Zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi w celu wzbogacenia frakcji krążących komórek jądrzastych

Podsumowanie

Opracowano zautomatyzowane urządzenie mikroprzepływowe do wzbogacania krążących komórek z jądrem z krwi obwodowej poprzez lizę erytrocytów, co zapewnia izolację wysokiej jakości próbki bez utraty komórek.

Streszczenie

W niniejszym raporcie szczegółowo opisano protokół wykorzystujący zautomatyzowane mikrofluidyczne urządzenie do lizy krwi. Krążące komórki jądrzaste (CNC), w tym leukocyty i komórki śródbłonka, stanowią idealną platformę do aktualizacji stanu układu odpornościowego danej osoby. Protokół mikrofluidyczny umożliwia wzbogacenie frakcji CNC bez selektywnej utraty komórek oraz bez zmienności w przygotowaniu próbek wynikającej z etapów realizowanych przez operatora. W skrócie protokół obejmuje wykonanie urządzenia, pobranie próbek, konfigurację urządzenia oraz przepuszczenie krwi przez komorę mikrofluidyczną. Wewnątrz urządzenia krew pełna jest gwałtownie mieszana z wodą dejonizowaną przez około 10 sekund w kanale mikrofluidycznym o wymiarach 50 μm x 150 μm. W tym przedziale czasowym erytrocyty ulegają lizie ze względu na warunki hipotoniczne. Struktury typu herringbone na dnie kanału zapewniają dokładne mieszanie i ekspozycję komórek na stałe środowisko. Pozostałe komórki są przywracane do warunków izotonicznych na wylocie z urządzenia, utrwalane przy użyciu 2% paraformaldehydu, wirowane w celu oddzielenia szczątków erytrocytów od CNC, a następnie zawieszane w buforze przepływowym w celu barwienia i analizy metodą cytometrii przepływowej. Wyniki wykazują czyste wykresy rozrzutu w cytometrii przepływowej z zachowaniem populacji CNC. Znaczenie tego urządzenia i protokołu przejawia się w badaniu i zrozumieniu patogenezy chorób poprzez analizę populacji CNC. Tym samym wykazano automatyzację, skuteczność i prostotę protokołu mikrofluidycznego.

Protokół

Część 1. Fabrykacja urządzenia mikrofluidycznego

Krzemowa forma matrycowa urządzenia do lizy mikroprzepływowej została wykonana przy użyciu standardowych technik fotolitograficznych z wykorzystaniem sprzętu znajdującego się w czystym pomieszczeniu University of Louisville [1]. Program AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) posłużył do wygenerowania maski transparentnej (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) w celu stworzenia negatywnych replik kanałów. Urządzenie do lizy mikroprzepływowej wykonano z krzemowej formy matrycowej przy użyciu technik soft-litografii z wykorzystaniem elastomeru poli(dimetylosiloksanu) (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). Elastomer z replikowanymi kanałami został oddzielony od formy, a otwory dostępowe do kanałów wykonano za pomocą igły o rozmiarze 20-gauge (Small Parts, Miramar, FL.). Wafer z PDMS został nieodwracalnie połączony ze szkiełkiem przedmiotowym za pomocą plazmy tlenowej i poddany testom eksperymentalnym.

Część 2. Protokół obsługi urządzenia do lizy

Po wykonaniu i przetestowaniu urządzenia mikrofluidycznego można rozpocząć eksperymenty z lizą erytrocytów. W następującej sekcji szczegółowo opisano protokół dla urządzenia mikrofluidycznego.

2.1 Pobieranie próbek

1. Pobrać 4 ml próbki krwi z żyły łokciowej środkowej na przedniej stronie przedramienia pacjenta do dwóch 2 ml probótek próżniowych z zielonym zamknięciem zawierających heparynę jako antykoagulant.
2. Odrzucić pierwszą probówkę 2 ml, ponieważ zawiera ona oderwane dojrzałe komórki śródbłonka (wyniki fałszywie dodatnie).
3. Resuspendować zawartość drugiej probówki, mieszając heparynę z krwią poprzez obracanie probówką w górę i w dół; natychmiast umieścić próbkę w lodzie.
4. Przenieść 1 ml krwi do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Próbkę krwi należy przetworzyć niezwłocznie (w ciągu jednej godziny od pobrania).

