$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Budowa wektora wyrażenia i wyrażenia:
Wektor ekspresji pSESAME-Cre został skonstruowany poprzez wstawienie fragmentu kodującego Cre do pSESAME za pośrednictwem miejsc restrykcyjnych AvrII i NheI przy użyciu standardowych metod klonowania. pSESAME koduje białko fuzyjne składające się ze znacznika histydyny, domeny TAT, sekwencji NLS i Cre, w skrócie HTNCre. W celu ekspresji HTNCre pSESAME-Cre przekształcono w TUNER (DE3) pLacI i użyto do przygotowania bulionu glicerynowego.
- Kulturę w ciągu nocy zaszczepiono za pomocą końcówki pipety pokrytej przekształconymi bakteriami z bulionu glicerolu. Posiew w ciągu nocy składał się z pożywki LB uzupełnionej 0,5% glukozy [v/v] i karbenicyliny w końcowym stężeniu 50 μg/ml i pozostawiono do wzrostu w temperaturze 37°C przez 16 godzin.
- Następnego dnia gęsto wyhodowana kultura w nocy została użyta do zaszczepienia kultury ekspresyjnej w stosunku 1 do 40 i umieszczona w inkubatorze w temperaturze 37°C. Hodowla ekspresyjna składała się z pożywki przeciwgruźliczej uzupełnionej 0,5% glukozy [v/v] i ampicyliny w końcowym stężeniu 100 μg/ml.
- Przy OD595 wynoszącym 1,5 kulturę ekspresji indukowano za pomocą 0,5 mM IPTG przez 1 godzinę.
- Następnie bakterie zbierano przez wirowanie z prędkością 5000 obr./min przez 10 minut w SLA3000 wirniku.
- Granulki bakterii przechowywano w temperaturze minus 20°C do czasu oczyszczenia.
Oczyszczanie białka przepuszczalnego dla komórek:
- Zamrożone granulki bakterii zawieszono ponownie w 10 ml buforu do lizy na litr kultury kolby przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Zawiesinę inkubowano następnie z lizozymem o stężeniu 1 mg/ml przez dodatkowe 15 minut, mieszając w temperaturze pokojowej.
- Następnie dodano 25 U/ml benzonazy i inkubowano podczas mieszania przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Po sonifikacji na lodzie przez 1,5 minuty z impulsami 0,5 s przy 45% mocy, 1 ml zimnego buforu soli winowej (TSB) na ml zawiesiny ostrożnie dodano podczas mieszania i inkubowano przez 5 minut na lodzie. Pobrano próbkę frakcji lizatu (L) z SDS-PAGE.
- Oczyszczony lizat otrzymywano przez odwirowanie w temperaturze 4°C przez 30 minut przy 30 000 g. Pobrano próbki SDS-PAGE frakcji rozpuszczalnych (S) i nierozpuszczalnych (I).
- Supernatant przeniesiono do świeżych probówek sokoła o pojemności 50 ml, a następnie delikatnie mieszano przez 1 godzinę w temperaturze 4°C z 2 ml 50% zawiesiny Ni-NTA na litr początkowej hodowli ekspresyjnej.
- Zawiesinę umieszczono w grawitacyjnej kolumnie EconoPac (pobrano próbkę frakcji przepływowej (FT) SDS-PAGE) i dwukrotnie przemyto 5 objętościami buforu płuczącego z złożem. Pobrano próbki SDS-PAGE obu frakcji płuczących (W1 i W2).
- Frakcje zawierające HTNCre eluowano za pomocą 3 objętości złoża buforu elucyjnego i pobrano próbkę frakcji eluacyjnej (E) do analizy SDS-PAGE.
- Imidazol usunięto przez dwukrotne dializowanie frakcji elucyjnej w stosunku do buforu o wysokiej zawartości soli.
- Roztwór białkowy został następnie zagęszczony przez dwukrotne dializowanie z buforem glicerolu. Na wszystkich etapach dializy stosunek buforu do próbki wynosił co najmniej 50. W wyniku tej procedury otrzymano roztwór podstawowy glicerolu zawierający HTNCre w zwykłym stężeniu od 200 do 450 μM, tj. 1 litr kultury ekspresyjnej da ~12 mg białka. Pobrano próbkę surowca glicerolu (GS) do analizy SDS-PAGE. Roztwór podstawowy HTNCre może być przechowywany w temperaturze minus 20°C.
Rysunek 1: Analiza SDS-PAGE próbek pobranych podczas procesu oczyszczania rekombinazy Cre. Na indukcję ekspresji Cre wskazuje pasmo dominujące we frakcji lizatu. Chociaż część białka jest nierozpuszczalna, białko Cre może być dodatkowo wzbogacone, co widać we frakcjach podstawowych eluatu i glicerolu. L: lizat, I: nierozpuszczalny, S: supernatant, FT: przepływowy, W: przemywanie, E: eluat, GS: zapas gylcerolu. Proszę kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję rysunku 1.
Transdukcja białka do mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES):
- Komórki ES przenoszące warunkowy konstrukt reporterowy5 β-galaktozydazy wysiewano jako pojedyncze komórki przy użyciu TrypLE™ Express do dysocjacji przylegających komórek. Po 4 do 6 godzinach komórki ponownie się połączyły, a pożywka została usunięta.
- Następnie komórki ES inkubowano z pożywką zawierającą HTNCre przez 16 godzin.
- Odpowiednią ilość białka HTNCre (odpowiadającą 10 μM) z podstawowego glicerolu rozcieńczono do pożywki ES, a następnie sterylnie przefiltrowano (0,22 μm).
- Po transdukcji białka pożywka została zmieniona z powrotem na normalną pożywkę wzrostową.
- Po dwóch dniach komórki przemyto PBS i utrwalono 4% paraformaldehydem (PFA) przez 10 minut.
- Przed wykonaniem barwienia X-Gal wykonano dwa dodatkowe etapy mycia PBS.
- Utrwalone komórki pokryto warstwą roztworu barwiącego X-Gal6 i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C.
Reprezentatywne wyniki:
Następnego dnia zasysano roztwór do barwienia X-Gal i pokryto komórki warstwą PBS do analizy mikroskopowej. 80 do 100% rekombinowanych komórek można było zaobserwować w mysich komórkach ES ocenianych na podstawie aktywności β-galaktozydazy.
