Zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi w celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych

Podsumowanie

Opracowano zautomatyzowane urządzenie mikroprzepływowe do wzbogacania krążących komórek z jądrem z krwi obwodowej poprzez lizę erytrocytów, co zapewnia izolację wysokiej jakości próbki bez utraty komórek.

Streszczenie

W niniejszym raporcie szczegółowo opisano protokół wykorzystujący zautomatyzowane mikrofluidyczne urządzenie do lizy krwi. Krążące komórki jądrzaste (CNC), w tym leukocyty i komórki śródbłonka, stanowią idealną platformę do aktualizacji stanu układu odpornościowego danej osoby. Protokół mikrofluidyczny umożliwia wzbogacenie frakcji CNC bez selektywnej utraty komórek oraz bez zmienności w przygotowaniu próbek wynikającej z etapów realizowanych przez operatora. W skrócie protokół obejmuje wykonanie urządzenia, pobranie próbek, konfigurację urządzenia oraz przepuszczenie krwi przez komorę mikrofluidyczną. Wewnątrz urządzenia krew pełna jest gwałtownie mieszana z wodą dejonizowaną przez około 10 sekund w kanale mikrofluidycznym o wymiarach 50 μm x 150 μm. W tym przedziale czasowym erytrocyty ulegają lizie ze względu na warunki hipotoniczne. Struktury typu herringbone na dnie kanału zapewniają dokładne mieszanie i ekspozycję komórek na stałe środowisko. Pozostałe komórki są przywracane do warunków izotonicznych na wylocie z urządzenia, utrwalane przy użyciu 2% paraformaldehydu, wirowane w celu oddzielenia szczątków erytrocytów od CNC, a następnie zawieszane w buforze przepływowym w celu barwienia i analizy metodą cytometrii przepływowej. Wyniki wykazują czyste wykresy rozrzutu w cytometrii przepływowej z zachowaniem populacji CNC. Znaczenie tego urządzenia i protokołu przejawia się w badaniu i zrozumieniu patogenezy chorób poprzez analizę populacji CNC. Tym samym wykazano automatyzację, skuteczność i prostotę protokołu mikrofluidycznego.

Protokół

Część 1. Wykonanie urządzenia mikroprzepływowego

Krzemowa forma matrycowa urządzenia do lizy mikrofluidycznej została wykonana przy użyciu standardowych technik fotolitograficznych z wykorzystaniem sprzętu dostępnego w czystym pomieszczeniu University of Louisville [1]. Do wygenerowania maski przezroczystej (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) służyło oprogramowanie AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA), co pozwoliło na stworzenie negatywowych replik kanałów. Urządzenie do lizy mikrofluidycznej wykonano z krzemowej formy matrycowej przy użyciu technik soft lithography z zastosowaniem elastomeru poli(dimetylosiloksanu) (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). Elastomer z replikowanymi kanałami został oddzielony od formy, a otwory dostępu do kanałów wykonano za pomocą igły 20G (Small Parts, Miramar, FL.). Wafer PDMS został nieodwracalnie przywiązany do szkiełka przedmiotowego za pomocą plazmy tlenowej, a następnie poddany testom eksperymentalnym.

Część 2. Protokół obsługi urządzenia do lizy

Po wykonaniu i przetestowaniu urządzenia mikroprzepływowego można przystąpić do eksperymentów z lizą erytrocytów. Następująca sekcja szczegółowo opisuje protokół dla urządzenia mikroprzepływowego.

2.1 Pobieranie próbek

1. Pobierz 4 mililitry krwi z żyły łokciowej przyśrodkowej, znajdującej się na przedniej części przedramienia pacjenta, do dwóch probówek typu vacutainer z zielonymi nakrętkami o pojemności 2 ml każda, zawierających heparynę jako antykoagulant.
2. Odrzuć pierwszą probówkę o pojemności 2 ml, ponieważ zawiera ona oderwane dojrzałe komórki śródbłonka (wyniki fałszywie dodatnie).
3. Resuspenduj drugą probówkę, aby wymieszać heparynę z krwią, obracając ją góra-dół; niezwłocznie umieść na lodzie.
4. Przenieś 1 ml krwi do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Przetwórz próbkę krwi niezwłocznie (w ciągu jednej godziny od pobrania).