2.2 Nasycenie urządzenia mikroprzepływowego PBS

1. Należy przygotować urządzenie mikrofluidyczne złączone ze szkłem. W wlotach i wylocie należy zamontować na wcisk rurki doprowadzające (Small Parts, Miramar, FL) o nieco większej średnicy (Rycina 1).
2. Do rurek w każdym z wlotów należy przymocować igłę strzykawki o rozmiarze 30G (Small Parts, Miramar, FL), tworząc interfejs makro-mikro.
3. Strzykawkę o pojemności 1 ml należy napełnić roztworem 1X PBS, usuwając pęcherzyki powietrza poprzez lekkie stuknięcie w igłę strzykawki. Strzykawkę 1 ml z PBS należy podłączyć do wlotu 1 w urządzeniu mikrofluidycznym. Należy delikatnie, ręcznie docisnąć tłok strzykawki z 1X PBS, aż roztwór zacznie wypływać z wlotu 2, a następnie niezwłocznie zacisnąć wlot 2 za pomocą standardowego biurowego klipsa.
4. Należy kontynuować podawanie 1X PBS, aż płyn dotrze do portu wylotowego urządzenia mikrofluidycznego. Gdy roztwór wypłynie z wylotu, rurkę wylotową należy zacisnąć innym klipsem.
5. Należy dalej dociskać tłok strzykawki 1 ml, aż 1X PBS wypłynie z wlotu 3, a następnie zacisnąć port wlotu 3 kolejnym klipsem biurowym. Urządzenie mikrofluidyczne jest teraz w pełni przygotowane (przepłukane).

Rysunek 1. Schemat urządzenia przedstawiający wloty dla poszczególnych roztworów oraz wylot.

2.3 Przygotowanie pomp strzykawkowych i roztworu

1. Aby skalibrować pompy, należy wykonać następujące kroki:
   1. W przypadku dużej pompy strzykawkowej Harvard (Harvard, PHD 22/2000 Part # 702000): ustawić konfigurację średnicy na 22.5 mm i szybkość przepływu na 600 μl/min.
   2. W przypadku małej pompy strzykawkowej Harvard (Harvard, Pico Plus Part # 702213): ustawić konfigurację średnicy na 4.61 mm i szybkość przepływu na 20 μl/min.
2. Napełnić strzykawkę 30 ml sterylną wodą dejonizowaną. Można to zrobić, pobierając roztwór bezpośrednio z probówki stożkowej 50 ml. (Oznaczyć strzykawkę)
3. Napełnić drugą strzykawkę 30 ml 2X fosforanem buforowanym solą (PBS) z 2% paraformaldehydem (PFA), stosując procedurę opisaną w kroku 9. (Oznaczyć strzykawkę)
4. Napełnić strzykawkę 1 ml 1X PBS z alikwotów przechowywanych w probówkach stożkowych 15 ml, stosując procedurę opisaną w kroku 9.
5. Podłączyć strzykawkę 30 ml z wodą dejonizowaną do wlotu 2, a strzykawkę 30 ml z 2X PBS do wlotu 3 (należy upewnić się, że w rurkach lub urządzeniu mikroprzepływowym nie pozostały pęcherzyki powietrza). Zdjąć zaciski z wlotów 2 i 3 oraz z rurki wylotowej. Podłączyć strzykawkę 1 ml z 1X PBS do wlotu 1. Aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków, należy napełnić igłę strzykawki cieczą, podłączyć strzykawkę, a następnie stuknąć w igłę, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

