Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Podsumowanie

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Streszczenie

Białka błony komórkowej stanowią dużą i zróżnicowaną grupę białek, w skład której wchodzą receptory, kanały jonowe, transportery oraz pompy. Aktywność tych białek odpowiada za szereg kluczowych zdarzeń komórkowych, w tym dostarczanie składników odżywczych, pobudliwość komórkową oraz sygnalizację chemiczną. Wiele białek błony komórkowej jest dynamicznie regulowanych poprzez transport endocytyczny, który moduluje funkcję białek poprzez zmianę ich ekspresji powierzchniowej. Mechanizmy ułatwiające endocytozę białek są złożone i w przypadku wielu białek błonowych nie są w pełni poznane. Aby w pełni zrozumieć mechanizmy kontrolujące transport endocytyczny danego białka, kluczowe jest precyzyjne zmierzenie tempa jego endocytozy. W przypadku wielu receptorów bezpośrednie pomiary tempa endocytozy są często przeprowadzane z wykorzystaniem znakowanych ligandów receptorowych. Jednakże dla wielu klas białek błonowych, takich jak transportery, pompy i kanały jonowe, nie istnieje wygodny ligand, który można by wykorzystać do pomiaru tempa endocytozy. W niniejszym raporcie opisujemy metodę odwracalnej biotinylacji, którą stosujemy do pomiaru tempa endocytozy transportera dopaminy (DAT). Metoda ta zapewnia prosty sposób pomiaru tempa internalizacji i może być łatwo zastosowana w badaniach transportu większości białek błonowych.

Protokół

Przegląd procedury:

Stosując tę metodę, białka powierzchniowe komórek są kowalencyjnie znakowane biotyną na dostępnych zewnątrzkomórkowych resztach lizyny przy użyciu nieprzenikającego przez błonę odczynnika do biotynylacji z wiązaniem disiarczkowym (sulfo-NHS-SS-biotin) w warunkach ograniczających transport (t.j. w niskiej temperaturze) (patrz ryc. 1). Jedna grupa komórek jest przenoszona do warunków umożliwiających transport (37°C), co prowadzi do internalizacji zabiotynilowanych białek. Druga grupa komórek jest utrzymywana w niskiej temperaturze jako kontrola dla 1) całkowitej zawartości białek powierzchniowych w czasie t=0 oraz 2) kontroli usuwania znakowania (strippingu). Po krótkim okresie internalizacji komórki są ponownie przenoszone do niskiej temperatury, aby zatrzymać ten proces, a pozostała na powierzchni biotyna jest usuwana poprzez potraktowanie komórek czynnikiem redukującym, który rozrywa wiązanie disiarczkowe biotyny. Zabiotynilowane białka, które pochodziły z powierzchni komórki i zostały zinternalizowane, są chronione przed etapem usuwania znakowania i będą jedynymi pozostałymi zabiotynilowanymi białkami. Po lizie komórek białka zabiotynilowane są izolowane za pomocą chromatografii powinowactwa do streptawidyny, a białko będące przedmiotem zainteresowania jest wykrywane za pomocą ilościowego immunoblottingu. Aby wyznaczyć szybkość endocytozy, ilość zinternalizowanego białka porównuje się z całkowitą kontrolą powierzchniową znakowaną w czasie t=0. Z sukcesem zastosowaliśmy tę metodę do pomiaru szybkości internalizacji neuronalnych transporterów norepinefryny¹ oraz dopaminy^1-4.

Szczegółowy protokół:

Dzień 1:

1. Wysiej komórki na płytki 6-dołkowe w taki sposób, aby w 2. dniu osiągnęły ok. 80% konfluencji. Alternatywnie, w przypadku użycia komórek transfekowanych, przeprowadź transfekcję przy gęstości zapewniającej ok. 80% konfluencji w momencie pomiaru szybkości internalizacji. Jeśli komórki nie wykazują silnej adhezji, naczynia do hodowli tkankowej należy pokryć substratem wspomagającym adhezję komórek (np. poli-D-lizyną), aby zapobiec ich utracie podczas wielokrotnych etapów płukania.
2. Dla każdego testowanego białka wysiej w jednej płytce 2 dołki, które posłużą jako kontrola całkowitego białka powierzchniowego (t=0) oraz kontrola usuwania biotynylacji (stripping). W drugiej płytce wysiej jeden dołek dla każdego testowanego warunku internalizacji (np. podstawowa szybkość endocytozy w porównaniu z próbą traktowaną lekiem).
3. Przygotuj następujące roztwory i przechowuj je w indicated temperaturach do użycia w 2. dniu:
   • PBS²⁺: solanka fosforanowa (pH 7.4) uzupełniona o 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM CaCl₂, (4°C)
   • Roztwór do gaszenia biotynylacji: PBS²⁺ uzupełniony o 100 mM glicyny, (4°C)
   • Bufor NT: 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.2% BSA, 20 mM Tris, pH 8.6, (4°C)
   • Bufor RIPA: 10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.1% SDS, 1.0% Triton X 100, 1.0% dejksycholan sodu, (4°C)
   • Roztwór zapasowy Sulfo-NHS-SS-biotyny: rozpuścić w dimetylosulfotlenku (DMSO) do stężenia 200 mg/ml, (-20°C)
   • Roztwór zapasowy hydrochlorku Tris(2-karboksyetylu) fosfiny (TCEP): 500 mM w H₂O, (-20°C, owinięty folią w celu ochrony przed światłem)

Dzień 2:

1. Przygotować PBS²⁺ uzupełniony o 0,18 g/ml glukozy i 0,2% IgG/albuminy surowicy bydlęcej wolnej od proteaz (PBS²⁺/g/BSA). Roztwór ten należy uprzednio ogrzać do 37°C w łaźni wodnej.
2. Rozmrozić roztwór zapasowy sulfo-NHS-SS-biotyny na blacie laboratoryjnym, aby rozpuścić DMSO. Bezpośrednio przed użyciem przygotować świeży roztwór sulfo-NHS-SS-biotyny (2,5 mg/ml w lodowatym PBS²⁺, w ilości wystarczającej na 0,75 ml/dołek). Roztwór energicznie wymieszać w wortexie, aby rozpuścić DMSO. Należy pamiętać, że odczynnik NHS-biotyna ulega łatwej hydrolizie w roztworach wodnych. Dlatego wszystkie roztwory należy przygotowywać bezpośrednio przed użyciem.
3. Biotynylacja: Płytki umieścić w łaźni lodowej w pomieszczeniu chłodniczym i przepłukać 3 x 2 ml lodowatym PBS²⁺. Należy upewnić się, że płytki są lekko nachylone, aby umożliwić całkowite odprowadzenie i usunięcie roztworu buforu. Do każdego dołka dodać 0,75 ml świeżego roztworu sulfo-NHS-SS-biotyny. Inkubować przez 15', 4°C w łaźni lodowej przy energicznym wytrząsaniu. Po zakończeniu inkubacji przygotować kolejny świeży roztwór sulfo-NHS-SS-biotyny. Zastąpić stary roztwór świeżym i inkubować przez 15', 4°C.
4. Wygaszanie: Krytyczne jest wygaszenie wszystkich niereagujących cząsteczek NHS-biotyny, aby nie reagowały one z białkami wewnątrzkomórkowymi i nie powodowały ich biotynylacji po lizie komórek. Komórki przemyć 3 x 2 ml roztworem wygaszającym i inkubować dwukrotnie w 2 ml roztworu wygaszającego przez 15', 4°C przy delikatnym wytrząsaniu.
5. Internalizacja: W przypadku testowania działania leków, do PBS²⁺/g/BSA dodać odpowiednie stężenie leku. Płytkę kontrolną przechowywać w 4°C, a płytkę do internalizacji wyjąć z pomieszczenia chłodniczego. Przemyć 3 x 2 ml uprzednio ogrzanym PBS²⁺/g/BSA (+/- leki) i pozostawić w tych samych roztworach (2 ml/dołek). Dowolne puste dołki wypełnić ogrzanym roztworem, aby zapewnić równomierną temperaturę na całej płytce. Przenieść komórki do inkubatora 37°C na 10'. Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji w 37°C przygotować świeży roztwór TCEP 50 mM w buforze NT, który zostanie użyty w etapie usuwania (strippingu), i przechowywać na lodzie. Przygotować ilość wystarczającą na 1,0 ml/dołek.
6. Usuwanie (Stripping): Natychmiast przenieść płytkę(i) do łaźni lodowej i zwrócić do pomieszczenia chłodniczego. Szybko przemyć komórki lodowatym buforem NT (3 x 2 ml), aby zatrzymać endocytozę. Dołki kontrolne do strippingu również przemyć 3 x 2 ml buforem NT. Do każdego dołka dodać 1,0 ml świeżego roztworu do strippingu. Inkubować na lodzie przez 15', 4°C przy delikatnym wytrząsaniu. Wymienić roztwór w dołkach na świeży roztwór do strippingu i inkubować przez kolejne 15', 4°C na lodzie.
7. Liza: Wszystkie dołki eksponowane na roztwór do strippingu przemyć 3 x 2 ml buforem NT. Następnie wszystkie dołki (łącznie z kontrolami całkowitymi) przemyć 3 x 2 ml PBS²⁺. Wykonać lizę w 300 μl/dołek buforu RIPA (lub innego buforu do lizy kompatybilnego z badanym białkiem) zawierającego świeże inhibitory proteaz (1,0 mM PMSF, po 1,0 μg/ml leupeptyny, aprotininy i pepstatyny). Lizę przeprowadzić przez wytrząsanie przez 20', 4°C. Przenieść do probówek do mikrowirówki i usunąć szczątki komórkowe poprzez wirowanie przy 18 000 x g przez 10', 4°C.
8. Oznaczanie stężenia białka: Użyć testu białkowego kompatybilnego z warunkami lizy (np. test białkowy DC, Bio-Rad), aby określić stężenie białka w lizatach w odniesieniu do standardowej krzywej BSA.
9. Chromatografia powinowactwa do streptawidyny: Przygotować probówki do mikrowirówki z równymi ilościami białka dla każdej próbki. Dodać bufor do lizy, aby doprowadzić końcową objętość każdej próbki do 200 μl. Kulki agarozy ze streptawidyną energicznie wymieszać w wortexie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Używając pipety 200 μl z odciętą końcówką, nanieść kulki do każdej probówki. Zalecane 20 μl kulek na 50 μg lizatu. Inkubować przez noc w 4°C na rotatorze do probówek.

Dzień 3:

1. Przemywanie kulek: Wirować próbki z prędkością 18,000 x g przez 2' w celu zebrania kulek. Odessać lizat, uważając, aby nie zbliżyć aspiratora do osadu z kulek. Aby uzyskać lepszą kontrolę, na końcu aspiratora należy zastosować plastikowy końcówkę do pipety. Do każdej probówki dodać 0,75 ml buforu do lizy i wymieszać w wortexie, aby przemyć kulki. Wirować próbki z prędkością 18,000 x g przez 2' w celu zebrania kulek i powtórzyć proces odsysania oraz przemywania dwukrotnie (łącznie trzy przemycia). Po ostatnim przemyciu odessać jak najwięcej buforu, nie naruszając osadu z kulek. Przechylenie probówki w stronę aspiratora ułatwia ten etap.
2. Elucja próbki: Do każdej probówki dodać 20-25 μl 2x buforu do próbek Laemmli (redukujący). Środek redukujący spowoduje rozszczepienie mostka disiarczkowego NHS-SS-biotyny, uwalniając wyizolowane białka do roztworu. Większość białek błonowych jest bardzo podatna na agregację podczas gotowania i nie powinna być podgrzewana przed nałożeniem na żele do SDS-PAGE. Przed przeprowadzeniem tych eksperymentów należy określić wrażliwość białka docelowego na ciepło. Jeśli białko nie toleruje gotowania/podgrzewania, inkubować na rotatorze przez 30' w temperaturze pokojowej przed analizą metodą SDS-PAGE. Jest to wystarczające do rozszczepienia mostka disiarczkowego i elucji białek.
3. SDS-PAGE i immunoblotting: Rozdzielić białka metodą SDS-PAGE. W przypadku każdej próbki najłatwiej jest prowadzić analizę w następującej kolejności: całkowita powierzchnia (czas=0), strip, warunek internalizacji nr 1, warunek nr 2 itd. Przenieść białka na membranę do immunoblottingu i przeprowadzić detekcję za pomocą odpowiedniego przeciwciała przeciwko białku docelowemu. Przechwycić immunoreaktywne prążki za pomocą systemu dokumentacji żeli z kamerą CCD, upewniając się, że nie występują nasycone piksele. Ilościowo określić gęstość każdego prążka za pomocą oprogramowania do analizy żeli/densytometrii.

Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywny wynik immunoblotingu przedstawiono na rysunku 2A. Najsilniejszy sygnał znajduje się w ścieżce „całkowitej” (T), która odpowiada całkowitej ilości białka powierzchniowego przed internalizacją. Kontrola „strippingu” (S) powinna być w idealnym przypadku bliska pustej, co dowodzi, że proces strippingu był efektywny w danym eksperymencie. Efektywność strippingu oblicza się, porównując gęstość sygnału w ścieżce „stripping” do gęstości w ścieżce „całkowitej” (np. białko, które zostałoy biotynilowane równolegle z procesem strippingu, ale nie było ogrzewane do 37°C ani nie wystawiano go na działanie roztworu do strippingu). Stosuje się następujący wzór:

[1-(strip/total)]*100%

Stosując ten wzór, efektywność paska na rysunku 2 wyniosła 99,8%. W końcowym etapie w ścieżce(ach) internalizacji (I) widoczne będą prążki o mniejszym natężeniu niż całkowite. W przykładzie (rysunek 2) komórki poddano działaniu nośnika lub 1μM octanu mirystylianu forbolu (PMA) podczas 10' internalizacji, a szybkości internalizacji transportera dopaminy zmierzono dla 10' początkowego okresu internalizacji. Szybkość internalizacji oblicza się w następujący sposób:

internalizacja/całkowita*100

Jak pokazano na rysunku 2B, w warunkach z zastosowaniem nośnika 10,4% powierzchniowego DAT uległo internalizacji w ciągu 10'. Leczenie PMA zwiększyło wskaźnik internalizacji DAT do 23,2% całkowitego DAT powierzchniowego.

Rysunek 1. Ilustracja protokołu. Komórki poddawane są biotynylacji w temperaturze 4°C w celu wyłącznego znakowania populacji powierzchniowej, a następnie przenoszone są do temperatury 37°C, aby zainicjować internalizację. Po internalizacji komórki są szybko schładzane w celu zatrzymania procesów endocytozy, a pozostała biotyna powierzchniowa jest usuwana poprzez traktowanie komórek czynnikiem redukującym. Jedynymi białkami biotynylowanymi, które pozostają, są te, które znajdowały się na powierzchni w czasie t=0 i zostały zinternalizowane, co chroni je przed procesem usuwania biotyny. Biotynylowane białka są izolowane za pomocą seryjnej chromatografii powinowactwa z użyciem kulek streptawidyny, a interesujące białko jest wykrywane za pomocą immunoblottingu.

Rysunek 2. Aktywacja PKC zwiększa szybkość endocytozy DAT. Test internalizacji. Komórki PC12 stabilnie wyrażające DAT poddano biotinylacji w 4°C zgodnie z opisem w sekcji „Detailed Protocol”. Komórki szybko ogrzano do 37°C ±1 μM PMA i inkubowano przez 10' w 37°C. Pozostałą biotynę usunięto poprzez redukcję, komórki zlizowano, a biotinylowane białka wyizolowano za pomocą chromatografii powinowactwa z użyciem streptawidyny. (A) Reprezentatywny immunoblot obrazujący całkowitą ilość DAT na powierzchni w t=0 (T), kontrolę po usunięciu biotyny (S) oraz zinternalizowany DAT (I) w określonych warunkach. (B) Prążki zarejestrowano za pomocą kamery CCD i poddano kwantyfikacji przy użyciu oprogramowania Quantity Data (Bio-Rad). Dane przedstawiono jako % całkowitego DAT zinternalizowanego w ciągu 10 min.

Rycina 3. Przykładowy immunoblot przedstawiający niepełne usuwanie biotyny. Test internalizacji. Komórki PC12 stabilnie eksponujące DAT poddano biotynilacji w 4°C, zgodnie z opisem w sekcji „Detailed Protocol”. Komórki szybko ogrzano do 37°C i inkubowano przez 10', 37°C. Pozostałą biotynę usunięto poprzez redukcję, komórki zlizowano, a biotynilowane białka wyizolowano za pomocą chromatografii powinowactwa do streptawidyny. Immunoblot przedstawia całkowitą ilość DAT na powierzchni w t=0 (T), kontrolę usuwania biotyny (S) oraz zinternalizowany DAT (I). Zwróć uwagę na widoczny prążek w ścieżce kontroli usuwania biotyny, co wskazuje na niską wydajność procesu usuwania.

Dyskusja

Typowe problemy: Najczęstszym problemem występującym w tych eksperymentach jest niska wydajność usuwania białek z powierzchni (strip efficiency). Wydajność tego procesu jest kluczowa dla możliwości interpretacji wyników. Jeśli usuwanie białek nie było wysoce wydajne, nie można wyciągnąć wniosku, że jakiekolwiek biotynilowane białka w ścieżkach internalizacji zostały faktycznie zinternalizowane z powierzchni. Optymalna wydajność wynosi ≥90% i odrzucamy wszelkie wyniki, jeśli wskaźnik ten spadnie poniżej tego poziom...