2.2 Napełnianie urządzenia mikrofluidycznego PBS

1. Należy pozyskać urządzenie mikrofluidyczne złączone ze szkłem. W wlotach i wylocie należy zamocować na wcisk tubingi dostępowe (Small Parts, Miramar, FL) o nieco większej średnicy (Rysunek 1).
2. Do tubingów na każdym z wlotów należy przymocować igłę strzykawkową o rozmiarze 30G (Small Parts, Miramar, FL), tworząc interfejs makro-mikro.
3. Strzykawkę o pojemności 1 ml należy napełnić 1X PBS, a następnie usunąć pęcherzyki powietrza poprzez delikatne opukanie igły strzykawki. Strzykawkę 1 ml z PBS należy podłączyć do wlotu 1 urządzenia mikrofluidycznego. Należy ostrożnie, ręcznie nacisnąć tłok strzykawki z 1X PBS, aż roztwór wypłynie przez wlot 2, a następnie natychmiast zacisnąć wlot 2 za pomocą standardowego biurowego klipsa.
4. Należy kontynuować podawanie 1X PBS, aż płyn dotrze do portu wylotowego urządzenia mikrofluidycznego. Gdy roztwór wypłynie z wylotu, należy zacisnąć tubing wylotowy kolejnym klipsem.
5. Należy dalej naciskać tłok strzykawki 1 ml, aż 1X PBS wypłynie przez wlot 3, a następnie zacisnąć port wlotu 3 kolejnym biurowym klipsem. Urządzenie mikrofluidyczne jest teraz w pełni odpowietrzone i przygotowane do pracy.

Rysunek 1. Schemat urządzenia przedstawiający wloty dla poszczególnych roztworów oraz wylot.

2.3 Przygotowanie pomp strzykawkowych i roztworu

1. Aby skalibrować pompy, należy wykonać następujące kroki:
   1. W przypadku dużej pompy strzykawkowej Harvard (Harvard, PHD 22/2000 Part # 702000): ustawić konfigurację średnicy na 22,5 mm i szybkość przepływu na 600 μl/min.
   2. W przypadku małej pompy strzykawkowej Harvard (Harvard, Pico Plus Part # 702213): ustawić konfigurację średnicy na 4,61 mm i szybkość przepływu na 20 μl/min.
2. Napełnić jedną strzykawkę 30 ml sterylną wodą dejonizowaną. Można to zrobić, pobierając roztwór bezpośrednio z probówki stożkowej 50 ml. (Oznaczyć strzykawkę)
3. Napełnić drugą strzykawkę 30 ml 2X roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i 2% paraformaldehydem (PFA), stosując procedurę opisaną w kroku 9. (Oznaczyć strzykawkę)
4. Napełnić strzykawkę 1 ml 1X PBS z aliquotów przechowywanych w probówkach stożkowych 15 ml, stosując procedurę opisaną w kroku 9.
5. Podłączyć strzykawkę 30 ml z wodą dejonizowaną do wlotu 2, a strzykawkę 30 ml z 2X PBS do wlotu 3 (należy upewnić się, że w przewodach lub urządzeniu mikrofluidycznym nie pozostały pęcherzyki powietrza). Zdjąć zaciski z wlotów 2 i 3 oraz z przewodu wylotowego. Podłączyć strzykawkę 1 ml z 1X PBS do wlotu 1. Aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków, należy napełnić igłę strzykawki cieczą, podłączyć strzykawkę, a następnie stuknąć w igłę, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

