Demonstracja izolacji rdzenia kręgowego noworodka myszy do badań elektrofizjologicznych.
Artykuł metodologiczny
Elektrofizjologia rdzenia kręgowego
Otwiera się w nowej karcie
W tym artykule
Podsumowanie
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Streszczenie
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Rdzeń kręgowy noworodka mysiego stanowi model do badania rozwoju obwodów neuronalnych oraz ruchu lokomocyjnego. Przedstawiamy metodę wypreparowania rdzenia kręgowego oraz przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego do kąpieli rejestracyjnej, stosowanego w badaniach nad lokomocją. Po wypreparowaniu brzuszne korzenie nerwowe rdzenia kręgowego mogą zostać podłączone do elektrody rejestrującej w celu zapisu sygnałów elektrofizjologicznych centralnego generatora wzorców znajdującego się w odcinku lędźwiowym rdzenia.
Protokół
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)1. Najpierw przygotowujemy 2L 10-krotnego roztworu zapasu aCSF bez magnezu i wapnia. Odczynniki podano w milimolach. Numery katalogowe odnoszą się do Sigma/Aldrich.
| 2 litry 10X aCSF (bez Mg lub Ca) | |||
| Odczynnik | mM | g/2L | Katalog |
| KCl | 40 | 5.96 | P-9333 |
| NaCl | 1280 | 149.61 | S-7653 |
| NaHCO3 | 210 | 35.28 | S-6297 |
| NaH2PO4 | 5 | 1.38 | S-9638 |
| Glukoza | 300 | 108.12 | D-9434 |
| Dopełnić wodą destylowaną do 2L | |||
Przygotujemy również 1M roztwory MgSO4 i CaCl2 w 50mL wody, aby umożliwić dostosowanie molowości w poszczególnych eksperymentach oraz zapewnić rozpuszczalność wapnia.
| Roztwory zapasowe 1M wapnia i magnezu | |||
| Odczynnik | M | g/50mL | Katalog |
| CaCl2 | 1 | 7.35 | C-5080 |
| MgSO4 | 1 | 12.33 | M-5921 |
Roztwór aCSF musi być napowietrzony karbogenem (95% O2/ 5% CO2), aby obniżyć pH przed dodaniem wapnia, w przeciwnym razie wapń ulegnie wytrąceniu.
| 1 litr aCSF | |
| Odczynnik | Tom |
| 10X aCSF | 100 ml |
| 1M CaCl22 | 1 ml (do preparatyki) 2 ml (do rejestracji) |
| 1M MgSO₄4 | 1 ml |
| Dodać ok. 800 ml wody destylowanej, napowietrzyć mieszanką carbogen przez 2 minuty przed dodaniem wapnia | |
| Dopełnić wodą destylowaną do 1 L. | |
Pompy, rurki i naczynia do sekcji powinny być płukane przed i po użyciu.
Sekcja
Podczas sekcji 1mM wapniowy aCSF powinien być stale napowietrzany karbogenem. aCSF można odsysać z butelki do szalki sekcyjnej oraz pompować ze szalki sekcyjnej z powrotem do butelki lub odprowadzać do odpadów. Do przeprowadzenia sekcji używamy szalki powleczonej elastomerem (Sylgard, Dow Corning).
Noworodka myszy szybko dekapituje się za pomocą ostrych nożyczek, a następnie wykonuje nacięcie nożyczkami przez brzuszna stronę klatki piersiowej i brzucha. Następnie przeprowadza się ewiscerację zwierzęcia. Ewiscerowaną mysz płucze się roztworem aCSF. Zwierzę zostaje następnie przypięte do naczynia sekcyjnego za pomocą szpilek entomologicznych wbijanych przez przednie kończyny oraz u podstawy ogona.
Kolumna kręgosłupa zostaje usunięta poprzez wykonanie brzusznej laminektomii. Kolumnę kręgosłupa przytrzymuje się małą pęsetą, a jedno ostrze małych nożyczek wprowadza się bezpośrednio grzbietowo względem kostnej kolumny kręgosłupa. Łuk kręgowy jest przecinany najpierw z jednej, a następnie z drugiej strony, przy jednoczesnym delikatnym unoszeniu kostnej kolumny kręgosłupa. Czynność tę powtarza się na całej długości kolumny kręgosłupa.
Rdzeń kręgowy usuwa się, wykonując nacięcia po obu jego stronach w celu przecięcia korzeni nerwów rdzeniowych oraz opon otaczających rdzeń kręgowy. Wykonujemy cięcia po lewej i prawej stronie, a następnie przecinamy opony przytwierdzone do strony grzbietowej rdzenia kręgowego, aby go uwolnić. Wyizolowany rdzeń zostaje następnie przypięty do naczynia w pobliżu wlotu aCSF, aby zapewnić odpowiednie natlenienie w przypadku sekcji kolejnych zwierząt.
