Szybka, wysokoprzepustowa metoda mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Podsumowanie

Ze względu na przejściową naturę pre-mRNA, może być trudno wyizolować i badać in vivo. W tym miejscu przedstawiamy nowatorskie podejście in vitro do badania interakcji RNA-białko przy użyciu syntetycznej puli oligo, która układa się w wybranych regionach pre-mRNA.

Streszczenie

Sekwencjonowanie RNA, które ulegają koimmunoprecypitacji (co-IP) z białkami wiążącymi RNA, poszerzyło naszą wiedzę na temat splicingu, wykazując, że lokalizacja wiązania często wpływa na funkcję czynnika splicingowego. Jednak, podobnie jak w przypadku każdej strategii pobierania próbek, szansa na zidentyfikowanie RNA związanego z czynnikiem splicingu jest proporcjonalna do jego liczebności komórkowej. Opracowaliśmy nowatorskie podejście in vitro do badania swoistości wiązania z pre-mRNA, które w przeciwnym razie byłoby przejściowe. Podejście to wykorzystuje specjalnie zaprojektowaną pulę oligonukleotydów, która układa się w intronach, eksonach, połączeniach splicingowych lub innych pre-mRNA. Basen jest poddawany pewnego rodzaju selekcji molekularnej. Tutaj demonstrujemy metodę, rozdzielając oligonukleotyd na frakcję związaną i niezwiązaną oraz wykorzystując strategię tablicy dwóch kolorów do rejestrowania wzbogacenia każdego oligonukleotydu we frakcji związanej. Dane z macierzy generują mapy o wysokiej rozdzielczości z możliwością identyfikacji specyficznych dla sekwencji i strukturalnych determinat wiązania rybonukleoprotein (RNP) na pre-mRNA. Unikalną zaletą tej metody jest jej zdolność do uniknięcia błędu próbkowania w kierunku mRNA związanego z obecnymi technikami IP i SELEX, ponieważ pula jest specjalnie zaprojektowana i zsyntetyzowana z sekwencji pre-mRNA. Elastyczność puli oligonukleotydów jest kolejną zaletą, ponieważ eksperymentator wybiera, które regiony chce badać i układać w poprzek nich, dostosowując pulę do swoich indywidualnych potrzeb. Za pomocą tej techniki można oznaczyć wpływ polimorfizmów lub mutacji na wiązanie na dużą skalę lub sklonować bibliotekę do funkcjonalnego reportera splicingowego i zidentyfikować oligonukleotydy, które są wzbogacone w uwzględnioną frakcję. Ten nowatorski schemat mapowania in vitro o wysokiej rozdzielczości zapewnia unikalny sposób badania interakcji RNP z przejściowymi gatunkami pre-mRNA, których niska liczebność utrudnia ich badanie za pomocą obecnych technik in vivo.

