Opracowano mikrofluidyczne urządzenie do perifuzji wysepek trzustkowych w celu oceny dynamicznego wydzielania insuliny przez wiele wysepek oraz jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego napływu jonów wapnia i zmian potencjału mitochondrialnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wieloparametryczny system perfuzji wysepek w mikroprzepływowym urządzeniu perfuzyjnym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowano mikrofluidyczne urządzenie do perifuzji wysepek w celu oceny dynamicznego wydzielania insuliny przez wiele wysepek oraz jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego napływu jonów wapnia i zmian potencjału mitochondrialnego. Urządzenie składa się z trzech warstw: pierwsza warstwa zawiera matrycę mikroskalowych studni (średnica 500 $\mu$m i głębokość 150 $\mu$m), które pomagają unieruchomić wysepki podczas ekspozycji na przepływ i maksymalizują powierzchnię wystawioną na działanie czynników; druga warstwa zawiera okrągłą komorę perifuzyjną (głębokość 3 mm, średnica 7 mm); a trzecia warstwa zawiera kanał wlotowy-mieszający, który rozszerza się przed wtryskiem do komory perifuzyjnej (szerokość 2 mm, długość 19 mm i wysokość 500 $\mu$m) w celu optymalizacji efektywności mieszania przed wprowadzeniem do komory perifuzyjnej. Wykazano również możliwość tworzenia w mikrofluidycznej sieci perifuzyjnej różnych gradientów glukozy, w tym liniowych, dzwonowatych i prostokątnych.
Protokół
A. Mikrowytwarzanie trójwarstwowego urządzenia do perifuzji mikrofluidycznej
Protokół główny dla dołków dolnych (dołki o głębokości 150 μm)
- W razie potrzeby oczyścić wafer za pomocą żyletki. Przemyć acetonem, metanolem oraz IPA. Przeprowadzić obróbkę plazmową przy mocy 50 Watts przez 30 s.
- Nanieść SU8-10 metodą spin-coatingu przy 20 rpm. [Krok 1: 500 rpm, 10 s, 10 rpm/s, Krok 2: 200 rpm, 30 s, 30 rpm/s].
[UWAGA: po naniesieniu SU8 nie trzymać wafera pęsetą] - Wykonać wstępne wygrzewanie (soft bake) wafera w temperaturze 65 °C przez 20 min oraz w 95 °C przez 50 min.
- Naświetlić wafer światłem UV przez odpowiednią maskę. Dawka dla wysokości 150 μm wynosi 650 mJ/cm2.
- Wykonać wygrzewanie po naświetlaniu (post exposure bake) wafera w temperaturze 65 °C przez 1 min oraz w 95 °C przez 12 min.
- Wywołać wafer w wywoływaczu do SU8 przez 15 min.
Główny protokół mikrokanałów (studnie o głębokości 50 μm)
- W razie potrzeby oczyścić wafer za pomocą żyletki. Oczyścić acetonem, metanolem oraz IPA. Przeprowadzić obróbkę plazmową przy mocy 50 W przez 30 s.
- Nanieść SU8-2150 metodą spin-coatingu przy 100 rpm. [Krok 1: 50 rpm, 10 s, 10 rpm/s, Krok 2: 100 rpm, 30 s, 300 rpm/s].
- Wstępnie wypiec (soft bake) wafer w temperaturze 65 °C przez 15 min oraz w 95 °C przez 2 h i 30 min.
- Wafer poddać naświetlaniu światłem UV przez wybraną maskę. Dawka ekspozycji dla wysokości 650 μm wynosi 685 mJ/cm2.
- Wypiec wafer po naświetlaniu (post exposure bake) w temperaturze 65 °C przez 5 min oraz w 95 °C przez 35 min.
- Wywołać wafer w developerze SU8 przez 20-30 min.
Przygotowanie roztworu PDMS
- Roztwór polidimetylosiloksanu (PDMS) przygotowuje się poprzez dokładne wymieszanie 10 części elastomeru silikonowego z 1 częścią czynnika sieciującego ze standardowego zestawu Sylgard 184.
- Pęcherzyki powietrza powstałe w roztworze PDMS podczas procesu mieszania usuwa się za pomocą desykatora próżniowego.
- Odgazowany roztwór PDMS powoli dozuje się na matryce SU8 oraz do pustej szalki Petriego w celu przygotowania trzeciej warstwy.
- Temperaturę płyty grzejnej ustawia się na 75 °C i utwardza PDMS w tej temperaturze przez 2 hrs.
- Wloty, wyloty i studzienki wymiany wycina się za pomocą dziurkacza o odpowiedniej średnicy.
