Demonstracja izolacji rdzenia kręgowego noworodka myszy do badań elektrofizjologicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Elektrofizjologia rdzenia kręgowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rdzeń kręgowy noworodka mysiego stanowi model do badania rozwoju obwodów neuronalnych oraz ruchu lokomocyjnego. Przedstawiamy metodę wypreparowania rdzenia kręgowego oraz przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego do kąpieli rejestracyjnej, stosowanego w badaniach nad lokomocją. Po wypreparowaniu brzuszne korzenie nerwowe rdzenia kręgowego mogą zostać podłączone do elektrody rejestrującej w celu zapisu sygnałów elektrofizjologicznych centralnego generatora wzorców znajdującego się w odcinku lędźwiowym rdzenia.
Protokół
1. Przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)1. Najpierw przygotowujemy 2L 10-krotnego roztworu zapasowego aCSF bez magnezu i wapnia. Odczynniki podano w milimolach. Numery katalogowe odnoszą się do Sigma/Aldrich.
| 2 litry 10X aCSF (bez Mg lub Ca) | |||
| Odczynnik | mM | g/2L | Katalog |
| KCl | 40 | 5.96 | P-9333 |
| NaCl | 1280 | 149.61 | S-7653 |
| NaHCO₃3 | 210 | 35.28 | S-6297 |
| NaH2PO4 | 5 | 1.38 | S-9638 |
| Glukoza | 300 | 108.12 | D-9434 |
| Dopełnić wodą destylowaną do 2 l | |||
Przygotujemy również roztwory 1M MgSO4 i CaCl2 w 50mL wody, aby umożliwić dostosowanie molarności w zależności od eksperymentu oraz zapewnić, że wapń pozostanie w roztworze.
| Roztwory zapasowe wapnia i magnezu 1M | |||
| Odczynnik | M | g/50 ml | Katalog |
| CaCl22 | 1 | 7.35 | C-5080 |
| MgSO₄4 | 1 | 12.33 | M-5921 |
Roztwór aCSF musi zostać napowietrzony karbogenem (95% O2/ 5% CO2) w celu obniżenia pH przed dodaniem wapnia, w przeciwnym razie wapń ulegnie wytrąceniu.
| 1 litr aCSF | |
| Odczynnik | Objętość |
| 10X aCSF | 100mL |
| 1M CaCl2 | 1 mL (do sekcji) 2mL (do rejestracji) |
| 1M MgSO4 | 1 mL |
| Dodać ~800 mL wody destylowanej, napowietrzyć karbogenem przez 2 minuty przed dodaniem wapnia | |
| Dopełnić wodą destylowaną do 1L. | |
Pompy, rurki oraz naczynia do sekcji powinny zostać wypłukane przed i po użyciu.
Sekcja
Podczas sekcji 1mM wapniowy aCSF powinien być stale napowietrzany karbogenem. Płyn aCSF można odsysać z butelki do szalki sekcyjnej i pompować z szalki sekcyjnej z powrotem do butelki lub odprowadzać do odpadów. Do przeprowadzenia sekcji używamy szalki powleczonej elastomerem (Sylgard, Dow Corning).
Noworodka myszy szybko uśmierca się poprzez gilotynowanie ostrymi nożyczkami, a następnie wykonuje nacięcie nożyczkami przez brzuszną stronę klatki piersiowej i brzucha. Następnie przeprowadza się ewakuację narządów wewnętrznych. Oczyszczoną mysz płucze się w aCSF. Zwierzę zostaje następnie przypięte do szalki sekcyjnej za pomocą szpilek entomologicznych wbijanych przez przednie kończyny oraz u nasady ogona.
Kolumnę kręgową usuwa się poprzez wykonanie brzusznej laminektomii. Kolumnę kręgową unieruchamia się małym pęsetem, a jedno ostrze małych nożyczek wprowadza się bezpośrednio grzbietowo w stosunku do kostnej kolumny kręgowej. Łuk kręgowy przecina się najpierw z jednej, a następnie z drugiej strony, delikatnie unosząc kostną kolumnę kręgową. Procedurę tę powtarza się na całej długości kolumny kręgowej.
Rdzeń kręgowy usuwa się, wykonując nacięcia po obu jego stronach w celu przecięcia korzeni nerwów rdzeniowych oraz opon otaczających rdzeń. Wykonujemy cięcia po lewej i prawej stronie, a następnie przecinamy opony przyczepione do grzbietowej strony rdzenia kręgowego, aby go uwolnić. Wyizolowany rdzeń zostaje następnie przypięty do naczynia w pobliżu wlotu aCSF, aby zapewnić odpowiednie natlenienie w przypadku sekcji kolejnych zwierząt.