2.4 Lizy erytrocytów

1. Umieść wszystkie strzykawki na odpowiednich pompach Harvard zgodnie z poniższym opisem:
   1. Umieść dwie strzykawki 30 ml (jedną zawierającą sterylną wodę dejonizowaną, a drugą 2X PBS, 2% PFA) razem na dużej pompie strzykawkowej Harvard.
   2. Umieść strzykawkę 1 ml (zawierającą 1X PBS) na małej pompie strzykawkowej Harvard.
   3. Umieść przewód wylotowy w pojemniku na odpady (probówce stożkowej 50 ml z etykietą waste).
2. Włącz dużą pompę strzykawkową Harvard (ze strzykawkami 30 ml) i pozostaw ją w działaniu przez jedną minutę. (Upewnij się, że w urządzeniu lub w przewodach nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków).
3. Włącz małą pompę strzykawkową Harvard i pozostaw ją w działaniu przez dodatkową minutę. (Upewnij się, że w urządzeniu lub w przewodach nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków). Zatrzymaj pompy. Urządzenie mikroprzepływowe jest teraz gotowe do użycia.
4. Zdejmij strzykawkę 1 ml zawierającą 1X PBS z małej pompy strzykawkowej Harvard.
5. Po pobraniu próbki krwi napełnij strzykawkę 1 ml ilością 0,05 ml sterylnego 1X PBS, nie dopuszczając do powstania pęcherzyków powietrza. Następnie napełnij strzykawkę 0,5 ml krwi pobranej z probówki Eppendorf. (Strzykawka 1 ml będzie teraz zawierać końcową objętość 0,55 ml krwi i buforu 1X PBS). Uwaga: Podczas napełniania trzymaj strzykawkę w pozycji pionowej, aby uniknąć zmieszania 0,05 ml PBS z krwią.
6. Podłącz strzykawkę zawierającą krew do wlotu 1 i ostrożnie zamontuj strzykawkę na małej pompie strzykawkowej Harvard (unikając przepchnięcia krwi przez przewody do urządzenia; strzykawka jest montowana w pompie pionowo).
7. Wyjmij przewód wylotowy z probówki waste, w jej miejsce włóż czystą probówkę wirówkową 50 ml i umieść ją w pojemniku z lodem.
8. Włącz najpierw dużą pompę strzykawkową Harvard i pozostaw ją w działaniu przez 1 minutę. Rozpocznij zbieranie próbki z wylotu do probówki wirówkowej 50 ml.
9. Włącz małą pompę strzykawkową Harvard.
10. Gdy próbka krwi w strzykawce 1 ml całkowicie przepłynie przez urządzenie, zatrzymaj obie pompy. Powinno to zająć około 20 minut.
11. Odwirowuj zebraną próbkę przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem.
12. Usuń supernatant, umieszczając końcówkę pipety po przeciwnej stronie białego osadu. Usuń jak największą ilość supernatantu, zwłaszcza szczątków krwinek czerwonych, nie naruszając białego osadu.
13. Resuspenduj próbkę w 1 ml buforu przepływowego (1X PBS, 1% BSA [albuminy surowicy bydlęcej], 2% PFA) poprzez pipetowanie w górę i w dół. Przenieś próbkę do probówki Eppendorf 1,5 ml.
14. Odwirowuj zebraną próbkę w mikrocentry fudze przez 5 minut przy 4 x g w temperaturze pokojowej. Z taką samą precyzją jak poprzednio usuń supernatant.
15. Resuspenduj próbkę w 1 ml buforu przepływowego za pomocą wortexera.

2.5 Przygotowanie do analizy cytometrycznej

1. W celu analizy próbek metodą cytometrii przepływowej, należy dodać 100 μl próbki do probówki do cytometrii przepływowej.
2. Do 100 μl próbki należy dodać określone przeciwciało (zachowując odpowiednie stężenie).
3. Próbkę należy inkubować przez 30 minut w temperaturze 40 C.
4. Przed przeprowadzeniem cytometrii przepływowej próbkę należy dwukrotnie przemyć buforem do cytometrii. Etap mycia obejmuje dodanie 250 μl buforu do cytometrii, wymieszanie w wstrząsarze Vortex, wirowanie przez 5 minut przy 350 x g oraz usunięcie supernatantu jednym płynnym ruchem probówki.
5. Osad należy resuspender w 250 μl buforu do cytometrii. Próbka jest gotowa do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Reprezentatywne wyniki

Krew pełna została przepuszczona przez mikrofluidyczne urządzenie do lizy i poddana protokołowi postprocesowania, co pozwoliło na usunięcie erytrocytów i wzbogacenie frakcji krążących komórek jądrzastych (CNC). Idealne wyniki powinny dać przejrzysty wykres kropkowy cytometrii przepływowej z wyraźnie oddzielonymi populacjami CNC. Na poniższych Rysunkach 2 i 3 przedstawiono porównanie wykresów kropkowych próbki krwi pełnej bez lizy erytrocytów oraz z lizą erytrocytów przeprowadzoną zgodnie z protokołem mikrofluidycznym, z osiami reprezentującymi rozproszenie światła w przód (FSC) względem rozproszenia bocznego (SSC). Widać, że protokół wzbogacania metodą mikrofluidyczną jest niezbędny do uzyskania przejrzystego wykresu kropkowego w cytometrii przepływowej.

