Pomiar współczynników dyfuzji poprzez odzysk fluorescencji dwufotonowej po fotowybielaniu

Podsumowanie

W tym artykule opiszemy procedurę pomiaru współczynników dyfuzji za pomocą odzyskiwania fluorescencji wielofotonowej po fotowybielaniu. Zaczniemy od wyrównania lasera wzdłuż ścieżki optycznej do próbki i określenia odpowiednich parametrów eksperymentalnych, a następnie będziemy kontynuować generowanie i ostateczne dopasowanie krzywych odzysku fluorescencji.

Streszczenie

Odzysk multifluorescencji po fotowybielaniu jest techniką mikroskopową stosowaną do pomiaru współczynnika dyfuzji (lub analogicznych parametrów transportu) makrocząsteczek i może być stosowana zarówno w systemach biologicznych in vitro, jak i in vivo. Odzyskiwanie multifluorescencji po fotowybielaniu odbywa się poprzez fotowybielanie obszaru zainteresowania w próbce fluorescencyjnej za pomocą intensywnego błysku laserowego, a następnie tłumienie wiązki i monitorowanie fluorescencji, gdy wciąż fluorescencyjne cząsteczki spoza obszaru zainteresowania dyfundują w celu zastąpienia fotobielonych cząsteczek. Naszą demonstrację rozpoczniemy od wyrównania wiązki laserowej przez komórkę Pockelsa (modulator laserowy) i wzdłuż ścieżki optycznej przez skrzynkę skanowania laserowego i soczewkę obiektywu do próbki. Dla uproszczenia użyjemy próbki wodnego barwnika fluorescencyjnego. Następnie określimy odpowiednie parametry eksperymentalne dla naszej próbki, w tym moc monitorowania i wybielania, czas trwania wybielania, szerokości pojemnika (do zliczania fotonów) i czas odzyskiwania fluorescencji. Następnie opiszemy procedurę obliczania krzywych odzyskiwania, proces, który można w dużej mierze zautomatyzować za pomocą LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) w celu zwiększenia przepustowości. Wreszcie, współczynnik dyfuzji jest określany poprzez dopasowanie danych odzyskiwania do odpowiedniego modelu matematycznego za pomocą algorytmu dopasowania najmniejszych kwadratów, łatwo programowalnych za pomocą oprogramowania takiego jak MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

Protokół

1. Wyrównaj optykę.

Kluczowe wyposażenie eksperymentu MP-FRAP to: źródło laserowe z blokadą trybu, komórka Pockelsa (do modulacji wiązki), generator impulsów, dichroiczny, soczewka obiektywowa, filtr emisji fluorescencji, bramkowana lampa fotopowielacza oraz system rejestracji danych (licznik fotonów i skaler wielokanałowy).

2. Określ bezpieczne moce monitora.

1. Osłabij laser do niskiej, ale rozsądnej mocy do generowania fluorescencji w próbce.
2. Skoncentruj się na próbce.
3. Ustaw licznik fotonów tak, aby całkował w skali czasu znacznie dłuższej niż oczekiwana regeneracja fluorescencji. Gdy objętość ogniskowej jest nieruchoma w próbce (w naszym oprogramowaniu mikroskopowym uzyskuje się to za pomocą skanowania punktowego), zapisz rozsądną liczbę danych dotyczących liczby fotonów.
4. Zwiększ moc i weź kolejną serię danych o liczbie fotonów. Powtarzaj tę czynność, aż wzrost liczby fotonów wydaje się znacznie zmniejszać w stosunku do wzrostu mocy.
5. Wykres log (liczba fotonów) jako funkcja logarytmu (potęga). Odchylenie od nachylenia wynoszącego dwa wskazuje na bielenie podczas monitorowania. Wybierz moc monitora poniżej tego odcięcia, ale która pozwala na rozsądny stosunek sygnału do szumu.