2.4 Lizacja erytrocytów

1. Zamocuj wszystkie strzykawki w odpowiednich pompach Harvard zgodnie z poniższymi instrukcjami:
   1. Zamocuj dwie strzykawki o pojemności 30 ml (jedna zawierająca sterylną wodę dejonizowaną, a druga 2X PBS, 2% PFA) razem w dużej pompie strzykawkowej Harvard.
   2. Zamocuj strzykawkę o pojemności 1 ml (zawierającą 1X PBS) w małej pompie strzykawkowej Harvard.
   3. Umieść dren odpływowy w pojemniku na odpady (probówce stożkowej 50 ml z etykietą waste).
2. Włącz dużą pompę strzykawkową Harvard (ze strzykawkami 30 ml) i pozostaw ją włączoną przez jedną minutę. (Upewnij się, że w urządzeniu lub w drenach nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków).
3. Włącz małą pompę strzykawkową Harvard i pozostaw ją włączoną przez dodatkową minutę. (Upewnij się, że w urządzeniu lub w drenach nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków). Zatrzymaj pompy. Urządzenie mikroprzepływowe jest teraz gotowe do użycia.
4. Zdejmij strzykawkę 1 ml zawierającą 1X PBS z małej pompy strzykawkowej Harvard.
5. Po pobraniu próbki krwi napełnij strzykawkę 1 ml ilością 0,05 ml sterylnego 1X PBS, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Następnie napełnij strzykawkę ilością 0,5 ml krwi pobranej z probówki Eppendorf. (Strzykawka 1 ml będzie teraz zawierać końcową objętość 0,55 ml krwi i buforu 1X PBS). Uwaga: Podczas napełniania trzymaj strzykawkę w pozycji pionowej, aby uniknąć wymieszania 0,05 ml PBS z krwią.
6. Podłącz strzykawkę zawierającą krew do wlotu 1 i ostrożnie zamocuj strzykawkę (unikając przepchnięcia krwi przez dren do urządzenia) w małej pompie strzykawkowej Harvard (strzykawkę montuje się pionowo w pompie).
7. Wyjmij dren odpływowy z probówki waste i zastąp go czystą probówką wirówkową 50 ml, a następnie ustaw ją w naczyniu z lodem.
8. Włącz najpierw dużą pompę strzykawkową Harvard i pozostaw ją włączoną przez 1 minutę. Rozpocznij zbieranie próbki z odpływu do probówki wirówkowej 50 ml.
9. Włącz małą pompę strzykawkową Harvard.
10. Gdy próbka krwi ze strzykawki 1 ml całkowicie przepłynie przez urządzenie, zatrzymaj obie pompy. Powinno to zająć około 20 minut.
11. Wirowarkuj zebraną próbkę przez 5 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem.
12. Usuń nadsącz, umieszczając końcówkę pipety po przeciwnej stronie białego osadu. Usuń jak najwięcej nadsączu, zwłaszcza zanieczyszczeń z czerwonych krwinek, nie naruszając białego osadu.
13. Resuspenduj próbkę w 1 ml buforu przepływowego (1X PBS, 1% BSA [albuminy surowicy bydlęcej], 2% PFA) poprzez pipetowanie w górę i w dół. Przenieś próbkę do probówki Eppendorf 1,5 ml.
14. Wirowarkuj zebraną próbkę w mikrowirówce przez 5 minut przy 4 x g w temperaturze pokojowej. Z taką samą precyzją jak wcześniej usuń nadsącz.
15. Resuspenduj próbkę w 1 ml buforu przepływowego za pomocą wortexowania.

2.5 Przygotowanie do analizy cytometrycznej

1. W celu analizy próbek za pomocą cytometrii przepływowej, należy przenieść 100 μl próbki do probówki do cytometrii przepływowej.
2. Do 100 μl próbki należy dodać określone przeciwciało (zachowując odpowiednie stężenie).
3. Próbkę inkubować przez 30 minut w temperaturze 40 C.
4. Przed przeprowadzeniem cytometrii przepływowej próbkę należy dwukrotnie przemyć buforem do cytometrii. Etap płukania obejmuje dodanie 250 μl buforu do cytometrii, wymieszanie w wortexie, wirowanie przez 5 minut przy 350 x g oraz usunięcie supernatantu jednym ruchem odwrócenia probówki do cytometrii przepływowej.
5. Osad należy resuspender w 250 μl buforu do cytometrii. Próbka jest gotowa do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Reprezentatywne wyniki

Krew pełna została przepuszczona przez mikrofluidyczne urządzenie do lizy oraz poddana protokołowi postprocesowania, co pozwoliło na usunięcie erytrocytów i wzbogacenie frakcji krążących komórek jądrzastych (CNCs). Idealne wyniki powinny dać przejrzysty wykres rozrzutu z cytometrii przepływowej z oddzielnymi populacjami CNC. Na poniższych Rysunkach 2 i 3 przedstawiono porównanie wykresów rozrzutu próbki krwi pełnej bez lizy erytrocytów oraz z lizą erytrocytów przeprowadzoną zgodnie z protokołem mikrofluidycznym, gdzie osie reprezentują rozproszenie światła w przód (FSC) względem rozproszenia bocznego (SSC). Można zauważyć, że protokół wzbogacania metodą mikrofluidyczną jest niezbędny do uzyskania przejrzystego wykresu rozrzutu w cytometrii przepływowej.

