$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
A. Mikrofabrykacja 3-warstwowego urządzenia do peryfuzji mikroprzepływowej
Protokół główny studni dennej (studnie o głębokości 150 μm)
- W razie potrzeby wyczyść wafel za pomocą żyletki. Czyścić acetonem, metanolem i IPA. Wykonuj obróbkę plazmową o mocy 50 watów przez 30 s.
- Wirowanie SU8-100 @ 2000 obr./min. [Krok 1: 500 obr./min, 10 s, 100 obr./min, Krok 2: 2000 obr./min, 30 s, 300 obr./s].
[UWAGA: nie trzymaj wafla pęsetą po zawirowaniu SU8]
- Wafelek pieczemy na miękko w temperaturze 65°C przez 20 minut, a w temperaturze 95°C przez 50 minut.
- Wafel jest wystawiany na działanie światła UV przez pożądaną maskę. Dawka dla wysokości 150 μm wynosi 650 mJ/cm2.
- Po naświetleniu wypiekać wafel w temperaturze 65 °C przez 1 minutę i w temperaturze 95 °C przez 12 minut.
- Rozwijaj wafel w wywoływaczu SU8 przez 15 minut.
Główny protokół mikrokanałowy (studnie o głębokości 500 μm)
- W razie potrzeby wyczyść wafel za pomocą żyletki. Czyścić acetonem, metanolem i IPA. Wykonuj obróbkę plazmową o mocy 50 watów przez 30 s.
- Wirować SU8-2150 @ 1000 obr./min. [Krok 1: 500 obr./min, 10 s, 100 obr./s, Krok 2: 1000 obr./min, 30 s, 300 obr./s].
- Wafelek pieczemy na miękko w temperaturze 65°C przez 15 minut i w temperaturze 95°C przez 2 godziny i 30 minut.
- Wafel jest wystawiany na działanie światła UV przez pożądaną maskę. Dawka ekspozycji dla wysokości 650 μm wynosi 685 mJ/cm2.
- Po naświetleniu piecz wafel w temperaturze 65 °C przez 5 minut i w temperaturze 95 °C przez 35 minut.
- Rozwijaj wafel w wywoływaczu SU8 przez 20-30 min.
Przygotowanie roztworu PDMS
- Roztwór polidimetylosiloksanu (PDMS) przygotowuje się przez dokładne wymieszanie 10 części elastomeru silikonowego z 1 częścią utwardzacza standardowego zestawu Sylgard 184.
- Pęcherzyki powstające w roztworze PDMS podczas procesu mieszania są usuwane za pomocą eksykatora próżniowego.
- Pozbawiony pęcherzyków powietrza roztwór PDMS jest powoli dozowany do wzorców SU8 i pustej szalki Petriego dla trzeciej warstwy.
- Temperatura płyty grzejnej jest ustawiona na 75 °C i PDMS jest utwardzany w tej temperaturze przez 2 godziny
- Wloty, wyloty i studzienki wymienne są wykrawane za pomocą dziurkacza o odpowiednim rozmiarze.
- Warstwy są łączone ze sobą na szkiełku podstawowym (rozmiar 0,1 mm) za pomocą ręcznego urządzenia plazmowego.
B. Konfiguracja eksperymentalna
- Przepuść 70% etanolu przez mikrourządzenie w celu sterylizacji. Przepłyń wodę DI, aby wypłukać etanol. Przepuścić 50 ml 0,5% BSA przez urządzenie, aby zapobiec niespecyficznej adsorpcji insuliny do ścianek mikrokanałów.
- Gradient rampy glukozy i inne powiązane gradienty generowane przez oprogramowanie LabView, które komunikuje się z pompami strzykawkowymi, są testowane, aby upewnić się, że gradienty są stabilne.
- 25-30 mysich wysepek inkubowano z 5 μM Fura-2/AM (wskaźnik wapnia, sondy molekularne, CA) i 2,5 μM rodaminy 123 (Rh123, wskaźnik potencjału mitochondrialnego, Sigma, MO) przez 30 minut w temperaturze 37 °C w buforze Krebsa-Ringera (KRB) zawierającym 2 mM glukozy
- Mysie wyspy trzustkowe są ostrożnie pipetowane do urządzenia peryfuzyjnego mikroprzepływowego przez port wlotowy.
- Sieć mikroprzepływowa jest następnie konfigurowana poprzez podłączenie wlotu do pomp strzykawkowych za pomocą rurki Tygon i łącznika Y, a wylotu do kolektora frakcji. Urządzenie znajduje się na etapie ogrzewania (37 °C) na mikroskopie, a rurka doprowadzająca jest podgrzewana na płycie grzejnej, aby utrzymać temperaturę komory i roztworu na poziomie 37 °C.
- Natychmiast po ustawieniu wysepki myszy są peryfuzjowane KRB zawierającym 2 mM glukozy przez 10 minut, a następnie rampą glukozy (2mM 25mM) przez 25 minut.
- Obrazy poklatkowe są zbierane i analizowane co 15 sekund przez oprogramowanie SimplePCI. Peryfuzat jest również zbierany co minutę za pomocą kolektora frakcji w celu analizy wydzielania insuliny za pomocą zestawu ELISA.
Reprezentatywne wyniki
Mysie wysepki były pokryte liniowym gradientem 2-25 mM glukozy. Jak pokazano na rycinie 1, napływ wapnia i wydzielanie insuliny są wyzwalane po około 13 minutach perfuzji, co odpowiada 6 mM glukozy. Zmiany potencjałów mitochondrialnych są widoczne wcześniej, zgodnie z oczekiwaniami, po około 11 minutach. Dane te pokazują korzyści płynące z wykorzystania tej sieci mikroprzepływowej do scharakteryzowania fizjologii wysp trzustkowych.
Rysunek 1. Reakcje fizjologiczne na stymulację komórek wysp trzustkowych.