- Warstwy łączy się ze sobą na szkiełku przedmiotowym (rozmiar 0.1 mm) przy użyciu ręcznego urządzenia plazmowego.
B. Układ eksperymentalny
- Przepuść 70% etanol przez mikrourządzenie w celu sterylizacji. Przepłucz urządzenie wodą DI, aby usunąć etanol. Przelej 50 ml 0,5% BSA przez urządzenie, aby zapobiec nieswoistej adsorpcji insuliny do ścianek mikrokanałów.
- Gradient wzrostowy stężenia glukozy oraz inne powiązane gradienty generowane przez oprogramowanie LabView, które komunikuje się z pompami strzykawkowymi, są testowane w celu upewnienia się, że gradienty są stabilne.
- Od 25 do 30 wysepek trzustkowych myszy inkubowano z 5 μM Fura-2/AM (wskaźnik wapnia, Molecular probes, CA) i 2,5 μM Rodaminy 123 (Rh123, wskaźnik potencjału mitochondrialnego, Sigma, MO) przez 30 min w 37 °C w buforze Krebsa-Ringera (KRB) zawierającym 2 mM glukozy.
- Wysepki trzustkowe myszy są ostrożnie wprowadzane pipetą do mikroprzepływowego urządzenia do perifuzji przez port wlotowy.
- Sieć mikroprzepływową konfiguruje się następnie poprzez podłączenie wlotu do pomp strzykawkowych za pomocą rurek Tygon i łącznika w kształcie litery Y oraz wylotu do kolektora frakcji. Urządzenie spoczywa na stoliku grzewczym (37 °C) mikroskopu, a rurki wlotowe są podgrzewane na płytce grzejnej, aby utrzymać temperaturę komory i roztworu na poziomie 37 °C.
- Bezpośrednio po konfiguracji wysepki trzustkowe myszy są poddawane perifuzji buforem KRB zawierającym 2 mM glukozy przez 10 min, a następnie gradientowi glukozy (2 mM – 25 mM) przez 25 min.
- Obrazy time-lapse są zbierane i analizowane co 15 s za pomocą oprogramowania SimplePCI. Perifuzat jest również zbierany co minutę za pomocą kolektora frakcji w celu analizy wydzielania insuliny przy użyciu zestawu ELISA.
Reprezentatywne wyniki
Wyspy mysie poddano perfuzji z liniowym gradientem glukozy w zakresie 2-25 mM. Jak pokazano na Rysunku 1, napływ wapnia i sekrecja insuliny zostają zainicjowane po około 13 minutach perfuzji, co odpowiada stężeniu 6 mM glukozy. Zmiany potencjałów mitochondrialnych są widoczne wcześniej, zgodnie z przewidywaniami, około 1 minuty. Dane te wykazują zalety zastosowania tej sieci mikroprzepływowej do charakteryzacji fizjologii wysp.
Rysunek 1. Reakcje fizjologiczne na stymulację komórek wysepek trzustkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tradycyjne systemy perfuzji wysp (w skali makro i mikro) posiadają pewne ograniczenia, w tym złożoność konfiguracji i konstrukcji, wysokie wymagania techniczne oraz trudność w tworzeniu w systemie gradientów chemicznych zdefiniowanych przez użytkownika. Opisany tutaj mikrofluidyczny system perfuzji pokonuje te ograniczenia dzięki prostej geometrii konstrukcji i wykonania. Co ważniejsze, system ten może zostać zintegrowany z metodą obrazowania fluorescencyjnego, co stanowi unikalne narzędzie do badania fizjologii wysp. Sy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez międzynarodowe stypendium AAUW dla Adeoli Adewoli, NIH/NCRR (U42RR023245) dla Jose Oberholzera oraz The Chicago Diabetes Project.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawki 60ml | BD Biosciences | ||
| Barwnik fluorescencyjny Fura-2 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Barwnik fluorescencyjny Rhodamine123 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glukoza | Sigma-Aldrich | ||
| Swojczy Albuminy Wołowej | Sigma-Aldrich | ||
| Silikonowe rurki 30" | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| Probówki Eppendorf 1,5ml | Fisher Scientific | ||
| Konektory Y | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Konektory do strzykawek | Cole-Parmer | żeński korek luer 1/16” | |
| Konektory proste | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Konektor kątowy | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Pompa strzykawkową Havard | Harvard Apparatus | ||
| Urządzenie do perifuzji | |||
| Płyta grzejna | PMC | ||
| Termometr | Omega Engineering, Inc. | ||
| Kolektor frakcji | Gibson | ||
| Pipetator | Fisher Scientific | ||
| Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny | Olympus Corporation | IX71 | |
| Kamera CCD (Charge-coupled device) | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
Bibliografia
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
