Pomiar indukowanego napięcia błonowego z użyciem Di-8-ANEPPS

Podsumowanie

Zewnętrzne pole elektryczne indukuje napięcie na błonie komórkowej, określane jako indukowane napięcie błonowe (ΔΦ). Dzięki zastosowaniu barwnika potencjometrycznego di-8-ANEPPS możliwe jest nieinwazyjny pomiar ΔΦ. Niniejsze wideo przedstawia protokół pomiaru ΔΦ przy użyciu di-8-ANEPPS.

Streszczenie

Umieszczenie komórki w zewnętrznym polu elektrycznym powoduje lokalną redystrybucję ładunku wewnątrz i na zewnątrz komórki w sąsiedztwie błony komórkowej, co skutkuje powstaniem napięcia na błonie. Napięcie to, nazywane indukowanym napięciem błonowym (również indukowanym napięciem transbłonowym lub indukowaną różnicą potencjałów transbłonowych) i oznaczane symbolem ΔΦ, występuje tylko tak długo, jak obecne jest pole zewnętrzne. Jeśli na błonie występuje napięcie spoczynkowe, napięcie indukowane nakłada się na nie (sumuje się z nim). Dzięki zastosowaniu jednego z potencjometrycznych barwników fluorescencyjnych, takich jak di-8-ANEPPS, możliwe jest obserwowanie zmian ΔΦ na błonie komórkowej oraz nieinwazyjne pomierzenie jego wartości. di-8-ANEPPS wykazuje silną fluorescencję po związaniu z dwuwarstwą lipidową błony komórkowej, przy czym zmiana intensywności fluorescencji jest proporcjonalna do zmiany ΔΦ. Niniejsze wideo przedstawia protokół pomiaru ΔΦ z użyciem di-8-ANEPPS, a także demonstruje wpływ kształtu komórki na amplitudę i rozkład przestrzenny ΔΦ.

Protokół

Część I: Kroki wstępne

1. W tym eksperymencie wykorzystano linię komórkową jajnika chomika chińskiego (CHO-K1). Komórki wysiano do komór Lab-Tek II (2 dołki, 4 cm² każdy) (Nalge Nunc, Niemcy) w zagęszczeniu ~0,7x10⁵ komórek/ml w pożywce hodowlanej HAM-F12 uzupełnionej o 8% płodowej surowicy cielęcej, 0,15 mg/ml L-glutaminy, 16 mg/ml gentamyciny (wszystkie od Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy) oraz 200 jednostek/ml Crystacilliny (Pliva, Zagrzeb, Chorwacja) i inkubowano w 5% CO₂ w temperaturze 37°C. Alternatywnie komórki można również wysiać na szklane okładki nr 1 (o grubości od 0,13 do 0,16 mm), pokryte adhezywem komórkowym, takim jak polilizyna.
2. Inkubuj komórki w ich pożywce hodowlanej. Inkubacja trwająca od 2 do 4 godzin pozwala uzyskać komórki, które są wciąż w przybliżeniu sferyczne, ale mocno przytwierdzone do powierzchni niewielką częścią swojej błony. Alternatywnie, po 16 do 20 godzinach inkubacji komórki są całkowicie przytwierdzone do powierzchni i mają bardziej złożone kształty, jednak większość z nich nadal się nie dzieli.
3. Przygotuj 10 mM roztwór zapasowy di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA), dodając 843 μl DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy) do 5 mg barwnika w oryginalnej fiolce od firmy Invitrogen. Roztwór zapasowy można przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C przez kilka miesięcy. Przed rozpoczęciem doświadczeń ogrzej roztwór, aż kryształy DMSO się rozpuszczą.
4. Niektóre linie komórkowe mogą wymagać zastosowania pluronicu w celu ułatwienia wbudowania barwnika w błonę komórkową. Pluronic można nabyć jako 20% roztwór zapasowy w DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) lub przygotować roztwór zapasowy o takim samym stężeniu, rozpuszczając pluronic w DMSO. Roztwór zapasowy pluronicu można przechowywać w temperaturze pokojowej.

Część II: Obciążanie komórek di-8-ANEPPS

1. W probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml zmieszaj 3 μl di-8-ANEPPS (10 mM) oraz 2,5 μl 20% pluroniku w 1 ml pożywki Minimum Essential Medium w modyfikacji Spinnera (wersja pozbawiona wapnia) SMEM (pożywka M8167 lub M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy). W ten sposób otrzymuje się „roztwór ładujący” zawierający około 30 μM di-8-ANEPPS i 0,05% pluroniku. W przypadku innych typów komórek zamiast SMEM można zastosować ich natywne pożywki hodowlane.
2. Wymień pożywkę hodowlaną w komorze Lab-Tek na roztwór ładujący. Przenieś komorę do lodówki na 10 min w temperaturze 4°C. W tej temperaturze internalizacja barwnika przez błonę plazmatyczną jest w znacznym stopniu zahamowana.
3. Po barwieniu delikatnie wypłucz nadmiar barwnika dwa lub trzy razy czystą pożywką SMEM.
4. Pozostaw w komorze 1,5 ml SMEM.