Wyizolowany rdzeń kręgowy przenosi się następnie do naczynia rejestracyjnego za pomocą małej łyżeczki lub szpatułki. Przygotowany materiał perfunduje się utlenionym aCSF z 2mM wapnia. Rdzeń kręgowy jest przypięty do naczynia powleczonego elastomerem, a za pomocą mikromanipulatorów przesuwa się zewnątrzkomórkowe elektrody ssące całego korzenia w pobliże korzeni. Gdy końcówka elektrody znajduje się blisko wolnego końca korzenia, stosuje się delikatne ssanie, aby wciągnąć korzeń do elektrody ssącej. Proces ten można powtórzyć w celu jednoczesnej rejestracji z kilku korzeni.
Rycina 1. Dekapitacja i ewisceracja. A. Szybko przeprowadź dekapitację myszy za pomocą ostrych nożyczek. W zależności od poziomu cięcia można uzyskać większy lub mniejszy udział pnia mózgu. B. Wprowadź jedno ostrze nożyczek do otworu w jamie klatki piersiowej powstałego w wyniku dekapitacji. Otwórz brzuchną stronę klatki piersiowej i jamy brzusznej aż do nasady ogona. Usuń wnętrzności i wypłucz je w aCSF.
Rycina 2. Usunięcie kolumny kręgosłupa. A. Wprowadź lewe ostrze nożyczek w przestrzeń między kolumną kręgosłupa a rdzeniem kręgowym po prawej stronie rdzenia i przetnij kości znajdujące się brzusznie względem rdzenia. Następnie wprowadź prawe ostrze nożyczek w przestrzeń między kolumną kręgosłupa a rdzeniem kręgowym po lewej stronie rdzenia i przetnij. B. Powtarzaj ten proces, przykładając delikatną trakcję do kolumny kręgosłupa. Należy uważać, aby nie przebić rdzenia kręgowego, trzymając nożyczki pod niskim kątem.
Rysunek 3. Usunięcie rdzenia kręgowego. A. Wprowadź lewe ostrze nożyczek w przestrzeń między rdzeniem kręgowym a kośćmi po prawej stronie rdzenia i przetnij korzenie spinalne oraz oponę twardą znajdujące się bocznie od rdzenia. Następnie wprowadź prawe ostrze nożyczek w przestrzeń między rdzeniem kręgowym a kośćmi po lewej stronie rdzenia i przetnij korzenie spinalne oraz oponę twardą znajdujące się bocznie od rdzenia. B. Na koniec delikatnie unieś rostralną część rdzenia i przetnij opony łączące grzbietową część rdzenia z blaszkami łuków kręgów. Ponownie należy zachować ostrożność, aby nie przebić rdzenia kręgowego, trzymając nożyczki pod niskim kątem. Nie należy przecinać korzeni zbyt blisko rdzenia kręgowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Izolowany rdzeń kręgowy noworodka stanowi przystępną metodę badania rozwoju układu nerwowego1,2. W lędźwiowym odcinku rdzenia kręgowego noworodków gryzoni obwody generujące centralne wzorce mogą wytwarzać lokomocję fikcyjną w obecności neuroprzekaźników. Lokomocja fikcyjna ta składa się z rytmicznych wzrostów aktywności, tzw. wyładowań (bursts), które występują z częstotliwością od 0.2 do 0.5 Hz. Wyładowania te są zorganizowane w taki sposób, aby wytworzyć naprzemienną aktywność lewo-prawo wzdłuż rdzenia oraz naprzemienn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
OPIEKA NAD ZWIERZĘTAMI
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez AIACUC The Salk Institute for Biological Studies.
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez AIACUC The Salk Institute for Biological Studies.
Podziękowania
Samuel L. Pfaff jest profesorem w Laboratoriach Ekspresji Genów w Instytucie Badań Biologicznych Salka oraz badaczem w Howard Hughes Medical Institute. Praca ta była finansowana przez Fundację Christophera i Dany Reeve. Joe Belcovson, Kent Schnoeker oraz Mike Sullivan z działu Multimedia Resources w Instytucie Salka pomogli w zakresie fotografii i montażu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| KCl | P-9333 | ||
| NaCl | S-7653 | ||
| NaHCO3 | S-6297 | ||
| NaH2PO4 | S-9638 | ||
| Glukoza | D-9434 | ||
| CaCl2 | C-5080 | ||
| MgSO4 | M-5921 | ||
| Nożyczki duże | Fine Science Tools | 14070-12 | |
| Pinceta | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Nożyczki precyzyjne | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Szpile entomologiczne | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Sylgard 184 (Dow-Corning) | |||
| Kolba miarowa 1L | |||
| Kolba miarowa 100mL |
Bibliografia
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Goulding, M., Pfaff, S. L. Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).
- Gallarda, B. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, (2008).
- Gosgnach, S. V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs. Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).
- Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements. Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).
- Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks. Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).
- Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons. J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).
- Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord. J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).
- Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity. J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