3. Określ parametry wejściowe do generatora impulsów i skalera wielokanałowego.

1. Określ oszacowania współczynnika dyfuzji i czasu powrotu na odwrocie koperty na podstawie literatury i/lub równania Stokesa-Einsteina i równania dyfuzji.
2. Ustaw niezbędne wartości parametrów w generatorze impulsów i skalerze.
   1. W generatorze impulsów ustaw czas wybielania wstępnego i wybielania. Dobrym zestawem praktycznych zasad jest to, że wybielacz wstępny powinien być 1-2 razy dłuższy niż oczekiwany czas regeneracji, a czas wybielania powinien wynosić jedną dziesiątą oczekiwanego czasu regeneracji.
   2. Na skalarce ustaw szerokość pojemnika na około połowę czasu trwania wybielania i ustaw liczbę pojemników na rekord tak, aby iloczyn wybranej szerokości pojemnika i pojemników na rekord był większy lub w przybliżeniu równy oczekiwanemu pełnemu odzyskowi plus czasy wybielania i wybielania.
   3. Wróć do generatora impulsów i ustaw częstotliwość sekwencji wybielania wstępnego/wybielacza/monitora na wartość nieco mniejszą niż odwrotność iloczynu szerokości pojemnika pomnożonego przez liczbę pojemników na rekord. *
   4. Na koniec ustaw liczbę nagrań/skanów na skalerze w oparciu o intensywność sygnału przy wybranej mocy monitora.
      
      *Bardzo ważne jest, aby czas na pełną sekwencję wstępnego wybielania/wybielania/monitorowania (1/częstotliwość) ustawioną w generatorze impulsów był dłuższy niż czas zbierania danych (szerokość pojemnika x pojemniki/rekord) ustawiony na skalerze. Jeśli to kryterium nie zostanie spełnione, w jednym rekordzie na skalarce może pojawić się wiele wyzwalaczy wybielacza.
3. Ustaw moc monitora na akceptowalny poziom, określony wcześniej. Ustaw moc wybielacza na około 200 mW powyżej wartości granicznej wybielania określonej podczas testu wybielania monitora. Obie te moce są ustawione jako różne napięcia na kwarcu PC.
4. Uszczelnij mikroskop, wyłącz światła, włącz PMT, rozpocznij skanowanie punktowe w oprogramowaniu mikroskopu, a następnie uruchom generator impulsów i skaler.
5. Przeanalizuj wynikową krzywą odzysku, wykreślając krzywą i zaznaczając trzy ważne punkty: 1) fluorescencję przed wybielaniem, 2) fluorescencję bezpośrednio po wybielaniu i 3) fluorescencję na końcu zestawu danych. Użyj wartości fluorescencji przed i bezpośrednio po wybielaniu, aby lepiej oszacować czas połowicznej regeneracji.
6. Mając na uwadze oszacowanie czasu połowicznego odzyskiwania, należy zastosować podstawowe zasady opisane wcześniej, aby określić nowe wartości czasu trwania przed wybielaniem, wybielania i szerokości pojemnika. Należy również użyć fluorescencji przed wybielaniem i fluorescencji na końcu zestawu danych, aby lepiej oszacować czas wymagany do osiągnięcia pełnego wyzdrowienia. Z reguły dane powinny być gromadzone przez okres, który pozwala na zgłoszenie pełnego odzyskania danych w odniesieniu do drugiej połowy danych.
7. Dostosuj parametry w generatorze impulsów i skalerze, weź nową krzywą i kontynuuj dostosowywanie parametrów, aż krzywa wykaże silne wybielenie i płynną regenerację. Należy pamiętać, że czas trwania wybielania może i powinien zostać skrócony poniżej reguły, jeśli to możliwe. Moc wybielacza można również dostosować, jeśli wybielacz jest zbyt płytki lub zbyt głęboki.

4. Test na nasycenie wzbudzeniem.

1. Korzystając z odpowiednich mocy monitora i wybielacza, określonych wcześniej, wykonaj serię krzywych MP-FRAP. Przeanalizuj każde odzysk, znormalizowane do fluorescencji przed wybielaniem, używając odpowiedniej formy matematycznej i nieliniowego algorytmu dopasowania najmniejszych kwadratów (patrz "Analiza danych" poniżej). Zapisz dopasowaną wartość parametru głębokości wybielania.
2. Kontynuuj wykonywanie i analizowanie kolejnych serii krzywych MP-FRAP przy rosnących wartościach mocy wybielania.
3. Wykreśl log (parametr głębokości wybielania) jako funkcję log(power). Każde odchylenie od nachylenia dwóch wskazuje na nasycenie wzbudzenia. Wybierz moc wybielacza, która daje silny wybielacz, ale nie powoduje nasycenia.