Protokół

Projektowanie basenu i odzyskiwanie oligo

1. Pierwszym krokiem jest zaprojektowanie puli pre-mRNA, która ma być badana. Można to zrobić za pomocą przeglądarki genomu UCSC i pobrać określone geny, połączenia splicingowe lub inne obszary zainteresowania.
2. Po wybraniu interesujących Cię okien rozmieścić je obliczeniowo w poprzek nich, korzystając z następujących warunków: długość odczytu powinna wynosić 30 nukleotydów z nakładaniem się 10 nukleotydów, dlatego każdy oligonotyd jest przesunięty o 20 nukleotydów od poprzedniego. *Nakładanie się oligonukleotydów powinno być zwiększone w pobliżu miejsc łączenia, aby zapewnić odpowiednie pokrycie; Zwiększenie nakładania się z 10 do 20 nukleotydów może to osiągnąć.
3. Flankuj każdy 30-nukleotydowy oligo uniwersalnymi sekwencjami starterów, które zostaną użyte do amplifikacji puli poniżej. Zamówienia na oligonukleotydy kafelkowe należy składać do firmy Agilent, gdzie sekwencje zostaną wydrukowane na niestandardowej mikromacierzy oligonukleotydowej.
4. Aby odzyskać oligonukleotydy DNA z powierzchni mikromacierzy, należy rozpocząć od umieszczenia szkiełka przykrywającego matrycę w komorze hybrydyzacji matrycy i delikatnie odpipetować 500 μl dH₂O na szkiełko
5. Umieść matrycę na szkiełku pokrywy, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócić proces. Pamiętaj, aby umieścić tablicę zadrukowaną do dołu, tak aby strona z oligonukleotykami dotykała powierzchni wody. Dobrą zasadą jest "Agilent dotyka Agilent", co oznacza, że etykieta Agilent na tablicy jest zwrócona w stronę etykiety Agilent na slajdzie okładkowym
6. Zamknąć komorę hybrydyzacyjną i obracać przez noc w temperaturze 99°C w piecu do hybrydyzacji
7. Następnego dnia ostrożnie wyjmij matrycę z komory i odciągnij wodę, która teraz zawiera oligonukleotydy uwolnione z powierzchni matrycy. To jest pula oligo
8. Umieść basen w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i poddaj go sonifikacji przy amplitudzie 50% przez 3-5 sekund impulsów
9. Następnie amplifikuj pulę za pomocą PCR o niskim cyklu, używając uniwersalnych starterów ze znacznikiem T7 dołączonym na końcu. W pierwszej rundzie denaturacja w temperaturze 94°C przez 1 minutę, wyżarzanie w temperaturze 55°C przez 20 sekund i wydłużanie przez 1 minutę w temperaturze 72°C. W kolejnych rundach wykonuj 10 sekund, 20 sekund i 10 sekund w każdej odpowiedniej temperaturze, z końcowym krokiem wydłużenia wynoszącym 5 minut w temperaturze 72°C. Ponieważ liczba cykli niezbędnych do wzmocnienia puli zależy od wydajności odzyskiwania oligo, może być konieczne wypróbowanie wielu numerów cykli. Uważaj, aby nie przesadzić z amplifikacją basenu, co jest oznaczone rozmazaną opaską na żelu akrylowym. Amplifikowane próbki PCR można przechowywać w temperaturze 4°C do czasu, gdy będą potrzebne.
10. Ostatnim krokiem w przygotowaniu oligo jest transkrypcja RNA za pomocą zestawu MEGAshortscript™ firmy Ambion. *Poniższy protokół został zaadaptowany z Ambion
    1. Rozmrozić bufor reakcyjny T7 10x, cztery roztwory rybonukleotydów i wodę w temperaturze pokojowej, utrzymując mieszaninę enzymów T7 na lodzie
    2. Mieszaninę reakcyjną zebrać w probówce mikrowirówkowej wolnej od RNaz w temperaturze pokojowej. Składniki buforu reakcyjnego mogą powodować wytrącanie się matrycowego DNA, jeśli reakcja jest mieszana na lodzie.
    3. W następującej kolejności odpipetować 3 μl wody wolnej od nukleaz, 2 μl 10x buforu reakcyjnego, 2 μl każdego 75 mM roztworu nTP, 5 μl matrycowego DNA (pula oligonów amplifikowana PCR) i 2 μl enzymu T7, aby uzyskać końcową objętość 20 μl
    4. Delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać reakcję, a następnie krótko zmikrofuzyj, aby zebrać mieszaninę na dnie probówki.
    5. Inkubować reakcję w termocyklerze w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Czas inkubacji będzie zależny od szablonu, dlatego może być konieczne zastosowanie eksperymentu z przebiegiem w czasie w celu określenia optymalnego czasu inkubacji dla maksymalnej wydajności
    6. Po 2 godzinach usunąć matrycę DNA, dodając do reakcji 1 μl Turbo DNazy i inkubować w temperaturze 37°C przez dodatkowe 15 minut
    7. Zakończyć reakcję i odzyskać RNA przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolu.
       1. Aby uzyskać objętość reakcyjną 20 μl, dodać do reakcji 115 μl_dH2O i 15 μl 3 M octanu sodu do reakcji.
       2. Dokładnie wymieszaj, a następnie dodaj 75 μl kwaśnego fenolu i 75 μl chloroformu. Wymieszaj roztwór przez wirowanie, a następnie mikrofuguj przez minutę z prędkością 13 000 obr./min w temperaturze pokojowej. Przenieś warstwę wodną do nowej probówki i powtórz ekstrakcję
       3. Przenieść warstwę wodną do nowej probówki i dodać 150 μl chloroformu. Zmieszaj mieszaninę i odwiruj jak poprzednio. Przenieś warstwę wodną do nowej probówki.
    8. Odzyskaj RNA, dodając dwie objętości 100% zimnego etanolu do warstwy wodnej i dobrze mieszając. Schładzać mieszaninę przez co najmniej 15 minut w temperaturze -20°C, a następnie wirować w temperaturze 4°C przez 15 minut z maksymalną prędkością, aby uzyskać granulowanie RNA. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 105 μl 0,1x bufor Tris-EDTA (TE).
11. Trudno jest usunąć wszystkie wolne nukleotydy z reakcji T7 Kit, więc aby uzyskać najdokładniejsze wyniki, określ ilościowo RNA za pomocą RiboGreen.
    1. Aby rozpocząć oznaczanie ilościowe, najpierw rozcieńczyć wystarczająco 1x TE, 2,300 μL + 50 μL / próbkę.
    2. Następnie przygotuj RiboGreen. Będziesz potrzebował 1000 μL + 50 μL/próbkę. W przypadku próbek o wysokim zakresie (od 1 μg/ml do 20 ng/ml) należy zmieszać RiboGreen 1:200 w 1x TE; dla próbek o niskim zakresie (od 50 ng/ml do 1 ng/ml) zmieszać RiboGreen 1:2000 w 1x TE; Odpipetować 50 μl roztworu RiboGreen do każdego dołka nieprzezroczystej płytki, zaczynając od A1 i przesuwając się w dół, a nie w poprzek
    3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy RNA do 2 μg/ml dla próbek o wysokim zakresie lub 100 ng/μl dla próbek o niskim zakresie
    4. Korzystając z roztworów podstawowych, utwórz krzywą wzorcową przez sześć kolejnych rozcieńczeń 1:2 pierwotnego 2 μg/ml lub 100 ng/ml podstawy; Odpipetować 240 μl wywaru do probówki z paskiem do PCR. W pozostałych 7 probówkach odpipetować 120 μL 1x TE. Weź 120 μl z podstawowego RNA i wymieszaj z probówką 2. Pobrać 120 μl z probówki 2 i wymieszać z probówką 3. Powtarzaj do probówki 7. Tube 8 będzie miał tylko TE i będzie twoim blankiem. Odpipetować 50 μl roztworów wzorcowej krzywej do nieprzezroczystej płytki, A1:H2 (uruchomić krzywą dwukrotnie)
    5. W nowej probówce wymieszaj 45 μl TE z 5 μl puli oligo i dodaj wszystkie 50 μl do studzienki zawierającej 50 μl RiboGreen.
    6. Za pomocą czytnika płytek ustaw maszynę tak, aby odczytywała fluorescencję od góry po jednominutowym mieszaniu o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 530 nm i odczytała płytkę
    7. Użyć wygenerowanej krzywej wzorcowej do ilościowego określenia odzyskanego RNA, który powinien być przechowywany w temperaturze -20°C.