Część III: Eksperyment i akwizycja obrazu

1. Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (w naszym przypadku Zeiss AxioVert 200, Zeiss, Niemcy) wyposażonego w obiektyw imersyjny olejowy (x63, NA 1.4), monochromator (Polychrome IV, Visitron, Niemcy) oraz chłodzoną kamerę CCD (VisiCam 1280, Visitron, Niemcy). Obrazy są pozyskiwane za pomocą oprogramowania MetaFluor 7.1.1 i przetwarzane w MetaMorph 7.1.1 (oba od Molecular Devices, Downingtown, PA, USA), jednak można również użyć innego podobnego oprogramowania do akwizycji. W oprogramowaniu do akwizycji należy ustawić długość fali wzbudzenia na 490 nm i wybrać odpowiedni filtr emisji dla ANEPPS, na przykład filtr pasmowy centrowany na 605 nm (605/55m, dichroic 565 DCXR, Chroma, Rockingham, VT, USA). W przypadku braku monochromatora można zamiast niego zastosować filtr wzbudzenia centrowany na 490 nm.
2. Komorę z komórkami należy umieścić na stoliku mikroskopu, ustawić elektrody na dnie komory i podłączyć je do generatora impulsów. Elektrody powinny być przykryte medium.
3. Aby zachować żywotność komórek i ograniczyć nagrzewanie, impuls powinien mieć dostatecznie niską amplitudę i krótki czas trwania. W tym eksperymencie impuls prostokątny o amplitudzie 35 V i czasie trwania 50 ms (wystarczająco niskiej, aby uniknąć elektroporacji) jest generowany przy użyciu zasilacza DC i specjalnie wykonanego urządzenia przełączającego sterowanego mikroprocesorem. Alternatywnie można użyć komercyjnego generatora impulsów, takiego jak 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, USA) podłączonego do wzmacniacza lub komercyjnego stymulatora, takiego jak S88 (Grass, West Warwick, RI, USA). Impuls jest dostarczany do dwóch równoległych elektrod z drutu Pt/Ir o średnicy 0.8 mm i odległości 4 mm między nimi, co tworzy pole elektryczne o natężeniu około 88 V/cm między elektrodami i indukuje ΔΦ. Dokładny rozkład pola między elektrodami użytymi w tym eksperymencie został opisany w innym opracowaniu [1].
4. Należy odnaleźć interesujące komórki. Następnie przykłada się pojedynczy impuls elektryczny lub sekwencję impulsów. Dla każdego impulsu należy pozyskać dwa obrazy fluorescencyjne: jeden bezpośrednio przed impulsem (obraz kontrolny) i jeden w trakcie impulsu (obraz impulsowy). Ze względu na słabą odpowiedź di-8-ANEPPS, zmiany w fluorescencji są trudne do zauważenia gołym okiem i stają się widoczne dopiero po przetworzeniu. Dostarczanie impulsu musi być zsynchronizowane z akwizycją obrazu, co jest funkcją oprogramowania do akwizycji. Aby uniknąć fotoblaknięcia i ewentualnego nagrzewania, oświetlenie można ograniczyć do czasu trwania impulsu.

Część IV: Przetwarzanie i analiza obrazów

1. Otwórz obrazy w oprogramowaniu MetaMorph. Dla każdego impulsu odejmij tło zarówno z obrazu kontrolnego, jak i z obrazu po impulsie.
2. Wybierz komórkę i ustaw obszar zainteresowania (ROI) tak, aby odpowiadał on błonie. Zmierz natężenie fluorescencji wzdłuż tego obszaru na obrazie kontrolnym i po impulsie, a następnie przenieś wartości do arkusza kalkulacyjnego.
3. Dla każdego impulsu odejmij dane kontrolne od danych po impulsie, a wynik podziel przez dane kontrolne, aby uzyskać względne zmiany fluorescencji. W przypadku zastosowania sekwencji impulsów można wyciągnąć średnią z wartości względnych zmian fluorescencji wyznaczonych dla każdego impulsu, aby uzyskać bardziej wiarygodny pomiar.
4. Przekształć względne zmiany fluorescencji na ΔΦ, korzystając z krzywej kalibracyjnej. Wstępne oszacowanie tej krzywej można znaleźć w literaturze, jednak dla uzyskania wyższej dokładności musi ona zostać zmierzona dla każdego konkretnego układu. Dla komórek i układu zastosowanego w tym eksperymencie spadek fluorescencji o 6% odpowiada wzrostowi ΔΦ o 100 mV [2].
5. Na koniec wykreśl napięcie jako funkcję względnej długości łuku w programie graficznym, takim jak Excel (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA), Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA) lub Origin (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA). Krzywą można również wygładzić za pomocą odpowiedniego filtra, np. filtra średniej ruchomej.