Wyizolowany rdzeń kręgowy przenosi się następnie do naczynia rejestracyjnego za pomocą małej łyżeczki lub szpatułki. Następnie preparat perfunduje się natlenionym 2mM wapniowym aCSF. Rdzeń kręgowy zostaje przymocowany do naczynia powleczonego elastomerem, a za pomocą mikromanipulatorów przesuwa się zewnątrzkomórkowe elektrody ssące całego korzenia w pobliże korzeni. Gdy końcówka elektrody znajduje się blisko wolnego końca korzenia, stosuje się delikatne ssanie, aby wciągnąć korzeń do elektrody ssącej. Proces ten można powtórzyć w celu jednoczesnej rejestracji z kilku korzeni.
Rysunek 1. Dekapitacja i ewisceracja. A. Szybko wykonaj dekapitację myszy za pomocą ostrych nożyczek. W zależności od poziomu cięcia można uzyskać większy lub mniejszy stopień usunięcia pnia mózgu. B. Wprowadź jedno ostrze nożyczek w otwór klatki piersiowej powstały w wyniku dekapitacji. Otwórz brzusznie klatkę piersiową i jamę brzuszną aż do nasady ogona. Usuń wnętrzności i wypłucz je w aCSF.
Rycina 2. Usunięcie kolumny kręgosłupa. A. Wprowadź lewe ostrze nożyczek w przestrzeń między kolumną kręgosłupa a rdzeniem kręgowym po prawej stronie rdzenia i przetnij kości znajdujące się brzusznie względem rdzenia. Następnie wprowadź prawe ostrze nożyczek w przestrzeń między kolumną kręgosłupa a rdzeniem kręgowym po lewej stronie rdzenia i przetnij. B. Powtórz ten proces, delikatnie odciągając kolumnę kręgosłupa. Należy uważać, aby nie przebić rdzenia kręgowego, trzymając nożyczki pod niskim kątem.
Rycina 3. Usunięcie rdzenia kręgowego. A. Wprowadź lewe ostrze nożyczek w przestrzeń między rdzeniem kręgowym a kośćmi po jego prawej stronie i przetnij korzenie spinalne oraz opony znajdujące się bocznie względem rdzenia. Następnie wprowadź prawe ostrze nożyczek w przestrzeń między rdzeniem kręgowym a kośćmi po jego lewej stronie i przetnij korzenie spinalne oraz opony znajdujące się bocznie względem rdzenia. B. Na koniec ostrożnie unieś rostralną część rdzenia i przetnij opony łączące grzbietową część rdzenia z blaszkami łuków kręgów. Ponownie należy uważać, aby nie przebić rdzenia kręgowego, trzymając nożyczki pod niskim kątem. Nie należy przecinać korzeni zbyt blisko rdzenia kręgowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Izolowany rdzeń kręgowy noworodka stanowi przystępną metodę badania rozwoju układu nerwowego1,2. W lędźwiowym odcinku rdzenia kręgowego noworodków gryzoni obwody generujące centralne wzorce mogą wytwarzać lokomocję fikcyjną w obecności neuroprzekaźników. Lokomocja fikcyjna ta składa się z rytmicznych wzrostów aktywności, tzw. wyładowań (bursts), które występują z częstotliwością od 0.2 do 0.5 Hz. Wyładowania te są zorganizowane w taki sposób, aby wytworzyć naprzemienną aktywność lewo-prawo wzdłuż rdzenia oraz naprzemienn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
OPIEKA NAD ZWIERZĘTAMI
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez AIACUC The Salk Institute for Biological Studies.
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez AIACUC The Salk Institute for Biological Studies.
Podziękowania
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Samuel L. Pfaff jest profesorem w Laboratoriach Ekspresji Genów w Instytucie Badań Biologicznych Salka oraz badaczem w Howard Hughes Medical Institute. Praca ta była finansowana przez Fundację Christophera i Dany Reeve. Joe Belcovson, Kent Schnoeker oraz Mike Sullivan z działu Multimedia Resources w Instytucie Salka pomogli w zakresie fotografii i montażu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glukoza | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Nożyczki duże | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Pinceta | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Nożyczki precyzyjne | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Szpile entomologiczne | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| Kolba miarowa 1L | |||
| Kolba miarowa 100mL |
Bibliografia
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
- Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).
- Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).
- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie