$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Część 1: Przygotowanie tkanki
- Preparaty splotu podśluzówkowego i mięśniowego izoluje się poprzez sekwencyjną dysekcję z jelit cienkich świni guinea Hartley o masie 150-200g (wiek 2-3 tygodnie), które zostały poddane znieczuleniu poprzez inhalację izofluranem i poddane dekapitacji. Po eutanazji jelito cienkie zostaje wycięte, a jego zawartość usunięta poprzez przepłukanie światła ciepłym, natlenionym roztworem. Stosujemy Medium 199 uzupełnione o 25 mM HEPES, 5 mM NaHCO3 oraz 2 mM glutaminy, z pH skorygowanym do 7,4 (zwany odtąd M199-DM), uprzednio ogrzany do 37 °C. Pozostałe kroki protokołu będą jednak przeprowadzane w temperaturze pokojowej.
- Segment jelita o długości 8-10 cm przenosi się do naczynia Sylgard zawierającego M199-DM, rozcina wzdłuż krawędzi krezkowej i mocuje stroną błony śluzowej do góry za pomocą szpilek entomologicznych. Niezmiernie ważne jest utrzymanie równomiernego napięcia, tak aby po przypięciu tkanka miała kształt prostokąta z regularnie wyrównanymi rzędami kosmków błony śluzowej.
- Używając precyzyjnej pęsety Dumont z prostymi końcówkami, w pozycji niemal poziomej, można łatwo oddzielić błonę śluzową, chwytając kosmki na jednym końcu preparatu i pociągając wzdłuż osi podłużnej tkanki. Gdy próbka jest równomiernie przypięta, pasma śluzówki można oddzielić kilkoma pojedynczymi pociągnięciami, odsłaniając podśluzówkę zawierającą zwoje podśluzówkowe i unaczynienie podśluzówkowe.
- Do precyzyjnej dysekcji splotów zalecamy użycie mikroskopu dysekcyjnego z oświetleniem w ciemnym polu. Efekt pseudo-trójwymiarowy tworzony przez ten rodzaj oświetlenia pomaga rozróżnić poszczególne warstwy, zapobiegając lub minimalizując uszkodzenia spowodowane przez narzędzia.
- Aby przygotować preparat podśluzówkowy, stosujemy klasyczną procedurę Hirsta i McKirdy 4, która wymaga: a) wykonania nacięcia w warstwie podśluzówkowej zgodnie z orientacją okrężnych włókien mięśniowych; można to osiągnąć za pomocą bardzo cienkich nożyczek (takich jak Moria MC19 lub ich odpowiednika); b) bardzo delikatnego uniesienia podśluzówki precyzyjną pęsetą, jednocześnie spychając warstwę mięśni okrężnych w dół za pomocą cienkich nożyczek; c) nacinania wzdłuż krawędzi podłużnych w miarę postępów separacji, aby uwolnić podśluzówkę z reszty preparatu; d) wykonania drugiego nacięcia zgodnie z orientacją okrężnych włókien mięśniowych w pewnej odległości od pierwszego, aby zdefiniować ostateczny rozmiar preparatu podśluzówkowego. Otrzymany segment podśluzówkowy, o grubości zaledwie 30 do 50 μm i wyglądzie przypominającym pajęczynę, można przenieść do innego naczynia Sylgard zawierającego świeży M199-DM, delikatnie przypiąć bez naprężania i przechowywać w komorze natlenionej do późniejszego użycia.
