Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Podsumowanie

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Streszczenie

Białka błony komórkowej stanowią dużą i zróżnicowaną grupę białek, w skład której wchodzą receptory, kanały jonowe, transportery oraz pompy. Aktywność tych białek odpowiada za szereg kluczowych zdarzeń komórkowych, w tym dostarczanie składników odżywczych, pobudliwość komórkową oraz sygnalizację chemiczną. Wiele białek błony komórkowej jest dynamicznie regulowanych poprzez transport endocytyczny, który moduluje funkcję białek poprzez zmianę ich ekspresji powierzchniowej. Mechanizmy ułatwiające endocytozę białek są złożone i w przypadku wielu białek błonowych nie są w pełni poznane. Aby w pełni zrozumieć mechanizmy kontrolujące transport endocytyczny danego białka, kluczowe jest precyzyjne zmierzenie tempa jego endocytozy. W przypadku wielu receptorów bezpośrednie pomiary tempa endocytozy są często przeprowadzane z wykorzystaniem znakowanych ligandów receptorowych. Jednakże dla wielu klas białek błonowych, takich jak transportery, pompy i kanały jonowe, nie istnieje wygodny ligand, który można by wykorzystać do pomiaru tempa endocytozy. W niniejszym raporcie opisujemy metodę odwracalnej biotinylacji, którą stosujemy do pomiaru tempa endocytozy transportera dopaminy (DAT). Metoda ta zapewnia prosty sposób pomiaru tempa internalizacji i może być łatwo zastosowana w badaniach transportu większości białek błonowych.

Protokół

Przegląd procedury:

Stosując to podejście, białka powierzchni komórki są kowalencyjnie znakowane biotyną w dostępnych pozakomórkowych resztach lizyny przy użyciu nieprzenikającego przez błonę odczynnika do biotynylacji z wiązaniem dwusiarczkowym (sulfo-NHS-SS-biotin) w warunkach ograniczających transport (tzn. w niskiej temperaturze) (ilustracja na Rys. 1). Jedną grupę komórek przenosi się do warunków dopuszczających transport (37°C), co prowadzi do internalizacji biotynylowanych białek. Drugą grupę komórek utrzymuje się w niskiej temperaturze jako kontrolę dla: 1) całkowitej zawartości białek powierzchniowych w czasie t=0 oraz 2) kontroli usuwania biotyny (strippingu). Po krótkim okresie internalizacji komórki ponownie przenosi się do niskiej temperatury, aby zatrzymać ten proces, a następnie usuwa się pozostałą biotynę z powierzchni poprzez potraktowanie komórek czynnikiem redukującym, który rozrywa wiązanie dwusiarczkowe biotyny. Biotynylowane białka, które pochodziły z powierzchni komórki i zostały zinternalizowane, są chronione przed etapem usuwania biotyny i będą jedynymi pozostałymi białkami biotynylowanymi. Po lizie komórek białka biotynylowane izoluje się za pomocą chromatografii powinowactwa ze streptawidyną, a poszukiwane białko wykrywa metodą ilościowego immunoblottingu. Aby określić tempo endocytozy, ilość zinternalizowanego białka porównuje się z kontrolą całkowitej zawartości białek powierzchniowych znakowanych w czasie t=0. Z sukcesem zastosowaliśmy to podejście do pomiaru tempa internalizacji neuronalnych transporterów norepinefryny¹ i dopaminy^1-4.

Szczegółowy protokół:

Dzień 1:

1. Wysiać komórki na płytki 6-dołkowe w taki sposób, aby w 2. dniu osiągnęły około 80% konfluencji. Alternatywnie, w przypadku użycia komórek transfekowanych, przeprowadzić transfekcję przy gęstości zapewniającej około 80% konfluencji w momencie pomiaru szybkości internalizacji. Jeśli komórki nie wykazują silnej adhezji, naczynia do hodowli tkanek należy poddać obróbce substratem adhezyjnym (np. poli-D-lizyną), aby zapobiec utracie komórek podczas etapów intensywnego płukania.
2. Dla każdego testowanego białka wysiać komórki do 2 dołków na jednej płytce, które posłużą jako kontrola całkowitego białka powierzchniowego (t=0) oraz kontrola strippingu. Na drugiej płytce wysiać komórki do jednego dołka dla każdego badanego warunku internalizacji (np. podstawowa szybkość endocytozy w porównaniu z szybkością po zastosowaniu leku).
3. Przygotować następujące roztwory i przechowywać je w indicated temperaturach do użycia w 2. dniu:
   • PBS²⁺: roztwór soli fizjologicznej fosforanowej (pH 7.4) uzupełniony o 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM CaCl₂, (4°C)
   • Roztwór do wygaszania biotynylacji: PBS²⁺ uzupełniony o 100 mM glicyny, (4°C)
   • Bufor NT: 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.2% BSA, 20 mM Tris, pH 8.6, (4°C)
   • Bufor RIPA: 10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.1% SDS, 1.0% Triton X 100, 1.0% dejksycholan sodu, (4°C)
   • Roztwór zapasowy Sulfo-NHS-SS-biotyny: rozpuścić w dimetylosulfoksydzie (DMSO) do stężenia 200 mg/ml, (-20°C)
   • Roztwór zapasowy chlorowodorku Tris(2-karboksyetylu) fosfiny (TCEP): 500 mM w H₂O, (-20°C, owinięty w folię w celu ochrony przed światłem)

