Pomiar współczynników dyfuzji za pomocą dwufotonowej regeneracji fluorescencji po fotobieleniu

Podsumowanie

W niniejszym artykule opiszemy procedurę pomiaru współczynników dyfuzji z wykorzystaniem wielofotonowego odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu. Rozpoczniemy od ustawienia lasera wzdłuż drogi optycznej do próbki i określenia odpowiednich parametrów eksperymentalnych, a następnie przejdziemy do generowania i wreszcie dopasowywania krzywych odzyskiwania fluorescencji.

Streszczenie

Wielokrotna regeneracja fluorescencji po fotoblaknięciu (multi-fluorescence recovery after photobleaching) to technika mikroskopowa stosowana do pomiaru współczynnika dyfuzji (lub analogicznych parametrów transportu) makromolekuł, która może być zastosowana zarówno doin vitroiin vivosystemy biologiczne. Wielopunktowy pomiar powrotu fluorescencji po fotowybielaniu (multi-fluorescence recovery after photobleaching) przeprowadza się poprzez fotowybielanie obszaru zainteresowania w fluorescencyjnej próbce za pomocą intensywnego błysku lasera, a następnie osłabienie wiązki i monitorowanie fluorescencji w miarę gdy wciąż fluorescencyjne cząsteczki z obszarów spoza wybranego regionu dyfundują do niego, zastępując cząsteczki fotowybielone. Demonstrację rozpoczniemy od ustawienia wiązki lasera poprzez ogniwo Pockelsa (modulator laserowy) oraz wzdłuż drogi optycznej przez moduł skanowania laserowego i obiektyw do próbki. Dla uproszczenia zastosujemy próbkę wodnego barwnika fluorescencyjnego. Następnie określimy odpowiednie parametry eksperymentalne dla naszej próbki, w tym moc monitorowania i wybielania, czas wybielania, szerokość przedziałów (bin widths) dla zliczania fotonów oraz czas powrotu fluorescencji. W dalszej części opiszemy procedurę pozyskiwania krzywych powrotu, proces ten może zostać w znacznym stopniu zautomatyzowany za pomocą systemu LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) w celu zwiększenia przepustowości. Na koniec współczynnik dyfuzji zostanie wyznaczony poprzez dopasowanie danych o powrocie fluorescencji do odpowiedniego modelu matematycznego przy użyciu algorytmu dopasowania metodą najmniejszych kwadratów, który można łatwo zaprogramować w oprogramowaniu takim jak MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

Protokół

1. Ustaw optykę.

Kluczowy sprzęt do eksperymentu MP-FRAP obejmuje: laser z blokadą modów, ogniwo Pockelsa (do modulacji wiązki), generator impulsów, lustro dichroiczne, obiektyw, filtr emisji fluorescencji, bramkowaną lampę fotopowielaczową oraz system rejestracji danych (licznik fotonów i skaler wielokanałowy).

2. Wyznaczenie bezpiecznych mocy monitorowania.

1. Zredukuj moc lasera do niskiego, ale odpowiedniego poziomu, pozwalającego na generowanie fluorescencji w próbce.
2. Ustaw ostrość wewnątrz próbki.
3. Ustaw licznik fotonów tak, aby całkowanie odbywało się w skali czasowej znacznie dłuższej niż przewidywany czas powrotu fluorescencji. Przy nieruchomej objętości ogniskowania wewnątrz próbki (w oprogramowaniu naszego mikroskopu osiąga się to za pomocą skanowania punktowego), zarejestruj odpowiednią liczbę danych z zliczeń fotonów.
4. Zwiększ moc i pobierz kolejną serię danych z zliczeń fotonów. Powtarzaj tę czynność, aż przyrost liczby zliczonych fotonów zacznie znacząco maleć w stosunku do wzrostu mocy.
5. Wykreśl log(liczba zliczeń fotonów) jako funkcję log(moc). Odchylenie od nachylenia równego dwa wskazuje na występowanie fotowyblakania podczas monitorowania. Jako moc monitorowania wybierz taką wartość, która znajduje się poniżej tego punktu odcięcia, ale zapewnia odpowiedni stosunek sygnału do szumu.