- Oryginalny segment jelita, obecnie pozbawiony błony śluzowej i podśluzówki, z odsłoniętym mięśniem okrężnym, może wciąż służyć do uzyskania preparatu splotu mięśniowego. Aby odsłonić splot mięśniowy, należy usunąć jak największą część warstwy mięśni okrężnych. Można to osiągnąć, używając tej samej pęsety z prostymi końcówkami, stosowanej w poprzednich krokach. Pęczki włókien można delikatnie odciągać, najpierw z jednej, a następnie z drugiej strony preparatu. Odsłonięty splot mięśniowy nie może zostać oddzielony od podłużnej warstwy mięśni i leżącej pod nią błony surowiczej. Zatem tym, co nazywa się preparatem splotu mięśniowego, jest segment, który można wyciąć wzdłuż szpilek. Ponieważ zawiera on żywą tkankę mięśniową, zaleca się bardzo luźne przypięcie go w naczyniu z natlenionym M199-DM aż do rozpoczęcia eksperymentu fizjologicznego.
- Ponieważ błona śluzowa jest głównym sensorem ENS, a wszystkie efektory są również osadzone w ścianie jelita, możliwe jest przygotowanie preparatów półintegralnych, które zachowują całe drogi odruchowe. Te preparaty projektowane indywidualnie wymagają kombinacji kroków opisanych w punktach 1.3. do 1.6., zastosowanych do sąsiadujących obszarów izolowanego segmentu jelita.
- Na kilka minut przed właściwym eksperymentem optycznym wybrany preparat mocuje się w komorze eksperymentalnej, dbając o to, aby napięcie było równomiernie rozłożone, a tkanka przylegała całkowicie płasko do dna Sylgard. Osiąga się to poprzez unieruchomienie próbki wieloma bardzo cienkimi szpilkami, które można rozmieścić wokół obwodu bez powodowania uszkodzeń tkanki.
Część 2: Przygotowanie próbek tkanek do rejestracji optycznej
- (Opcjonalnie) Aby zapobiec fluorescencji tła wynikającej z wiązania barwnika z pozostałościami mięśni gładkich i tkanki łącznej, oba wyizolowane sploty można inkubować przez 30-60 min w pożywce M199-DM zawierającej kolagenazę VII (≤50 U/ml) i proteazę IX (≤0.5 μg/ml). Po obróbce enzymatycznej preparaty należy przemyć i przechowywać przez noc w pożywce M199-DM z dodatkiem 10% surowicy zwierzęcej (np. konnej lub bydlęcej) oraz antybiotyków (penicylina, 100U/ml; streptomycyna, 100 μg/ml), w komorze nasyconej 95% O2 i 5% CO2. Procedura ta, którą stosujemy od wielu lat, ponieważ wyraźnie poprawia stosunek sygnału do szumu w rejestracjach optycznych, może nie być pomocna dla osób początkujących i powinna być wdrażana z ostrożnością. W rzeczywistości preparat uszkodzony podczas sekcji narażony jest na dezintegrację w trakcie obróbki enzymatycznej. Niemniej jednak, nawet w przypadku pominięcia obróbki enzymatycznej, zalecamy przechowywanie preparatów przez noc w pożywce M199-DM z surowicą i antybiotykami. Krok ten sprzyja regeneracji tkanki po ostrych uszkodzeniach powstałych podczas sekcji oraz zwiększa przejrzystość próbki.
- Optyczna rejestracja aktywności elektrycznej nie jest możliwa w preparacie, w którym mięsień ulega skurczowi. Dlatego, aby zapobiec skurczom mięśni podczas rejestracji ze splotu krezkowego, na kilka minut przed eksperymentem optycznym dodajemy 2 μM nifedipiny do pożywki M199-DM obmywającej tkankę.
Część 3: Barwienie di-4-ANEPPDHQ
- Di-4-ANEPPDHQ jest dostępny w sprzedaży w formie liofilizowanej. Zalecamy rozpuszczenie go w czystym etanolu w celu przygotowania stężonego roztworu zapasowego [np. 15-20 mg/ml]. Roztwór ten jest niezwykle stabilny przy przechowywaniu w temperaturze -20°C. W naszym laboratorium zużyliśmy właśnie ostatnią kroplę roztworu zapasowego tego barwnika, który został przygotowany niemal 6 lat temu.
