T7. Liczba cykli niezbędna do amplifikacji puli zależy od wydajności ko-IP, dlatego może być konieczne przetestowanie różnych liczb cykli. Każda reakcja wymaga 5 μL buforu do reakcji Taq 10x, 0,2 μL każdego startera (100 mM), 1 μL matrycy cDNA (z reakcji odwrotnej transkrypcji), 1 μL 10 mM dNTPs, 42,2 μL dH₂O oraz 0,4 μL enzymu Taq.
   
   PCR należy rozpocząć od inkubacji próbek w 94°C przez 3 minuty. Następnie, w każdym cyklu, przeprowadza się denaturację w 94°C przez 45 sekund, przyłączanie starterów w 55°C przez 30 sekund oraz elongację w 72°C przez jedną minutę, z końcową elongacją w 72°C przez 10 minut.
6. Następnie próbki należy ponownie poddać transkrypcji z użyciem zestawu MEGAshortscript™, jednak tym razem należy dodać 2 μL aminoallyl UTP zamiast T7 UTP. Aminoallyl UTP posłuży do znakowania RNA barwnikami Cy.
7. Próbki należy poddać precypitacji fenolem/chloroformem oraz etanolem. NIE wolno używać Glycoblue ani octanu amonu, ponieważ oba te odczynniki mogą zakłócać hybrydyzację próbek z macierzą. Osad należy wysuszyć i resuspenderć w 4,5 μL 0,1 M węglanu sodu.

Znakowanie RNA grupami amino-allylowymi z użyciem barwników Cy

1. Aby rozpocząć protokół znakowania, rozpuścić każdy z barwników fluorescencyjnych, Cy3 i Cy5, w 45 μL DMSO. W celu ochrony przed światłem owinąć probówki folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20°C w ciemności.
2. Do próbek RNA dodać 2.5 μL wody wolnej od nukleaz i dokładnie wymieszać.
3. Następnie dodać 3 μL Cy3 do próbki „total” oraz 3 μL Cy5 do próbki „IP”. Inkubować próbki w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej; próbka z Cy3 zmieni kolor na czerwony lub różowy, natomiast próbka z Cy5 na niebieski.
4. Aby przerwać reakcję, dodać 6 uL 4 M chlorku hydroksyloaminy (hydroxylamine-HCl) do każdej próbki, dokładnie wymieszać i krótko wirować. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Oczyścić znakowane próbki poprzez ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie wytrącanie etanolem; osad zawiesić ponownie w 50 μL 0.1x TE.

Hybrydyzacja próbek z macierzą za pomocą zestawu Agilent Array Hybridization Kit

1. Rozpocznij hybrydyzację, delikatnie mieszając 50 μL 10x buforu blokującego, 140 μL wody H2_O wolnej od nukleaz, 25 μL „całkowitej” puli znakowanej Cy3, 25 μL puli „IP” znakowanej Cy5, 10 μL 25x buforu do fragmentacji oraz 250 μL 2x buforu do hybrydyzacji, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Przecentryfuguj próbkę krótko w mikrowirówce, aby zebrać roztwór na dnie probówki oraz zredukować liczbę pęcherzyków.
2. Umieść szkiełko nakrywką z uszczelką O-ring w komorze hybrydyzacyjnej i ostrożnie nanieś roztwór na szkiełko za pomocą pipety.
3. Umieść macierz detekcyjną na wierzchu szkiełka nakrywki, aby „zamknąć” roztwór w kanapce. Pamiętaj o odpowiednim ustawieniu szkiełka z macierzą tak, aby etykieta Agilent na macierzy była skierowana w stronę etykiety Agilent na szkiełku nakrywce.
4. Zaciśnij zestaw szkiełko/macierz w komorze hybrydyzacyjnej i inkubuj przy obrocie w temperaturze 50°C przez 3 godziny.
5. Podczas obrotu macierzy przygotuj następujące roztwory o objętości 50 mL w stożkowych probówkach 50-ml: jedną probówkę wypełnioną 50 mL dH₂O, dwa roztwory 1x buforu SCC (każdy w oddzielnej probówce) oraz jeden roztwór 2x buforu SCC.
6. Po trzechgodzinnej inkubacji ostrożnie zwolnij zacisk zestawu macierz/szkiełko i umieść go w probówce stożkowej 50 mL zawierającej 2x bufor SCC. Używając pęsety, delikatnie oddziel macierz od szkiełka nakrywki i wyjmij szkiełko nakrywkę. Uważaj, aby nie dotknąć macierzy podczas wyjmowania szkiełka. Zamknij probówkę i delikatnie odwracaj ją przez 60 sekund.
7. Używając pęsety, przenieś macierz do roztworu 1x SCC, zakręć probówkę i delikatnie odwracaj przez 1 minutę, a następnie przenieś macierz do drugiego roztworu 1x SCC i ponownie delikatnie odwracaj przez kolejną minutę.
8. Na koniec przenieś macierz do probówki z dH₂O i delikatnie odwracaj przez 30 sekund.
9. Osusz macierz, opierając krawędzie szkiełka o chusteczkę Kimwipe. Kontynuuj obracanie macierzy na chusteczce, dbając o to, aby nie uszkodzić strony zawierającej oligosakramenty.
10. Umieść suchą macierz w pustej probówce stożkowej 50-ml i zeskanuj za pomocą skanera do mikroarray.