5. Kontynuuj wykonywanie krzywych MP-FRAP.

1. Kontynuuj wykonywanie krzywych, jak powyżej, czy wszystkie parametry zostaną prawidłowo ustawione.

6. Analiza danych.

1. Usuń dane dotyczące wybielania i wybielania ze zbioru danych fluorescencji i dostosuj dane dotyczące czasu tak, aby t = 0 odpowiadało wartości fluorescencji bezpośrednio po wybielaniu.
2. Znormalizuj wynikowy odzysk fluorescencji w odniesieniu do średniej fluorescencji przed wybielaniem.
3. Dopasuj znormalizowaną krzywą przy użyciu odpowiedniego modelu matematycznego i nieliniowego algorytmu dopasowania metodą najmniejszych kwadratów, takiego jak funkcja lsqcurvefit w programie MATLAB. Przedstawiony tutaj model uwzględnia odzysk fluorescencji, na który wpływa zarówno dyfuzja, jak i przepływ konwekcyjny:
   
   gdzie F_o to średnia fluorescencja przed wybielaniem, β to parametr głębokości wybielania, τ_D to charakterystyczny czas powrotu dyfuzyjnego, R to stosunek kwadratu szerokości osiowej (w_z) do radialnej (w_r) objętości ogniskowej dwufotonowej, τ_vx = w_r/v_x, τ_vy = w_r/v_y, τ_vz = w_z/v_z, a v² = v_x² _{+ v} y ² + v_z² to prędkość przepływu konwekcyjnego. W przypadku przepływu ograniczonego do płaszczyzny obrazowania, τ_vz → ∞ i 1/ τ_vx + 1/ τ_vy można zastąpić 1/ τ_vr. W przypadku braku przepływu konwekcyjnego obie wykładniki w liczniku przechodzą do 1, a wyrażenie jest znacznie zredukowane do tylko dwóch pasujących parametrów, β i τ_D. Współczynnik dyfuzji można łatwo obliczyć jako D = w_r²/8τ_D.

7. Reprezentatywne wyniki.

Rysunek 1. Reprezentatywna krzywa wybielania i regeneracji dla FITC-BSA. Dobra krzywa regeneracji wykazuje silne wybielenie i płynną regenerację, przy czym fluorescencja przy pełnym wyzdrowieniu jest zgłaszana dla drugiej połowy danych.

Rysunek 2. Znormalizowana krzywa odzysku dla FITC-BSA (czerwona) i związane z nią dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów (). To dopasowanie daje współczynnik dyfuzji 52,9 um2/s, zgodny z literaturą.

Dyskusja

Moc odzyskiwania fluorescencji wielofotonowej po fotowybielaniu polega na zdolności do sondowania grubych próbek z rozdzielczością 3D. Od czasu swojego opracowania w latach 90-tych, MP-FRAP jest używany do określania współczynnika dyfuzji (lub analogicznych parametrów transportu) w ciałach komórkowych, grubych warstwach tkanek ex vivo oraz in vivo tkankach i śródmiąższach. W artykule przedstawiliśmy sprzęt niezbędny do przeprowadzenia eksperymentu MP-FRAP, a także właściwą procedurę wyrównywania ścieżki...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ti: szafirowy laser	Newport Corp.	Mai Tai
Pockels Cell	Conoptics	350-80
Laserowy mikroskop skaningowy	Olympus Corporation	Fluoview
Krótkoprzepustowe zwierciadło dichroiczne	Chroma Technology Corp.	670 DCSX-2P
Lampa fotopowielacza	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Licznik fotonów	Stanford Research Systems	SR 400
Wielokanałowy skaler/średniak	Stanford Research Systems	SR 430
Generator impulsów	Stanford Research Systems	DG 535
FITC-BSA	Invitrogen	--