Dyskusja

Pomiary indukowanego napięcia błonowego (transbłonowego), ΔΦ, mogą być istotne w różnych układach eksperymentalnych, takich jak badania nad bramkowanymi napięciowo kanałami błonowymi, propagacja potencjału czynnościowego, stymulacja komórek serca lub elektroporacja błony komórkowej [3, 4, 5, 6, 7]. W przypadku prostych kształtów komórek ΔΦ można obliczyć analitycznie. Na przykład dla komórki sferycznej ΔΦ jest określone równaniem Schwana, zgodnie z którym napięcie jest proporcjonalne do natężenia pola i rozmiaru komórki i zgodnie z funkcją cosinus przebiega wzdłuż błony [8, 9]. W przypadku bardziej skomplikowanych kształtów komórek ΔΦ może znacząco odbiegać od funkcji cosinus i musi zostać wyznaczone numerycznie, przy użyciu komputera [2, 10, 11], lub eksperymentalnie, z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego [12, 13, 14, 15].

Jednym z szeroko stosowanych do tego celu barwników potencjometrycznych jest di-8-ANEPPS (di-8-butyl-amino-naphthyl-ethylene-pyridinium-propyl-sulfonate), szybki barwnik o widmach wzbudzenia i emisji zależnych od napięcia błony, co pozwala na nieinwazyjną obserwację zmian ΔΦ na błonie komórkowej oraz pomiar jego wartości. W tym filmie przedstawiamy podejście eksperymentalne do wyznaczania ΔΦ przy użyciu di-8-ANEPPS.

Barwnik ten został opracowany przez profesora Lesliego Loewa i współpracowników [13, 14] na Uniwersytecie Connecticut i należy do klasy barwników o szybkim czasie odpowiedzi. di-8-ANEPPS jest niefluorescencyjny w wodzie i staje się silnie fluorescencyjny po wbudowaniu się w lipidową dwuwarstwę błony komórkowej. Zmiana ΔΦ powoduje zmianę wewnątrzcząsteczkowego rozkładu ładunku i odpowiadające temu zmiany w profilu spektralnym oraz intensywności fluorescencji barwnika. Intensywność fluorescencji di-8-ANEPPS zmienia się proporcjonalnie do zmiany ΔΦ; odpowiedź barwnika jest liniowa dla napięć w zakresie od −280 mV do +250 mV [4, 16]. Stosunkowo niewielkie zmiany fluorescencji barwnika, nierównomierne barwienie błony oraz internalizacja barwnika sprawiają, że di-8-ANEPPS jest mniej odpowiedni do absolutnych pomiarów napięcia błonowego, np. jego składowej spoczynkowej, choć donoszono również o takich próbach [17]. Nadaje się on jednak do pomiaru większych zmian napięcia błonowego, takich jak początek indukowanego napięcia błonowego w komórkach niepobudliwych poddanych działaniu zewnętrznych pól elektrycznych [12, 13] lub potencjały czynnościowe w komórkach pobudliwych [4, 5]. Choć nie zastosowano tego w niniejszym protokole, di-8-ANEPPS umożliwia również wyznaczenie ΔΦ za pomocą ratiometrycznych pomiarów wzbudzenia fluorescencji [18] lub emisji [19], co zwiększa czułość odpowiedzi i redukuje wspomniane wcześniej efekty. Ponieważ di-8-ANEPPS barwi błonę, może być również stosowany po prostu jako marker błonowy [2].

Jedną z wad tego barwnika jest jego skłonność do fotoblaknięcia, dlatego należy unikać długotrwałej ekspozycji na silne światło. Kalibrację barwnika przeprowadza się albo za pomocą (i) jonoforu potasowego walinomycyny i zestawu różnych stężeń potasu w medium zewnętrznym [2,18], albo (ii) metody patch-clamp w trybie clampowania napięcia [17].

Na koniec, na podstawie pomiarów ΔΦ w komórkach sferycznych oraz komórkach o bardziej złożonych kształtach, w filmie zaprezentowano wpływ kształtu komórki na amplitudę i rozkład przestrzenny ΔΦ. Zatem dla komórek sferycznych ΔΦ jest bliskie funkcji cosinus, zgodnie z równaniem Schwana, natomiast dla bardziej złożonych kształtów komórek rozkład przestrzenny ΔΦ jest bardziej skomplikowany [20]...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
di-8-ANEPPS	Invitrogen	D-3167	potencjometryczny barwnik fluorescencyjny
pluronic	Invitrogen	P3000MP	ionofor potasu
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
SMEM	Sigma-Aldrich	M8167 lub M4767	podłoże Minimum Essential Medium w wersji Spinner
Ham-F12	Sigma-Aldrich	N4888	podłoże hodowlane
płodowa surowica cielęca	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
krystacylina	Pliva	625110	antybiotyk
gentamycyna	Sigma-Aldrich	G1397	antybiotyk
Lab-Tek II	Nalge Nunc international	155379	komora
zasilacz DC	Elektro-Automatik
przełącznik sterowany mikroprocesorowo	wykonanie własne
elektrody	wykonanie własne		Pt/Ir