- Roztwór barwiący należy przygotować w pożywce M199-DM; jeśli protokół tego wymaga, powinien on zawierać 2 μM nifedypiny. Końcowe stężenie barwnika może wynosić od 5 μg/ml i nie powinno przekraczać 50 μg/ml. Należy jednak pamiętać, że w zależności od stężenia roztworu zapasowego, w roztworze barwiącym znajdzie się określona ilość etanolu. Przykładowo, roztwór barwiący o stężeniu 50 μg/ml barwnika będzie zawierał ~0,3% etanolu, jeśli zostanie przygotowany z roztworu zapasowego 15 mg/ml, ale prawie 1% etanolu, jeśli roztwór zapasowy miał stężenie zaledwie 5 mg/ml.
- W celu barwienia preparat zanurza się na 10-30 minut w roztworze barwnika. Po tym czasie barwnik jest wypłukiwany i zastępowany świeżą, natlenioną pożywką M199-DM. Ponieważ di-4-ANEPPDHQ jest barwnikiem nieprzenikającym przez błony, który fluorescuje tylko w środowisku lipidowym, zdrowe neurony w zabarwionym preparacie jelitowym powinny przypominać puste balony.
Część 4: Stymulacja elektryczna
- Stymulacja może być realizowana za pomocą napięcia lub prądu. Stosujemy stymulację prądową, dostarczaną przez sterowany komputerowo, 4-kanałowy generator impulsów o maksymalnym wyjściu 16 mA na kanał.
- Model elektrody wykorzystywany w danym eksperymencie jest determinowany przez cel doświadczenia. Pipety wewnątrzkomórkowe lub elektrody patch mogą być użyte, gdy celem jest stymulacja konkretnego neuronu. Gdy stymulacja ma na celu aktywację więcej niż jednego neuronu w danym zwoju, można zastosować elektrodę zewnątrzkomórkową stykającą się z tkanką łączną. Do badania powiązanych ze sobą zwojów można wykorzystać duże elektrody o niskiej rezystancji i/lub wieloelementowe macierze elektrod; jednak przy stosowaniu stymulacji prądowej, którą zazwyczaj wykorzystujemy, macierze wieloelementowe stają się jedyną opcją. Wiele modeli elektrod zewnątrzkomórkowych, a także niektóre liniowe macierze elektrod, są łatwo dostępne w sprzedaży komercyjnej.
- Elektrody można pozycjonować za pomocą różnych typów mikromanipulatorów. Aby uniknąć wibracji wywoływanych przez długie i cienkie ramiona, preferujemy stosowanie małych mikromanipulatorów na podstawach magnetycznych, które można umieścić w bezpośrednim sąsiedztwie komory eksperymentalnej, oraz podpieranie elastycznych ramion elektrod wolframowych cienkimi, lecz bardzo sztywnymi prętami metalowymi.
Część 5: Perfuzja
Używamy dwukanałowej pompy perystaltycznej, w której jeden kanał służy do doprowadzania natlenionych roztworów, a drugi do odprowadzania. Aby wyeliminować zakłócenia mechaniczne wywołane perfuzją, pompę wyłącza się podczas akwizycji danych optycznych.