Umieść resztę reakcji na stojaku do separacji magnetycznej i usuń supernatant. Chociaż nie jest konieczne analizowanie tej przepływowej próbki za nią, przydatne może być jej zazapisywanie.

Umyj koraliki 1-2 razy 50 μl zimnego 1x PBS. RNA związane z przeciwciałem na kulkach to próbka "IP".

Ponownie zawiesić kulki "całkowite" i "IP" w 50 μl 1% SDS w buforze 0,1x TE i podgrzewać próbki w temperaturze 65°C przez 15 minut w celu elucji RNA.

Usunąć supernatant, który teraz zawiera RNA, który był wcześniej związany z kulkami, i oczyścić przez ekstrakcję fenolem/chloroformem, a następnie wytrącić etanol. Wysuszyć osad i ponownie zawiesić go w 50 μL buforze 0,1x TE.

Odwrotna transkrypcja i amplifikacja próbek co-IP w ramach przygotowań do znakowania aminoallilu

1. Następnie próbki RNA muszą zostać poddane odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR. Do reakcji odwrotnej transkrypcji użyj odwrotnych uniwersalnych starterów.
2. Dla każdej próbki należy rozpocząć od zmieszania 1 μl odwróconego uniwersalnego startera z 1 μl matrycowego RNA (z reakcji immunoprecypitacji) i 10 μl dH₂O. Podgrzewaj reakcje w temperaturze 70°C przez 5 minut, a następnie schładzaj na lodzie lub trzymaj w temperaturze 4°C.
3. Gdy próbki ostygną, przygotuj następujący miks główny. Do każdej reakcji połącz 4 μl 10 mM dNTP, 2 μl 10x buforu Arrayscript, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl enzymu odwrotnej transkrypcji. Dokładnie wymieszać i dodać 8 μl mieszanki wzorcowej do każdej reakcji odwrotnej transkrypcji.
4. Za pomocą maszyny do PCR inkubuj próbki w temperaturze 42°C przez 2 godziny, następnie w temperaturze 95°C przez 5 minut, a następnie w temperaturze 4°C, aż próbki będą potrzebne do amplifikacji.
5. Po odwrotnej transkrypcji próbek RNA, PCR amplifikuje je za pomocą uniwersalnych starterów, przy czym jeden ze starterów zawiera znacznik T7. Liczba cykli potrzebnych do wzmocnienia puli będzie zależeć od wydajności co-IP, więc może być konieczne wypróbowanie wielu cykli. Każda reakcja wymaga 5 μl 10x buforu reakcyjnego Taq, 0,2 μl każdego startera (100 mM), 1 μl matrycy cDNA (z reakcji odwrotnej transkrypcji), 1 μL 10 mM dNTP, 42,2 μL dH₂O i 0,4 μl enzymu Taq.
   