Interpretacja mikromacierzy

1. Skaner do mikromacierzy utworzy obraz TIF macierzy. Przetwórz ten obraz w oprogramowaniu Agilent Feature Extraction, korzystając z pliku siatki (dostarczonego przez Agilent), który jest unikalny dla danej puli.
2. Oprogramowanie Agilent zinterpretuje sygnał w każdym elemencie, aby utworzyć plik, który jest następnie analizowany za pomocą skryptu Perl. Sygnał w każdym elemencie jest normalizowany do całkowitej intensywności w danym kanale. Na przykład dla konkretnego elementu w kanale zielonym, intensywność kanału zielonego dla poszczególnego elementu jest dzielona przez całkowitą intensywność kanału zielonego dla wszystkich elementów. Końcowym wynikiem jest logarytmiczny stosunek intensywności kanału czerwonego do kanału zielonego dla każdego elementu na macierzy.
3. Dane z puli oligonukleotydów z mikromacierzy mogą zostać ponownie zmapowane na genom, aby uzyskać obraz tego, gdzie i z jaką siłą wiązało się analizowane RNP.

Rysunek 1. Schemat eksperymentalny

A. Schemat pokrycia (tiling). Po wybraniu i pobraniu interesujących sekwencji pre-mRNA, obszar wyboru jest pokrywany oknami o szerokości 30 nukleotydów, które przesuwają się w interwałach 10 nukleotydów. Uniwersalne miejsca wiązania starterów znajdują się po obu stronach okna.

B. Macierz syntezy. Zamówienia na kafelkowane oligonukleotydy należy przesłać do firmy Agilent, gdzie sekwencje zostaną naniesione na niestandardową macierz mikroukładów oligonukleotydowych.

C. Ko-immunoprecypitacja. Po odgotowaniu oligonukleotydów z macierzy, inkubować je w ekstrakcie jądrowym komórek HeLa, a następnie dodać ekstrakt do kulek magnetycznych przygotowanych z przeciwciałem przeciwko badanemu kompleksowi RNP. Początkową pulę oligonukleotydów znakować barwnikiem Cy3, a pulę związaną w IP barwnikiem Cy5, następnie nanieść na macierz detekcyjną i przeskanować.

Rycina 2. Adnotacja genomu oraz analiza danych o wzbogaceniu.

A. Przetransformuj średnią wartość dla każdej współrzędnej genomicznej z danych z macierzy na logarytm dziesiętny i przypisz tę wartość do podanych współrzędnych. Ilustracja tego etapu uśredniania została przedstawiona dla 3 nakładających się oligonukleotydów o długości 30 nt o wartościach 2, 4 i 0,5, gdzie powyżej wykreślono średnią wartość wzbogacenia dla każdego okna o długości 10 nt. Wybrane regiony genomiczne można zwizualizować za pomocą niestandardowego ścieżki (Custom Track) w przeglądarce UCSC Genome Browser. Przedstawione okno przeglądarki znajduje się w obrębie genu clta, gdzie cechy genu (eksony/introny/alternatywny splicing itp.) są podane na dole, a logarytmiczne średnie wartości wzbogacenia dla oligonukleotydów związanych z PTB są reprezentowane przez ciemnoczerwone pionowe słupki. PTB silnie wiąże się bezpośrednio powyżej eksonu 2 w obrębie traktu polypyrimidine.

Dyskusja

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że tworzenie puli jest elastyczne i dopuszcza modyfikacje zarówno na poziomie RNA, jak i białka. Na poziomie RNA w sekwencji oligonukleotydowej można wprowadzić regiony ortologiczne, mutacje chorobowe, polimorfizmy lub mutacje losowe. Na poziomie białka czynnik wiążący RNA może zostać zmodyfikowany poprzez fosforylację lub inne modyfikacje potranslacyjne. Ponadto można manipulować środowiskiem wiązania, aby zwiększyć lub zmniejszyć poziom dodatkowych czynników, które odd...