Enkapsulacja komórek nowotworowych w PuraMatrix

Podsumowanie

W tym filmie pokazano, jak enkapsulować i hodować komórki nowotworowe w PuraMatrix, dostępnym komercyjnie samoorganizującym się żelu peptydowym.

Streszczenie

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że hodowla komórek nowotworowych w trzech wymiarach dokładniej odtwarza złożoność biologii guza. Wiele z tych modeli wykorzystuje zrekonstytuowaną błonę podstawną pochodzenia zwierzęcego, która zawiera zmienną ilość czynników wzrostu i cytokin mogących wpływać na wzrost tych modeli hodowli komórkowych. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy przygotowanie i zastosowanie PuraMatrix, dostępnego komercyjnie samoorganizującego się żelu peptydowego, który jest wolny od materiałów pochodzenia zwierzęcego oraz patogenów, w celu enkapsulacji i namnażania linii komórkowej raka jajnika OVCAR-5. Rozpoczynamy od opisu sposobu przygotowania PuraMatrix przed użyciem. Następnie demonstrujemy, jak prawidłowo mieszać PuraMatrix z zawiesiną komórkową, aby enkapsulować komórki w hydrożelu. Po dodaniu pożywki do hodowli komórkowej lub wstrzyknięciu do środowiska fizjologicznego, komponent peptydowy PuraMatrix szybko samoorganizuje się w 3D hydrożel, który wykazuje włóknistą strukturę w skali nanometrów ze średnią wielkością porów wynoszącą 5-200 nm¹Dodatkowo demonstrujemy, jak propagować kultury hodowane w enkapsulowanym PuraMatrix. Po enkapsulacji w PuraMatrix komórki OVCAR-5 organizują się w trójwymiarowe struktury acinarne, które bardziej przypominają morfologię guzków mikroprzewlekłych obserwowanych w praktyce klinicznej niż jednowarstwowe modele in vitro. Za pomocą mikroskopii konfokalnej przedstawiamy wygląd reprezentatywnych komórek OVCAR-5 enkapsulowanych w PuraMatrix w 1., 3., 5. i 7. dniu po wysiewaniu. Wykorzystanie PuraMatrix do hodowli komórek nowotworowych powinno poprawić nasze zrozumienie choroby i pozwolić na ocenę odpowiedzi na leczenie w systemach modelowych o większej wartości prognostycznej klinicznie.

Protokół

Uwagi techniczne:

• Żelowanie jest inicjowane przez dodanie soli. Dlatego KLUCZOWE jest, aby żadne sole nie miały kontaktu z PuraMatrix do momentu, gdy pożądane jest żelowanie; ekspozycja na sole o bardzo niskiej sile jonowej (np. < 0,05 M) spowoduje nieodwracalną żelatynizację.
• Pozostałe przygotowane roztwory zapasowe mogą zostać wykorzystane w późniejszym terminie, pod warunkiem że nie miały kontaktu z solami. Ponowna sonikacja nie jest wymagana.
• Pęcherzyki powietrza można usunąć poprzez rozdzielenie PuraMatrix na a ليكwoty do sterylnych probówek, a następnie odwirowanie.
• Należy zachować szczególną ostrożność podczas wymiany pożywki, ponieważ aspiracja może łatwo naruszyć strukturę żelu PuraMatrix.

Materiały:

BD PuraMatrix RAD16 Peptide Hydrogel-1% (Katalog nr 354250): Całkowite stężenie peptydów w nierozcieńczonej mieszaninie wynosi 10 mg/ml.

• Sonikator w kąpieli wodnej lub wstrząsarka wirująca (vortex)
• płytka do hodowli komórkowej z 96 dołkami
• Pożywki do hodowli komórkowych
• Sterylnie filtrowana woda (H2O)₂O
• Sterylna filtrowana 20% sacharoza
• Komórki (wszystkie w zagęszczeniu 5 0 komórek/dołek): OVCAR-5

Wszystkie etapy należy przeprowadzić w warunkach aseptycznych.

Procedura:

1. Poddać 1% PuraMatrix (RAD16) działaniu kąpieli sonicznej w sonicatorze przez 30 minut w celu zmniejszenia lepkości przed użyciem.
2. Roztwór PuraMatrix 1% można teraz rozdzielić do sterylnych probówek w celu ułatwienia przyszłych eksperymentów.
   1. Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza; w przypadku ich powstania wystarczy odwirować sterylne probówki zawierające PuraMatrix przy 10 obr./min (30 x g) przez 5 minut.
   2. Całkowite stężenie peptydów w nierozcieńczonej mieszaninie wynosi 10 mg/ml.
3. Dwa zestawy po 4 dołków zostaną wysiane przy całkowitym stężeniu peptydów wynoszącym odpowiednio 2,5 mg/ml i 1,25 mg/ml.
4. Rozcieńcz PuraMatrix w każdej z przygotowanych studni za pomocą 0.2 μm przefiltrowano sterylnie 20% sacharozę i 13,3% sacharozę do całkowitych stężeń peptydów odpowiednio 5 mg/ml i 2,5 mg/ml, aby uzyskać 2-krotne stężenie BD PuraMatrix w 10% sacharozie.
   1. Aby przygotować 20% sacharozę, rozpuścić 10 g sacharozy, a następnie dopełnić objętość wodą do 50 ml.
   2. Roztwory sacharozy o stężeniu 13% i 10% można przygotować poprzez rozcieńczenie 20% roztworu stokowego.
      1. 13% sacharozy (na każde 10 ml): 6,5 ml 20% sacharozy + 3,5 ml sterylnej wody H2O₂O.
      2. 10% sacharozy (na każde 10 ml): 5,0 ml 20% sacharozy + 5,0 ml sterylnej wody H2O₂O.
5. Przygotować mieszaninę główną (master mix) peptydu PuraMatrix w ilości dostosowanej do liczby studni, które zamierza się wysiać. (Patrz przykład poniżej). Następnie podzielić mieszaninę na poszczególne probówki, tak aby każda zawierała 25 ml mieszaniny głównej.
   1. Mieszaninę master mix należy przygotować w dwukrotności pożądanego stężenia końcowego całkowitej ilości peptydów, ponieważ podczas wysiewania zostanie ona rozcieńczona równą objętością komórek.
      
6. Przygotować zawiesiny komórkowe poprzez trypsynizację monowarstwowych kultur komórek.
   1. Dla każdej kolby T-75 można zastosować 2 ml 0,05% trypsyny z EDTA.
7. Zneutralizować trypsynę poprzez dodanie pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (użyć co najmniej 2 ml pożywki na każdy 1 ml trypsyny zużytej w poprzednim kroku).
8. Odwirować komórki przy 100 obr./min (~ 30 x g) przez 5 minut w celu otrzymania osadu komórkowego.
   1. Resuspendować komórki w 10% sterylnej, filtrowanej sacharozie.
   2. Należy policzyć komórki, a następnie ponownie odwirować próbkę przy 10 obr./min (~ 30 x g) przez 5 minut w celu usunięcia śladowych ilości soli znajdujących się w pożywce.
9. Resuspenduj komórki OVCAR-5 w 10% sacharozie w stężeniu 2,0 x 10⁵ komórek/ml, tak aby końcowa liczba komórek w każdej studzience wynosiła 5 0 komórek.
   
   Poniższe kroki należy wykonać szybko.
   
10. Dodaj 25 μl z 2,0 x 10⁵ zawiesiny komórek/ml do pierwszej pojedynczej probówki zawierającej 25 μl mieszaniny master mix PuraMatrix, zgodnie z powyższym schematem.
    1. Szybko wymieszaj poprzez pipetowanie (około 5 razy w górę i w dół) w probówce, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza.
    2. Następnie pipetować 50 μl mieszaninę zawiesiny komórkowej i PuraMatrix do odpowiedniej studni płytki 96-dołkowej.
    3. Rozpocząć żelowanie preparatu BD PuraMatrix poprzez delikatne pipetowanie 150 μl pożywkę do hodowli komórkowych (RPMI + 10% FBS) przy ściankę studzienki
       
11. Powtórz kroki opisane w punkcie 8, aż wszystkie dołki zostaną wysiane.
12. Po 30 minutach Bardzo delikatnie usuń ok. 2/3 pożywki za pomocą 200 μl pipetą w celu wyrównania pH hydrożelu.
    1. NIE NALEŻY UŻYWAĆ ASSPIRATORA PRÓŻNIOWEGO, PONIEWAŻ MOŻE TO ZABURZYĆ STRUKTURĘ MACIERZY
    2. Umieść końcówkę pipety w dołku w taki sposób, aby nie dotykała warstwy PuraMatrix, i delikatnie usuń pożywkę z dołka.
    3. Należy zachować ostrożność, aby nie naruszyć matrycy podczas hodowli komórek w PuraMatrix.
13. Bardzo delikatnie dodaj 150 μl świeżej pożywki hodowlanej do boku studzienki zawierającej komórki enkapsulowane w PuraMatrix.
14. Wymieniaj pożywkę hodowlaną w każdej studzience co 48 godzin na świeżą pożywkę, uważnie powtarzając kroki 10 i 1.

Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Komórki OVCAR-5 zostały enkapsulowane zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Obrazy pozyskano przy użyciu odwróconego mikroskopu Olympus FV10 wyposażonego w laser Spectra-Physics DeepSee Ti:Sapphire nastrojony na 750 nm. Sesje obrazowania przeprowadzono w 1., 3., 5. i 7. dobie po wysianiu. Do obrazowania przez PuraMatrix wykorzystano obiektyw imersyjny wodny 40x o dużej odległości roboczej (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA). Objętości trójwymiarowe gromadzono poprzez pozyskiwanie stosów obrazów w 1.47 μm kroki osiowe. Dwa detektory bez skanowania (non-descanned) rejestrowały emisję autofluorescencji przy użyciu filtrów pasmowych dla światła fioletowego (40-490 nm) oraz zielonego (510-550 nm). Końcowe obrazy oraz filmy z serii przekrojów głębokościowych (depth stack movies) przetworzono w programie ImageJ poprzez połączenie obu kanałów detekcji. kliknij tutaj aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.