   Rozpocznij PCR od inkubacji próbek w temperaturze 94°C przez 3 minuty. Następnie, dla każdego cyklu, denaturacja w temperaturze 94°C przez 45 sekund, wyżarzanie w temperaturze 55°C przez 30 sekund i wydłużanie w temperaturze 72°C przez jedną minutę, z końcowym wydłużeniem w temperaturze 72°C przez 10 minut.
6. Następnie ponownie dokonaj transkrypcji próbek za pomocą zestawu MEGAshortscript™, jednak tym razem dodaj 2 μl aminoallilu UTP, zamiast T7 UTP. Aminoallilowy UTP zostanie użyty do znakowania RNA barwnikami Cy.
7. Fenol/chloroform i etanol wytrącają próbki. NIE należy używać Glycoblue ani octanu amonu, które mogą zakłócać hybrydyzację próbek do macierzy. Wysuszyć osad i ponownie zawiesić w 4,5 μl 0,1 M węglanu sodu.

Znakowanie amino-allilowe RNA za pomocą barwników Cy

1. Aby rozpocząć protokół znakowania, rozpuść każdy z barwników fluorescencyjnych, cy3 i cy5, w 45 μl DMSO. Aby uniknąć światła, zawiń probówki w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze -20°C w ciemności
2. Do próbek RNA dodać 2,5 μl wody wolnej od nukleaz i dokładnie wymieszać
3. Następnie dodaj 3 μl Cy3 do "całkowitej" próbki i 3 μl Cy5 do próbki "IP". Próbki inkubować w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej; Próbka Cy-3 zmieni kolor na czerwony lub różowy, podczas gdy Cy-5 zmieni kolor na niebieski.
4. Aby zakończyć reakcję, dodać 6 μl 4 M chlorowodorku hydroksyloaminy do każdej próbki, dokładnie wymieszać i krótko odwirować. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Oczyścić oznakowane próbki przez ekstrakcję fenolem/chloroformem, a następnie wytrącić etanol i ponownie zawiesić osad w 50 μl 0,1x TE

Hybrydyzacja próbek do mikromacierzy za pomocą zestawu do hybrydyzacji Agilent Array

1. Rozpocznij hybrydyzację od delikatnego wymieszania 50 μl 10x buforu blokującego, 140 μl_H2O wolnego od nukleaz, 25 μl "całkowitej" puli znakowanej Cy3, 25 μl puli "IP" znakowanej Cy5, 10 μl 25x buforu fragmentacyjnego i 250 μl 2x buforu hybrydyzacyjnego, uważając, aby nie wprowadzać pęcherzyków. Krótko zmikrofukowal próbkę, aby zebrać roztwór na dnie probówki, a także zredukować pęcherzyki.
2. Umieść szkiełko zakrywające o-ring w komorze hybrydyzacji i ostrożnie odpipetuj roztwór na szkiełko.
3. Umieść matrycę detekcyjną na szkiełku pokrywy, aby "umieścić" roztwór. Pamiętaj, aby ustawić slajd tablicy w taki sposób, aby etykieta Agilent na tablicy była skierowana w stronę etykiety Agilent na slajdzie tytułowym.
4. Zacisnąć kanapkę z szkiełkiem/matrycą w komorze hybrydyzacji i obracać w temperaturze 50°C przez 3 godziny.
5. Podczas obracania się układu przygotuj następujące 50 ml roztworów w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml: jeden stożkowy wypełniony 50 ml dH₂O, dwa roztwory buforowe 1x SCC, każdy w osobnej probówce i jeden bufor 2x SCC.
6. Po trzygodzinnej inkubacji ostrożnie odblokować kanapkę z matrycą/szkiełkiem i umieścić ją w stożkowym pojemniku o pojemności 50 ml zawierającym bufor 2x SCC. Za pomocą pęsety delikatnie oddziel matrycę od szkiełka pokrywy i wyciągnij suwak pokrywy. Uważaj, aby nie dotknąć matrycy, gdy suwak jest wysuwany. Zamknij stożek i delikatnie odwróć przez 60 sekund.
7. Za pomocą pęsety przenieś macierz do roztworu 1x SCC, zakryj rurkę i delikatnie odwróć przez 1 minutę, a następnie przenieś matrycę do drugiego roztworu 1x SCC i ponownie delikatnie odwróć przez kolejną minutę.
8. Na koniec przenieś matrycę do rurki dH₂O i delikatnie odwróć przez 30 sekund.
9. Wysusz matrycę, umieszczając krawędzie szkiełka na Kimwipe. Kontynuuj obracanie matrycy na chusteczce, uważając, aby nie zakłócić strony zawierającej oligonukleotydów.
10. Umieść suchą matrycę w pustej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zeskanuj za pomocą skanera Microarray

