Protokół produkcji tetrameru KLRG1

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje produkcję tetrameru KLRG1, który jest potężnym narzędziem do analizy ligandów KLRG1.

Streszczenie

Receptor podobny do lektyny komórek zabójczych G1 (KLRG1) jest inhibitorycznym receptorem glikoproteinowym, białkiem transbłonowym typu II, należącym do superrodziny lektyn typu C. KLRG1 występuje zarówno w formie monomeru, jak i homodimeru połączonego mostkami dwusiarczkowymi. Ten wysoce konserwatywny receptor znajduje się na najbardziej dojrzałych i niedawno aktywowanych komórkach NK, a także na podzbiorze efektorowych/pamięciowych limfocytów T.

Wykorzystując tetramer KLRG1 oraz inne metody, zidentyfikowano kadheryny E, N i R jako ligandy KLRG1. Te zależne od Ca²⁺ cząsteczki adhezyjne międzykomórkowe składają się z domeny zewnątrzkomórkowej zawierającej pięć powtórzeń kadherynowych odpowiedzialnych za interakcje międzykomórkowe, domeny transbłonowej oraz domeny cytoplazmatycznej połączonej z cytoszkieletem aktynowym.

Wytworzenie tetrameru KLRG1 było niezbędne do zidentyfikowania ligandów KLRG1. Tetramer KLRG1 stanowi również unikalne narzędzie pozwalające wyjaśnić rolę, jaką kadheryny i KLRG1 odgrywają w regulacji odpowiedzi odpornościowej oraz integralności tkanek.

Protokół

Przygotowanie ciałek inkluzyjnych

1. Zaszczep 4 kolby o pojemności 500 ml z pożywką TB, zawierającą każda 50 μg/ml karbenicyliny i chloramfenikolu, nocną kulturą bakterii eksponujących konstrukt plazmidowy KLRG1. Gdy OD osiągnie 0,6 Å przy 600 nm, indukuj ekspresję poprzez dodanie 0,4 M IPTG i inkubuj kulturę przez kolejne 4 godziny przy wytrząsaniu w temperaturze 37°C.
2. Resuspenduj zebrane komórki w buforze do resuspensji pH=8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (W/V) sacharozy, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Uwaga: osady można zamrozić na tym etapie.
3. Połącz nie więcej niż 60 ml resuspensji bakteryjnych w zlewce polipropylenowej. W razie potrzeby uzupełnij objętość do 60 ml buforem TE pH 8,0 i mieszaj mieszaninę z połową maksymalnej prędkości.
4. Do mieszanej zawiesiny dodawaj kroplami: lizozym (stężenie końcowe=1 mg/ml), MgCl2 (stężenie końcowe=5 mM), 2 mg DNAse I w 50% glicerolu zawierającym 75 mM NaCl, Triton-X100 (stężenie końcowe=1%), DTT (stężenie końcowe=10 mM).
5. Sonicuj roztwór na lodzie przez 1,5 min i odwirowuj lizaty przy 5 000 RPM przez 10 min w temperaturze 4°C.
   1. Zlej nadsącz.
   2. Dodaj 15 ml buforu do płukania pH=8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
   3. Na lodzie sonicuj roztwór przez 1,5 min, aż osad zostanie całkowicie zresuspendowany.
   4. Odwirowuj próbki przy 5 000 RPM przez 10 min w temperaturze 4°C.
   5. Powtórz płukanie 5 razy.
6. Powtórz krok 5b, używając buforu do płukania bez Triton X-100, odwirowuj i zresuspenduj w 4 ml buforu TE.
7. Odważ mokrą masę zawiesiny ciałek inkluzyjnych i przechowuj w buforze TE w stężeniu od 30 do 100 mg/ml.