Część 6: Aparatura do wielopunktowej rejestracji optycznej potencjału błonowego
- Komponenty optyczne:
Aparatura do wielopunktowego optycznego zapisu potencjału błonowego składa się z kamery NeuroCCD-SM (RedShirtImaging) oraz soczewki przekaźnikowej / demagnifikatora 1:10 zamontowanego w tubusie trynokularnym mikroskopu odwróconego. Mikroskop porusza się na translatorze X-Y, niezależnie od stolika, który jest sztywno przymocowany do górnej części aktywnego stołu izolującego wibracje. Aby zminimalizować wibracje przenoszone przez powietrze, cała aparatura jest otoczona ciężkimi zasłonami akustycznymi i dachem z mylaru. Oświetlenie epi zapewniane jest przez lampę wolframowo-halogenową o mocy 100W, zasilaną przez stabilizowany sprzężeniem zwrotnym zasilacz o ultra-niskich tętnieniach. Światło padające jest czynione quasi-monochromatycznym za pomocą filtra cieplnego, wysokiej jakości filtru interferencyjnego (HQ530/50) oraz lustra dichroicznego 565 nm (transmitancja 50%). Emisja fluorescencji jest oddzielana za pomocą lustra dichroicznego i filtru długoprzepustowego (HQ572LP). Natężenie światła padającego jest regulowane za pomocą filtrów neutralnych. Oświetlenie przechodzące, służące do obserwacji preparatu w polu jasnym, zapewniane jest przez drugą lampę wolframowo-halogenową o mocy 100 W, zasilaną z zasilacza 0-55 V, 1-10 A, który nie wymaga żadnych specjalnych właściwości.
- Specyfikacja kamery wysokich prędkości:
Konstrukcja elektroniczna i charakterystyka wydajności kamery NeuroCCD-SM zostały opisane szczegółowo 3. W skrócie jest to chłodzona kamera wysokich prędkości o niskiej rozdzielczości i wysokiej precyzji, wykorzystująca chip Marconi CCD39-01 o cienkiej warstwie podłoża i tylnym podświetleniu (80x80 pikseli). Digitalizacja jest 14-bitowa, a pełna częstotliwość klatek wynosi 2 kHz. Jednak w określonych celach można zwiększyć częstotliwość klatek do maksymalnie 10 kHz, stosując różne kombinacje binningu lub zmniejszając liczbę aktywnych pikseli. Kamera posiada istotną zaletę w postaci niezwykle niskiego szumu odczytu (23 elektrony przy 2 kHz; 9 elektronów przy 1 kHz). Ponadto jej piksele mają stosunkowo dużą głębokość studni (215 000 elektronów), co pozwala na stosowanie umiarkowanych natężeń światła przy wysokich częstotliwościach klatek.
- Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych:
Eksperyment optyczny jest kontrolowany przez Neuroplex, pakiet oprogramowania firmy RedShirtImaging, który działa jako aplikacja w ramach platformy IDL (Interactive Data Language) i zawiera liczne funkcje niezbędne do akwizycji, wyświetlania i analizy danych optycznych.
- Dodatkowa kamera:
Jako integralna część aparatury, dzielnik wiązki w głowicy trynokularnej mikroskopu przekazuje obraz preparatu na drugą, wysokorozdzielczą kamerę CCD podłączoną do karty przechwytującej obraz (frame-grabber). Obraz ten, akwizycjonowany i przechowywany za pomocą oprogramowania Global Lab Image/2, może zostać nałożony na wyświetlany obraz sygnałów optycznych o rozdzielczości submilisekundowej zarejestrowanych przez kamerę NeuroCCD-SM, aby wygenerować dokładną mapę przestrzennego pochodzenia optycznie zapisanych sygnałów napięcia. W naszym laboratorium karta przechwytująca dla tej kamery znajduje się w innym komputerze niż ten odpowiedzialny za akwizycję danych funkcjonalnych. W związku z tym plik obrazu musi zostać przeniesiony z jednego komputera na drugi, a przed osiągnięciem idealnej rejestracji obu kamer wymagane są niewielkie korekty rozmiaru i pozycji obrazu wysokiej rozdzielczości.
Część 7: Eksperymenty optyczne
- Przed każdym pomiarem funkcjonalnym uzyskujemy czarno-biały obraz o wysokiej rozdzielczości obszaru, z którego planujemy rejestrować aktywność elektryczną metodami optycznymi (zgodnie z opisem w 6.4). Obraz ten, po nałożeniu na mapę pikseli kamery wysokiej rozdzielczości, pomaga zidentyfikować struktury będące źródłem sygnałów optycznych.