3. Określenie parametrów wejściowych dla generatora impulsów i skalera wielokanałowego.

1. Wyznacz szacunkowe wartości współczynnika dyfuzji oraz czasu regeneracji w oparciu o literaturę i/lub równanie Stokesa-Einsteina oraz równanie dyfuzji.
2. Ustaw niezbędne wartości parametrów w generatorze impulsów i skalerze.
   1. W generatorze impulsów ustaw czasy wstępnego wybielania (pre-bleach) i wybielania (bleach). Dobrą zasadą jest, aby czas wstępnego wybielania był 1-2 krotnie dłuższy niż przewidywany połowiczny czas regeneracji, a czas wybielania stanowił jedną dziesiątą przewidywanego połowicznego czasu regeneracji.
   2. W skalerze ustaw szerokość kosza (bin width) na około połowę czasu trwania wybielania oraz ustaw liczbę koszy na zapis (bins per record) w taki sposób, aby iloczyn wybranej szerokości kosza i liczby koszy na zapis był większy lub w przybliżeniu równy przewidywanemu całkowitemu czasowi regeneracji powiększonemu o czasy wstępnego wybielania i wybielania.
   3. Wróć do generatora impulsów i ustaw częstotliwość sekwencji wstępne wybielanie/wybielanie/monitorowanie na wartość nieco mniejszą od odwrotności iloczynu szerokości kosza i liczby koszy na zapis. *
   4. Na koniec ustaw w skalerze liczbę zapisów/skanów (records/scan) w zależności od natężenia sygnału przy wybranej mocy monitorowania.
      
      *Bardzo ważne jest, aby czas pełnej sekwencji wstępne wybielanie/wybielanie/monitorowanie (1/częstotliwość) ustawiony w generatorze impulsów był większy niż czas zbierania danych (szerokość kosza x liczba koszy/zapis) ustawiony w skalerze. Jeśli to kryterium nie zostanie spełnione, w jednym zapisie w skalerze mogą pojawić się wielokrotne wyzwalacze wybielania.
3. Ustaw moc monitorowania na wcześniej określonym, akceptowalnym poziomie. Ustaw moc wybielania na około 200 mW powyżej progu wybielania określonego podczas testu wybielania monitorującego. Obie te moce ustawia się jako różne napięcia przyłożone do kryształu PC.
4. Uszczelnij mikroskop, wyłącz światła, włącz PMT, rozpocznij skanowanie punktowe w oprogramowaniu mikroskopu, a następnie uruchom generator impulsów i skaler.
5. Przeanalizuj otrzymaną krzywą regeneracji, wykreślając ją i zaznaczając trzy istotne punkty: 1) fluorescencję przed wybielaniem, 2) fluorescencję bezpośrednio po wybielaniu oraz 3) fluorescencję na końcu zestawu danych. Wykorzystaj wartości fluorescencji przed i bezpośrednio po wybielaniu, aby dokładniej oszacować połowiczny czas regeneracji.
6. Mając tę szacunkową wartość połowicznego czasu regeneracji, zastosuj opisane wcześniej zasady, aby wyznaczyć nowe wartości dla czasów wstępnego wybielania, wybielania i szerokości kosza. Ponadto wykorzystaj fluorescencję przed wybielaniem oraz fluorescencję na końcu zestawu danych, aby dokładniej oszacować czas potrzebny do osiągnięcia pełnej regeneracji. Przyjmuje się, że dane powinny być zbierane przez okres czasu pozwalający na odnotowanie pełnej regeneracji w drugiej połowie zestawu danych.
7. Skoryguj parametry w generatorze impulsów i skalerze, wykonaj nowy pomiar krzywej i kontynuuj optymalizację parametrów, dopóki krzywa nie wykaże wyraźnego wybielenia i płynnej regeneracji. Należy pamiętać, że czas trwania wybielania można i należy skrócić poniżej wartości zalecanej przez ogólną zasadę, jeśli jest to możliwe. Można również dostosować moc wybielania, jeśli uzyskane wybielenie jest zbyt płytkie lub zbyt głębokie.

4. Test nasycenia wzbudzenia.

1. Wykorzystując odpowiednią moc monitorowania i wybielania, określoną we wcześniejszym etapie, zarejestruj serię krzywych MP-FRAP. Przeanalizuj każdy proces powrotu, znormalizowany do fluorescencji sprzed wybielania, stosując odpowiednią formę matematyczną oraz algorytm dopasowania nieliniowego najmniejszych kwadratów (patrz „Analiza danych” poniżej). Zapisz dopasowaną wartość parametru głębokości wybielania.
2. Kontynuuj rejestrowanie i analizowanie kolejnych serii krzywych MP-FRAP przy zwiększających się wartościach mocy wybielania.
3. Wykreśl log(parametr głębokości wybielania) jako funkcję log(mocy). Wszelkie odchylenie od nachylenia wynoszącego dwa wskazuje na nasycenie wzbudzenia. Wybierz taką moc wybielania, która zapewni silne wybielenie, ale nie spowoduje nasycenia.