Refolding białka KLRG1

1. Przygotować 1 L buforu do refoldingu o pH=8,0 (0,4 M Arginina-HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 tabletki inhibitora proteaz bez EDTA, 5 mM GSH oraz 0,5 mM GSSG) i schłodzić do 4°C podczas mieszania.
2. Przygotować ciała inkluzyjne do wstrzyknięcia do mieszaniny fałdowania: optymalne jest wykonanie od 5 do 10 wstrzyknięć, z których każde ma stężenie 0,25–0,5 μM, tak aby końcowe stężenie białka wyniosło 2–3 μM.
   1. Rozpuścić zawiesinę 50 mg ciał inkluzyjnych w 7 M GnHCl z dodatkiem 10 mM β-merkaptoetanolu.
   2. Inkubować mieszaninę ciał inkluzyjnych/GnHCl w temperaturze 37°C przez 30–40 min, mieszając w wortexie co 5 min w celu zapewnienia całkowitego rozpuszczenia (zawiesina stanie się klarowna po pełnym rozpuszczeniu).
   3. Wirować z maksymalną prędkością przez 30 min w mikrocentryfudze w temperaturze 4°C i przenieść nadsącz do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Należy unikać przenoszenia drobnego, czarnawego osadu.
3. Dopełnić objętość buforem do wstrzykiwania (3 M GnHCl, 10 mM NaAcetate, pH 4,2, 10 mM EDTA).
4. Wstrzykiwać 1 ml rozcieńczonych ciał inkluzyjnych co godzinę. Podczas wstrzykiwania mieszać z dużą prędkością, dodając 1 ml rozcieńczonych ciał inkluzyjnych kroplami w odstępach 2 sekund między kolejnymi kroplami. Po zakończeniu wstrzykiwania mieszać z małą prędkością.
5. Kontynuować mieszanie z małą prędkością w temperaturze 4°C przez noc.

Stężenie w reakcjach refoldingu

1. Zgodnie z protokołem firmy Millipore, zagęszczyć 1 L uprzednio przefiltrowanego (filtrowanego przez membranę 0.22 μm) roztworu z reakcji refoldingu do objętości ~10 ml, używając komory mieszanej Amicon Stirred Cell oraz membrany ultrafiltracyjnej YM10 NMWL 10K (Millipore).
2. Zagęszczyć do objętości ≤2 ml, używając Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).

Oczyszczanie tetrameru KLRG1

1. Przygotować układ AKTA FPLC w temperaturze 4°C zgodnie z instrukcjami GE Healthcare.
2. Oczyścić formę monomeru KLRG1 za pomocą chromatografii wykluczania z wykorzystaniem kolumny wysokorozdzielczej Sephacryl S-200 16/60 (GE Healthcare) w buforze 20 mM HEPES i 150 mM NaCl. (Patrz Rycina 1).
3. Skoncentrować do objętości 1 ml przy użyciu Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore).
4. Wykorzystać enzym BirA zgodnie z protokołem Avidity s w celu biotinylacji monomeru KLRG1.
5. Wolną biotynę usunąć za pomocą chromatografii wykluczania, analogicznie jak w punkcie 2.
6. Cząsteczkę KLRG1 tetrameryzować poprzez zmieszanie monomeru KLRG1 z 4-krotnym nadmiarem molowym streptawidyny sprzężonej z PE (BD Biosciences).

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki pozytywne z chromatografii wykluczania żelowego AKTA FPLC dla refoldowanego KLRG1. Wykres przedstawia rozdział form monomeru (83,52 ml), dimeru (56,36 ml) oraz multimeru (36,26 ml) refoldowanego KLRG1. Pik przy 94,25 ml odpowiada wymianie buforu.

Dyskusja

W niniejszym protokole pokazano, jak przeprowadzić oczyszczanie, biotynylację i tetrameryzację białka KLRG1. Tetramer KLRG1 może być wykorzystany do znakowania ligandów KLRG1 za pomocą cytometrii przepłyewej. Chociaż warunki refoldingu będą musiały zostać sprawdzone empirycznie dla każdego białka, inne lektyny typu C mogą zostać poddane tetrameryzacji przy użyciu podobnego protokołu. Wykorzystując ztetrameryzowane białka jako sondy, potencjalnie można zidentyfikować ligandy dla sierocych receptorów lektynowych typu C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Enzym BirA i bufor	Zestaw do biotynylacji	Avidity	BIRA500
Tabletki z kompletnym inhibitorem proteaz Mini, bez EDTA	Odczynnik	Roche Group	11 836 170 001	lub równoważnik
Komora mieszana Amicon	Sprzęt	EMD Millipore	Model #8400	lub równoważnik
Membrana ultrafiltracyjna YM10 NMWL 10K	Przybornik do filtracji	EMD Millipore	13642
Koncentrator 15 ml YM10	Przybornik do filtracji	EMD Millipore	4411
AKTAFPLC	Sprzęt	GE Healthcare	18-1900-26
Kolumna wysokorozdzielcza Sephacryl S-200 16/60	Sprzęt	GE Healthcare	17-1166-01
Strepawidyna PE	Odczynnik	BD Biosciences	554061	lub równoważnik