- W odpowiedniej konfiguracji systemu Neuroplex (patrz 6.3) steruje również migawką i wyzwala stymulację elektryczną. Ponieważ szybka akwizycja danych wymaga znacznej mocy obliczeniowej, zaleca się, jeśli to możliwe, użycie dedykowanego komputera z dużą ilością pamięci i wydajnym dyskiem twardym. Nie jest to jednak zadanie trywialne. Nasz własny system, np. kilka lat temu, wykorzystywał karty akwizycji danych zbyt duże, aby zmieścić się w nowoczesnych komputerach. Jako kompromis zaadaptowaliśmy i przeznaczyliśmy dla naszego systemu optycznego komputer DELL Precision 390 wyposażony w dysk twardy 500 GB i 4 GB pamięci RAM. Komputer ten pozwolił nam zachować starsze, ale odpowiednie karty A/D i D/A, zapewniając jednocześnie wystarczającą moc do przeprowadzenia eksperymentów.
- Natychmiast po zakończeniu akwizycji Neuroplex może wyświetlić wyniki w kilku komplementarnych formatach, z których niektóre opisano poniżej:
- Obszar ekranu nazwany widokiem strony (page display) pokazuje surowy obraz preparatu przechwycony przez kamerę wysokiej rozdzielczości 80X80 jako pojedyncza klatka. Nałożenie na tę mapę pikseli obrazu o wysokiej rozdzielczości uzyskanego drugą kamerą (jak wyjaśniono w 6.4 i 7.1) usprawnia możliwość identyfikacji obszarów zainteresowania przez operatora.
- Gdy piksele tego widoku strony zostaną wybrane za pomocą myszy, Neuroplex automatycznie konwertuje ich sygnały optyczne na przebiegi wykazujące wielkość zmiany optycznej zarejestrowanej przez te piksele w funkcji czasu (np. ΔF/F w funkcji czasu). Operator może zdecydować, czy przebiegi te mają odzwierciedlać sygnał z poszczególnych pikseli, czy raczej średnią przestrzenną sygnałów z wielu punktów w określonym obszarze preparatu.
- Dane mogą być również wyświetlane w formacie wideo.
Aby jednak zapewnić pełną ekstrakcję wszystkich informacji zawartych w poszczególnych seriach eksperymentalnych, preferujemy analizę danych optycznych w trybie off-line. Dostępne są reprezentatywne wyniki takiej analizy.
Część 8: Jak osiągnąć wysoką jakość techniczną w eksperymencie optycznym
Techniczny sukces eksperymentu optycznego mierzy się w ostateczności stosunkiem sygnału do szumu w rejestracjach. Co więcej, wysoki stosunek sygnału do szumu nie jest wynikiem nagłego olśnienia, lecz całego procesu. Podobnie jak w przedstawieniu operowym, końcowy efekt zależy od wielu czynników, które oddziałują na siebie synergicznie. Dlatego, aby przeprowadzić poprawny technicznie eksperyment optyczny, niezbędne jest niezależne dopracowanie aparatury optycznej oraz umiejętności wymaganych na każdym poszczególnym etapie protokołu. Poniżej znajduje się lista potencjalnych obszarów problematycznych oraz sugestie dotyczące unikania trudności, których nie zawsze można przewidzieć 5:
- Źródła szumów
Stabilność mechaniczna i optyczna ma kluczowe znaczenie podczas rejestracji aktywności elektrycznej za pomocą barwników napięciowo-czułych, ponieważ względna zmiana (ΔF/F) odzwierciedlająca odpowiedzi fizjologiczne jest stosunkowo mała (< 10% / 100 mV w większości pomiarów jelitowych), a zaszumiony zapis zawsze zwiastuje niepowodzenie. Dlatego w celu optymalizacji stosunku sygnału do szumu konieczne jest wyeliminowanie lub przynajmniej zminimalizowanie wpływu dwóch głównych czynników: a) wibracji mechanicznych oraz b) fluktuacji źródła światła.