5. Kontynuuj pomiary krzywych MP-FRAP.

1. Kontynuuj rejestrację krzywych, zgodnie z powyższym, przy prawidłowo ustawionych wszystkich parametrach.

6. Analiza danych.

1. Usuń dane sprzed wybielania oraz dane z momentu wybielania ze zbioru danych fluorescencji i dostosuj dane czasowe tak, aby t = 0 odpowiadało wartości fluorescencji bezpośrednio po wybielaniu.
2. Znormalizuj wynikową rekuperację fluorescencji względem średniej fluorescencji sprzed wybielania.
3. Dopasuj znormalizowaną krzywą, korzystając z odpowiedniego modelu matematycznego i nieliniowego algorytmu dopasowania metodą najmniejszych kwadratów, takiego jak funkcja lsqcurvefit w programie MATLAB. Model przedstawiony tutaj uwzględnia rekuperację fluorescencji pod wpływem dyfuzji i przepływu konwekcyjnego:
   
   gdzie F_o to średnia fluorescencja sprzed wybielania, β to parametr głębokości wybielania, τ_D to charakterystyczny czas rekuperacji dyfuzyjnej, R to stosunek kwadratu szerokości osiowej (w_z) do radialnej (w_r) objętości ogniskowej dwufotonowej, τ_vx = w_r/v_x, τ_vy = w_r/v_y, τ_vz = w_z/v_z, a v² = v_x² + v_y² + v_z² to prędkość przepływu konwekcyjnego. W przypadku przepływu ograniczonego do płaszczyzny obrazowania, τ_vz → ∞, a wyrażenie 1/ τ_vx + 1/ τ_vy można zastąpić przez 1/ τ_vr. W przypadku braku przepływu konwekcyjnego obie funkcje wykładnicze w liczniku dążą do 1, a wyrażenie zostaje znacznie uproszczone do zaledwie dwóch parametrów dopasowania: β oraz τ_D. Współczynnik dyfuzji można łatwo obliczyć według wzoru D = w_r²/8τ_D.

7. Reprezentatywne wyniki.

Rysunek 1. Reprezentatywna krzywa wybielania i regeneracji dla FITC-BSA. Dobra krzywa regeneracji wykazuje silne wybielanie i łagodne odzyskiwanie sygnału, przy czym fluorescencję przy pełnej regeneracji określa się na podstawie drugiej połowy danych.

Rycina 2. Znormalizowana krzywa powrotu dla FITC-BSA (czerwona) oraz powiązane dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów (czarna). Dopasowanie to daje współczynnik dyfuzji wynoszący 52.9 um2/s, co jest zgodne z literaturą.

Dyskusja

Potencjał wielofotonowej regeneracji fluorescencji po fotobleachingu (MP-FRAP) tkwi w możliwości badania grubych próbek z rozdzielczością 3D. Od czasu opracowania tej metody w latach 90. XX wieku, MP-FRAP jest wykorzystywana do wyznaczania współczynnika dyfuzji (lub analogicznych parametrów transportu) w ciałach komórkowych, grubych przekrojach tkanek ex vivo oraz w tkankach i przestrzeniach śródmiąższowych in vivo. W niniejszym artykule przedstawiliśmy sprzęt niezbędny do przeprowadzenia eksperymentu M...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Laser Ti:szafir	Newport Corp.	Mai Tai
Ogniwo Pockelsa	Conoptics	350-80
Skaningowy mikroskop laserowy	Olympus Corporation	Fluoview
Dychroiczne lustro krótkoprzepustowe	Chroma Technology Corp.	670 DCSX-2P
Fotopowielacz	Hamamatsu Corp.	HC125-02
Licznik fotonów	Stanford Research Systems	SR 400
Wielokanałowy skaler/uśredniacz	Stanford Research Systems	SR 430
Generator impulsów	Stanford Research Systems	DG 535
FITC-BSA	Invitrogen	--