Dzień 2:

1. Przygotować PBS²⁺ uzupełniony o 0,18 g/ml glukozy oraz 0,2% IgG/wołowiej albuminy bez proteazy (PBS²⁺/g/BSA). Roztwór ten należy uprzednio ogrzać do 37°C w łaźni wodnej.
2. Rozmrozić roztwór stokowy sulfo-NHS-SS-biotyny na blacie laboratoryjnym, aby rozpuścić DMSO. Bezpośrednio przed użyciem przygotować świeży roztwór sulfo-NHS-SS-biotyny (2,5 mg/ml w lodowatym PBS²⁺, w ilości wystarczającej na 0,75 ml/dołek). Roztwór energicznie wymieszać w wirówce typu vortex w celu rozpuszczenia DMSO. Należy pamiętać, że odczynnik NHS-biotyna ulega łatwej hydrolizie w roztworach wodnych, dlatego wszystkie roztwory należy przygotowywać bezpośrednio przed użyciem.
3. Biotynylacja: Płytki umieścić w łaźni lodowej w pomieszczeniu chłodniczym i przepłukać 3 x 2 ml lodowatym PBS²⁺. Należy upewnić się, że płytki są ustawione pod lekkim kątem, aby umożliwić całkowite odlanie i usunięcie roztworu buforu. Do każdego dołka dodać 0,75 ml świeżego roztworu sulfo-NHS-SS-biotyny. Inkubować przez 15', 4°C w łaźni lodowej przy energicznym wstrząsaniu. Po zakończeniu inkubacji przygotować kolejny świeży roztwór sulfo-NHS-SS-biotyny. Stary roztwór zastąpić świeżym i inkubować przez kolejne 15', 4°C.
4. Wygaszanie (quenching): Kluczowe jest wygaszenie wszystkich niereagujących cząsteczek NHS-biotyny, aby nie reagowały one z białkami wewnątrzkomórkowymi i nie powodowały ich biotynylacji po lizie komórek. Komórki przemyć 3 x 2 ml roztworem wygaszającym i inkubować dwukrotnie w 2 ml roztworu wygaszającego przez 15', 4°C przy delikatnym wstrząsaniu.
5. Internalizacja: W przypadku testowania działania leków, do PBS²⁺/g/BSA dodać odpowiednie stężenie leku. Płytkę kontrolną pozostawić w temperaturze 4°C, a płytkę do internalizacji wyjąć z pomieszczenia chłodniczego. Przemyć 3 x 2 ml uprzednio ogrzanym PBS²⁺/g/BSA (+/- leki) i pozostawić w tych samych roztworach (2 ml/dołek). Puste dołki wypełnić ogrzanym roztworem, aby zapewnić równomierną temperaturę na całej płytce. Przenieść komórki do inkubatora 37°C na 10'. Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji w 37°C przygotować świeży roztwór TCEP 50 mM w buforze NT do etapu usuwania (strippingu) i przechowywać na lodzie. Przygotować ilość wystarczającą na 1,0 ml/dołek.
6. Usuwanie (stripping): Natychmiast przenieść płytkę(i) do łaźni lodowej i zwrócić do pomieszczenia chłodniczego. Szybko przemyć komórki lodowatym buforem NT (3 x 2 ml), aby zatrzymać endocytozę. Dołki kontrolne do usuwania również przemyć 3 x 2 ml buforem NT. Do każdego dołka dodać 1,0 ml świeżego roztworu do usuwania. Inkubować na lodzie przez 15', 4°C przy delikatnym wstrząsaniu. Roztwór w dołkach zastąpić świeżym roztworem do usuwania i inkubować przez dodatkowe 15', 4°C na lodzie.
7. Liza: Wszystkie dołki eksponowane na roztwór do usuwania przemyć 3 x 2 ml buforem NT. Następnie wszystkie dołki (w tym kontrole całkowite) przemyć 3 x 2 ml PBS²⁺. Przeprowadzić lizę w 300 μl/dołek buforu RIPA (lub innego buforu do lizy kompatybilnego z badanym białkiem) zawierającego świeże inhibitory proteaz (1,0 mM PMSF, 1,0 μg/ml leupeptyny, aprotininy i pepstatyny). Lizę przeprowadzić poprzez wstrząsanie przez 20', 4°C. Przenieść do probówek do mikrowirówki i usunąć szczątki komórkowe poprzez wirowanie przy 18 000 ×g przez 10', 4°C.
8. Oznaczanie stężenia białka: Użyć testu białkowego kompatybilnego z warunkami lizy (np. test białkowy DC, Bio-Rad), aby oznaczyć stężenie białka w lizatach w odniesieniu do krzywej wzorcowej BSA.
9. Chromatografia powinowactwa ze streptawidyną: Przygotować probówki do mikrowirówki z równą ilością białka dla każdej próbki. Dodać bufor do lizy, aby doprowadzić końcową objętość każdej próbki do 200 μl. Kulki agarozowe ze streptawidyną energicznie wymieszać w wirówce typu vortex do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Używając pipety 200 μl z odciętą końcówką, nanieść kulki do każdej probówki. Zalecane proporcje to 20 μl kulek / 50 μg lizatu. Inkubować przez noc, 4°C na rotatorze do probówek.