- Wibracje mechaniczne są generowane przez szereg różnorodnych źródeł, takich jak konfiguracja zestawu, stabilność budynku, bliskość urządzeń z silnikami, prądy powietrza, hałas akustyczny, ruch cieczy lub cząstki unoszące się w roztworze kąpielowym. Dobry system izolacji drgań, a w skrajnych przypadkach zasłony akustyczne (patrz np. opis w 5.1), znacząco poprawiają sytuację i są warte swojej ceny. Ponadto dość skuteczne są podejścia oparte na zdrowym rozsądku, takie jak filtrowanie roztworów stosowanych w eksperymencie lub stosowanie podstaw magnetycznych dla małych, ruchomych części zestawu.
- Źródła światła są najstabilniejsze przy intensywności bliskiej maksymalnej. Należy zatem ustawić limit prądu dla zasilacza i w razie potrzeby zmniejszać intensywność światła poprzez wstawianie filtrów neutralnych w torze optycznym, zamiast obniżać napięcie. Lampy łukowe są z natury zaszumione. Żarówki wolframowo-halogenowe lub diody emitujące światło są znacznie stabilniejsze i powinny być preferowanym wyborem 6.
- Wiek zwierzęcia
Disekcje należy przeprowadzać na jelitach młodych zwierząt, ponieważ wraz z wiekiem tkanka łączna w obrębie jelit twardnieje, co utrudnia oddzielenie poszczególnych warstw tkanki bez wyrządzenia poważnych szkód neuronom dwóch splotów, których wypustki aferentne i eferentne mogą przekraczać granice warstw i/lub przebiegać na znacznym dystansie wzdłuż osi podłużnej jelita. Zalecenie to, które można pominąć przy badaniu połączeń wewnątrz zwojowych, ma kluczowe znaczenie, gdy celem eksperymentu jest analiza obwodów międzyzwojowych lub aktywacja dróg odruchowych.
- Internalizacja barwnika
Ważne jest stosowanie jak najniższego stężenia barwnika oraz minimalizowanie niepotrzebnej ekspozycji na światło. Chociaż wykazano, że di-4-ANEPPDHQ jest znacznie mniej fototoksyczny niż inne barwniki, z czasem zostanie on zinternalizowany w miarę pogarszania się stanu preparatu. Internalizacja barwnika obniża stosunek sygnału do szumu poprzez gwałtowny wzrost fluorescencji tła 3.
- Konserwacja elektrod
- Elektrody należy starannie i dokładnie myć po każdym eksperymencie. Osady organiczne na końcówkach elektrod wolframowych zwiększają ich rezystancję i uniemożliwiają stymulację.
- Izolacja dostępnych komercyjnie elektrod wolframowych jest bardzo delikatna i podatna na uszkodzenia. Nieszczelność izolacji spowoduje upływ prądu, obniży skuteczność stymulacji i zagrozi powodzeniu eksperymentu.
- Zagrożenia przy perfuzji
Nigdy nie należy zostawiać zestawu bez nadzoru podczas włączonej perfuzji. Jeśli dopływ i odpływ pompy perystaltycznej nie są odpowiednio zrównoważone, mogą wystąpić dwa katastroficzne zdarzenia:
- Zalanie, które może spowodować nieodwracalne uszkodzenie mikroskopu.
- Wyschnięcie preparatu podczas eksperymentu.
- Problemy z oprogramowaniem
Niezbędne jest zapoznanie się z oprogramowaniem sterującym zarówno akwizycją, jak i analizą. Szybka akwizycja danych i/lub tworzenie bardzo dużych plików mają tendencję do doprowadzania systemu na skraj awarii; program Neuroplex, który jest dość nieprzewidywalny, będzie regularnie ulegać awarii, jeśli nie zostaną zachowane jego warunki brzegowe. Niuanse w zapisach, łatwo pomijane, gdy analiza ogranicza się do niewielkich obszarów zainteresowania, często ujawniają się podczas wyświetlania danych w formie filmu.