Interpretacja mikrotablicy

1. Skaner mikromacierzy utworzy obraz TIF tablicy. Uruchom ten obraz za pomocą oprogramowania Agilent Feature Extraction, używając pliku siatki (dostarczonego przez Agilent), który jest unikalny dla konkretnej puli.
2. Oprogramowanie Agilent zinterpretuje sygnał przy każdej funkcji, aby utworzyć plik, który jest przetwarzany za pomocą skryptu Perla. Sygnał w każdej funkcji jest normalizowany do całkowitego natężenia na tym kanale. Na przykład dla określonego obiektu w kanale zielonym intensywność kanału zielonego dla pojedynczego elementu jest dzielona przez całkowitą intensywność kanału zielonego dla wszystkich cech. Końcowym wynikiem jest stosunek logarytmiczny kanału czerwonego do kanału zielonego dla każdej funkcji w tablicy.
3. Dane z puli oligonucyklotyków z mikromacierzy można ponownie zmapować z powrotem do genomu, aby uzyskać obraz tego, gdzie i jak mocno wiąże się RNP będący przedmiotem zainteresowania.

Rysunek 1. Schemat eksperymentalny

A. Schemat kafelkowania. Po wybraniu i pobraniu interesujących sekwencji pre-mRNA, obszar wyboru jest podzielony na 30 okien nukleotydowych, które przesuwają się w 10 przyrostach nukleotydowych. Uniwersalne miejsca wiązania podkładu po obu stronach okna.

B. Tablica syntezy. Zamówienia na oligonukleotydy kafelkowe należy składać do firmy Agilent, gdzie sekwencje zostaną wydrukowane na niestandardowej mikromacierzy oligonukleotydowej.

C. Koimmunoprecypitacja. Po ugotowaniu oligonukleotydów z matrycy, inkubować w ekstrakcie jądrowym HeLa, a następnie dodać ekstrakt do kulek magnetycznych, które są przygotowane z przeciwciałem przeciwko interesującemu RNP. Oznacz początkową pulę oligo za pomocą Cy3, a powiązaną pulę adresów IP za pomocą Cy5 i zastosuj do tablicy wykrywania i skanowania.

Rysunek 2. Adnotacja genomu i analiza danych dotyczących wzbogacania.

A. Przelicz średni wynik dla każdej współrzędnej genomowej z danych tablicy na logarytm o podstawie dziesięciu i odwzoruj ten wynik na podane współrzędne. Ilustracja tego kroku uśredniania jest podana dla 3 nakładających się oligonukleotydów 30-nt z wynikami 2, 4 i 0,5, gdzie średni wynik wzbogacenia dla każdego okna 10-nt jest przedstawiony na wykresie powyżej. Wybrane regiony genomu można wizualizować za pomocą ścieżki niestandardowej w przeglądarce genomu USCS. Przykładowe okno przeglądarki znajduje się w genie clta, gdzie cechy genów (eksony / introny / alternatywny splicing itp.) są podane wzdłuż dołu, a logarytmiczne średnie wyniki wzbogacenia z oligonukleotydów związanych z PTB są reprezentowane przez ciemnoczerwone pionowe paski. PTB silnie wiąże się tuż przed eksonem 2 w przewodzie polipirymidynowym.

Dyskusja

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że tworzenie puli jest elastyczne i otwarte na modyfikację zarówno na poziomie RNA, jak i białka. Na poziomie RNA do sekwencji oligonukleotydowej można wprowadzić regiony ortologiczne, mutacje chorobowe, polimorfizmy lub mutacje losowe. Na poziomie białka czynnik wiążący RNA może być modyfikowany przez fosforylację lub inne modyfikacje potranslacyjne. Ponadto środowiskiem wiązania można manipulować w celu zwiększenia lub zmniejszenia poziomów dodatkowych czynników, któ...