Rycina 2. Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej próbki krwi pełnej bez lizy erytrocytów z osiami FSC i SSC.

Rysunek 3. Wykres rozproszenia z cytometrii przepływowej krążących komórek jądrzastych z mikrofluidyczną lizą erytrocytów, z populacjami oznaczonymi na osiach FSC i SSC. Region 1 (czerwony) reprezentuje limfocyty, Region 2 (zielony) reprezentuje monocyty, Region 3 (niebieski) reprezentuje granulocyty, a Region 4 (fioletowy) nie został jeszcze scharakteryzowany.

Usunięcie resztek krwinek czerwonych za pomocą pipety w protokole jest również istotne, gdy jest to konieczne. Poniżej, na Rysunku 4, przedstawiono wykres rozrzutu wykazujący nadmiar resztek krwinek czerwonych. Choć nie zaciemniają one wykresu rozrzutu tak jak na Rysunku 2, podczas analizy danych należy uwzględnić dodatkowe zdarzenia wynikające z obecności resztek erytrocytów.

Rysunek 4. Wykres rozrzutu cytometrii przepływowej przedstawiający detrytus krwinek czerwonych, widoczny jako skupisko zdarzeń w Regionie 5 (cyjan).

Barwienie komórek na określone fenotypowe markery przeciwciał również przyniesie charakterystyczne wyniki. Na poniższych rysunkach przedstawiono barwienia fenotypowe przeciwciał dla 3 odrębnych populacji leukocytów: limfocytów, monocytów i granulocytów. Rysunek 5 przedstawia populacje limfocytów wykreślone na osiach CD3 i CD4. Monocyty i granulocyty pokazano na rysunkach 6-7 z osiami odpowiednio FSC względem CD14 oraz CD66b.

Rysunek 5. Wykres punktowy z cytometrii przepływowej przedstawiający limfocyty na osiach CD3 i CD4.

Rysunek 6. Wykres rozproszenia z cytometrii przepływowej przedstawiający monocyty na osiach FSC i CD14.

Rysunek 7. Wykres rozrzutu cytometrii przepływowej przedstawiający granulocyty z osiami FSC i CD66b.

Dyskusja

Opisano zautomatyzowany protokół mikrofluidycznej lizy krwi. W protokole znajdują się kluczowe kroki, na które należy zwrócić uwagę. W sekcji P.2.1 ważne jest odrzucenie pierwszej pobranej probówki z krwią, ponieważ próbka zawiera oderwane dojrzałe komórki śródbłonka, które dają wyniki fałszywie dodatnie. Należy również upewnić się, że analiza próbki krwi zostanie przeprowadzona w ciągu godziny od momentu pobrania. Podczas przygotowania urządzenia mikrofluidycznego w sekcji P.2.2 ważne jest początkowe usunięcie pęcherzyk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Baza elastomeru silikonowego Sylgard 184	Dow Corning
Utwardzacz elastomeru silikonowego Sylgard 184	Dow Corning
Igła do strzykawki G30	Small Parts, Inc.	NE-301PL-25
Przewód Tygon (.010" ID)	Small Parts, Inc.	TGY-010
Igła do strzykawki G20	Small Parts, Inc.	NE-201PL-25
Pompa strzykawkowa (Harvard PHD 22/2000)	Harvard Apparatus	702000
Pompa strzykawkowa (Harvard Pico Plus)	Harvard Apparatus	702213
Probówki do cytometrii przepływowej	DB Biosciences	352052
Barwniki przeciwciałowe	DB Biosciences
Probówki Eppendorf 1,5 ml	Fisher Scientific	05-402-25
Probówka 50 ml	Fisher Scientific
Strzykawka 1 ml	Fisher Scientific
Probówka 30 ml	Fisher Scientific
Paraformaldehyd (PFA)	Fisher Scientific
Seryjowa albumina bydlęca (BSA)	Fisher Scientific
10X PBS	Fisher Scientific