Rysunek 2. Wykres rozrzutu cytometrii przepływowej próbki krwi pełnej bez lizy erytrocytów z osiami FSC i SSC.

Rycina 3. Wykres rozrzutu cytometrii przepływowej dla krążących komórek jądrzastych po mikrofluidycznej lizie erytrocytów, z populacjami oznaczonymi na osiach FSC i SSC. Region 1 (czerwony) reprezentuje limfocyty, Region 2 (zielony) reprezentuje monocyty, Region 3 (niebieski) reprezentuje granulocyty, a Region 4 (fioletowy) nie został jeszcze scharakteryzowany.

Usunięcie pozostałości erytrocytów za pomocą pipety w protokole jest również istotne, gdy jest to konieczne. Poniżej, na Rysunku 4, przedstawiono wykres rozrzutu wykazujący nadmiar pozostałości erytrocytów. Choć nie powodują one zamglenia wykresu rozrzutu, jak w przypadku Rysunku 2, podczas analizy danych należy uwzględnić dodatkowe zdarzenia wynikające z obecności szczątków erytrocytów.

Rysunek 4. Wykres rozproszenia z cytometrii przepływowej przedstawiający debris erytrocytów, widoczny jako skupisko zdarzeń w Regionie 5 (cyjan).

Barwienie komórek pod kątem określonych markerów fenotypowych przeciwciał również pozwoli na uzyskanie charakterystycznych wyników. Na poniższych rysunkach przedstawiono barwienia fenotypowe przeciwciał dla 3 odrębnych populacji leukocytów: limfocytów, monocytów i granulocytów. Rysunek 5 przedstawia populacje limfocytów na wykresie z osiami CD3 i CD4. Monocyty i granulocyty pokazano na Rysunkach 6-7 z osiami odpowiednio FSC względem CD14 oraz CD66b.

Rycina 5. Wykres rozrzutu cytometrii przepływowej przedstawiający limfocyty z osiami CD3 i CD4.

Rysunek 6. Wykres rozrzutu z cytometrii przepływowej przedstawiający monocyty z osiami FSC i CD14.

Rysunek 7. Wykres rozrzutu cytometrii przepływowej przedstawiający granulocyty na osiach FSC i CD66b.

Dyskusja

Opisano zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi. W protokole znajdują się kluczowe kroki, na które należy zwrócić uwagę. W sekcji P.2.1 ważne jest odrzucenie pierwszej pobranej probówki z krwią, ponieważ próbka zawiera oderwane dojrzałe komórki śródbłonka, które dają wyniki fałszywie dodatnie. Należy również upewnić się, że analiza próbki krwi zostanie przeprowadzona w ciągu godziny od momentu pobrania. Podczas przygotowania urządzenia mikrofluidycznego w sekcji P.2.2 ważne jest początkowe usunięcie pęcherzyk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Baza elastomeru silikonowego Sylgard 184	Dow Corning
Utwardzacz elastomeru silikonowego Sylgard 184	Dow Corning
Igła do strzykawki G30	Small Parts, Inc.	NE-301PL-25
Przewód Tygon (.010" ID)	Small Parts, Inc.	TGY-010
Igła do strzykawki G20	Small Parts, Inc.	NE-201PL-25
Pompa strzykawkowa (Harvard PHD 22/2000)	Harvard Apparatus	702000
Pompa strzykawkowa (Harvard Pico Plus)	Harvard Apparatus	702213
Probówki do cytometrii przepływowej	DB Biosciences	352052
Barwniki przeciwciałowe	DB Biosciences
Probówki Eppendorf 1,5 ml	Fisher Scientific	05-402-25
Probówka 50 ml	Fisher Scientific
Strzykawka 1 ml	Fisher Scientific
Probówka 30 ml	Fisher Scientific
Paraformaldehyd (PFA)	Fisher Scientific
Seryjowa albumina bydlęca (BSA)	Fisher Scientific
10X PBS	Fisher Scientific