Dzień 3:

1. Przemywanie kulek: Wirować próbki z prędkością 18,000 x g przez 2' w celu zebrania kulek. Odessać lizat, uważając, aby aspirator nie zbliżył się do osadu kulek. Aby uzyskać lepszą kontrolę, na końcu aspiratora należy zastosować plastikowy końcówkę do pipety. Do każdej probówki dodać 0,75 ml buforu do lizy i wymieszać w wstrząsaciu typu vortex, aby przemyć kulki. Wirować próbki z prędkością 18,000 x g przez 2' w celu zebrania kulek, a następnie powtórzyć etap odsysania i przemywania dwukrotnie (łącznie trzy przemycia). Po ostatnim przemyciu odessać jak najwięcej buforu, nie naruszając osadu kulek. Przechylenie probówki w stronę aspiratora ułatwia ten krok.
2. Elucja próbek: Do każdej probówki dodać 20-25μl 2x buforu Laemmli do próbek (redukujący). Środek redukujący spowoduje rozszczepienie mostka dwusiarczkowego NHS-SS-biotyny, uwalniając wyizolowane białka do roztworu. Większość białek błonowych jest bardzo podatna na agregację podczas gotowania i nie powinna być podgrzewana przed nałożeniem na żele do SDS-PAGE. Przed przeprowadzeniem tych eksperymentów należy określić wrażliwość badanego białka na wysoką temperaturę. Jeśli białko nie toleruje gotowania/podgrzewania, należy inkubować je na rotatorze przez 30' w temperaturze pokojowej przed analizą metodą SDS-PAGE. Jest to wystarczające do rozszczepienia mostka dwusiarczkowego i elucji białek.
3. SDS-PAGE i immunoblotting: Rozdzielić białka metodą SDS-PAGE. W przypadku każdej próbki najłatwiej jest prowadzić analizę w następującej kolejności: całkowita powierzchnia (czas=0), strip, warunek internalizacji nr 1, warunek nr 2 itd. Przenieść białka na membranę do immunoblottingu i wykonać blot z użyciem odpowiedniego przeciwciała przeciwko badanemu białku. Przechwycić prążki immunoreaktywne za pomocą systemu dokumentacji żeli z kamerą CCD, upewniając się, że nie występują nasycone piksele. Ilościowo określić gęstość każdego prążka za pomocą oprogramowania do analizy żeli/densytometrii.

Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywny wynik immunoblottingu przedstawiono na Ryc. 2A. Najsilniejszy sygnał znajduje się w ścieżce „całkowita” (T), która reprezentuje całkowitą ilość białka powierzchniowego przed internalizacją. Kontrola „usuwania” (S) powinna być idealnie bliska pustej ścieżce, co świadczy o tym, że proces usuwania był efektywny dla danego eksperymentu. Efektywność usuwania oblicza się poprzez porównanie gęstości ścieżki „usuwania” z gęstością ścieżki „całkowitej” (np. białko, które zostało biotynilowane równolegle z procesem usuwania, ale nie było podgrzewane do 37°C ani nie zostało poddane działaniu roztworu do usuwania). Stosuje się następujący wzór:

[1-(strip/total)]*100%

Stosując ten wzór, wydajność paska na Rysunku 2 wyniosła 99,8%. Na koniec w ścieżce(zach) internalizacji (I) widoczne będą prążki o mniejszym natężeniu niż całkowite. W przykładzie (Rysunek 2) komórki traktowano nośnikiem lub 1μM octanu mirystanu forbolu (PMA) podczas 10-minutowej internalizacji, a szybkość internalizacji transportera dopaminy mierzono dla początkowego 10-minutowego okresu internalizacji. Szybkość internalizacji oblicza się w następujący sposób:

internalizowane/całkowite*100

Jak pokazano na rysunku 2B, w warunkach z zastosowaniem nośnika w ciągu 10' zinternalizowano 10,4% powierzchniowego DAT. Leczenie PMA zwiększyło stopień internalizacji DAT do 23,2% całkowitej ilości DAT na powierzchni.

Rycina 1. Ilustracja protokołu. Komórki poddawane są biotinylacji w 4°C w celu wyłącznego oznakowania populacji powierzchniowej, a następnie przenoszone do 37°C, aby zainicjować internalizację. Po internalizacji komórki są szybko schładzane w celu zatrzymania procesów endocytozy, a pozostała biotyna powierzchniowa jest usuwana poprzez traktowanie komórek czynnikiem redukującym. Jedynymi pozostałymi biotynylanymi białkami są te, które znajdowały się na powierzchni w czasie t=0 i zostały zinternalizowane, co chroni je przed procesem usuwania biotyny. Białka biotynylowane są izolowane za pomocą seryjnej chromatografii powinowactwa z użyciem kulek streptawidyny, a poszukiwane białko jest wykrywane metodą immunoblottingu.

Rysunek 2. Aktywacja PKC zwiększa tempo endocytozy DAT. Test internalizacji. Komórki PC12 stabilnie ekspresyjne dla DAT poddano biotinylacji w 4°C, zgodnie z opisem w sekcji „Detailed Protocol”. Komórki szybko ogrzano do 37°C ±1 μM PMA i inkubowano przez 10' w 37°C. Pozostałą biotynę usunięto poprzez redukcję, następnie komórki zlizowano, a biotinylowane białka wyizolowano za pomocą chromatografii powinowactwa do streptawidyny. (A) Reprezentatywny immunoblot pokazujący całkowitą ilość DAT na powierzchni w t=0 (T), kontrolę usuwania biotyny (S) oraz zinternalizowany DAT (I) w określonych warunkach. (B) Prążki zarejestrowano za pomocą kamery CCD i skwantyfikowano przy użyciu oprogramowania Quantity Data (Bio-Rad). Dane przedstawiono jako % całkowitego DAT zinternalizowanego w ciągu 10 min.

Rycina 3. Przykład immunoblottu przedstawiający niepełne usuwanie biotyny. Test internalizacji. Komórki PC12 stabilnie eksponujące DAT poddano biotynylacji w 4°C zgodnie z opisem w sekcji „Detailed Protocol”. Komórki szybko ogrzano do 37°C i inkubowano przez 10' w 37°C. Pozostałą biotynę usunięto poprzez redukcję, komórki poddano lizie, a biotynilowane białka wyizolowano za pomocą chromatografii powinowactwa ze streptawidyną. Immunoblot przedstawia całkowitą ilość DAT na powierzchni w t=0 (T), kontrolę usuwania biotyny (S) oraz zinternalizowany DAT (I). Widoczny prążek w ścieżce kontroli usuwania biotyny wskazuje na niską wydajność tego procesu.

Dyskusja

Typowe problemy: Najczęstszym problemem występującym w tych eksperymentach jest niska wydajność usuwania białek z powierzchni (strip efficiency). Wydajność tego procesu jest kluczowa dla możliwości interpretacji wyników. Jeśli usuwanie białek nie było wysoce wydajne, nie można wyciągnąć wniosku, że jakiekolwiek biotynilowane białka w ścieżkach internalizacji zostały faktycznie zinternalizowane z powierzchni. Optymalna wydajność wynosi ≥90% i odrzucamy wszelkie wyniki, jeśli wskaźnik ten spadnie poniżej tego poziom...