Przygotowanie nieodekwalcjowanej kości do badań histologicznych, histomorfometrycznych i analizy fluorochromowej

Podsumowanie

Histologia nieodwapnionej kości dostarcza istotnych informacji dla wielu zastosowań klinicznych i badawczych. Jest to proces wymagający technicznie, szczególnie w przypadku próbek o dużych rozmiarach. Niniejszy materiał wideo ilustruje proces przygotowywania wysokiej jakości skrawków oraz demonstruje trudności techniczne i metody pozwalające je przezwyciężyć.

Streszczenie

Histologia kości nieodwapnionej obrazuje mikroarchitekturę tkanki kostnej. Przedstawia ona zarówno komponenty zmineralizowane, jak i komórkowe, co dostarcza kluczowych informacji na temat przebudowy kości, a w szczególności procesów tworzenia i resorpcji kostnej. Ma to ogromne znaczenie w wielu zastosowaniach klinicznych i badawczych. Metoda ta pozwala na uzyskanie wysokiej jakości obrazów¹ oraz zastosowanie takich technik jak ocena fluorochromowa i histomorfometria². Analiza fluorochromowa to technika, w której w określonym punkcie czasowym wstrzykuje się barwniki fluorescencyjne wiążące się z wapniem, co umożliwia ilościowe określenie stopnia mineralizacji w danym czasie. Histomorfometria jest procesem ilościowej analizy kości na poziomie mikroskopowym.

Wykonanie histologii nieodwapnionej kości jest trudne pod względem technicznym, szczególnie w przypadku dużych próbek. Wymaga ono modyfikacji technik stosowanych w standardowej histologii z zatopieniem w parafinie. Niniejszy film przedstawia proces przygotowywania wysokiej jakości skrawków oraz demonstruje trudności techniczne i metody pozwalające na ich pokonanie. Przygotowanie, utrwalenie i procesowanie próbek odbywa się w sposób podobny do innych tkanek miękkich, jednak ze względu na gęstość i niższą przepuszczalność kości wymagany jest znacznie dłuższy czas utrwalania i procesowania, co często trwa kilka tygodni. Zatapianie wykonuje się przy użyciu medium wspierającego o twardości i gęstości zbliżonej lub równej gęstości kości, np. żywic na bazie metakrylanu; w przeciwieństwie do infiltracji i zatapiania w parafinie, jest to etap nieodwracalny. Skrawanie można przeprowadzić poprzez szlifowanie, co pozwala uzyskać grubszy przekrój, optymalny dla takich badań jak analiza fluorochromowa. Najlepiej osiągnąć to za pomocą tarczy diamentowej w makrotomie. Alternatywnie można przygotować cieńsze skrawki do mikroskopii świetlnej, wykorzystując do tego mikrotom ślizgowy z bardzo ostrym nożem. Mikrotom ślizgowy zapewnia dodatkową wytrzymałość i stabilność wymaganą dla dużych, twardych bloków. Skrawki zatopione w żywicy można barwić różnymi barwnikami, które zostaną zaprezentowane w filmie.

Protokół

1. Tkankę umieszcza się w szczelnym pojemniku zawierającym 10% roztwór formaliny w buforze fosforanowym.³W przypadku planowanej analizy fluorochromów należy zapewnić ich minimalną ekspozycję na światło, ponieważ są one światłoczułe.
2. Należy ustalić wymaganą orientację tkanki.
3. Przytnąć preparat do odpowiedniego rozmiaru i w prawidłowej orientacji, używając piły taśmowej. Należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa. Następnie preparat umieszcza się w nieprzezroczystym pojemniku, którego objętość powinna być około dziesięciokrotnie większa od rozmiaru preparatu, aby zapewnić odpowiednią fiksację. Preparat powinien pozostawać w roztworze formaliny łącznie od jednego do dwóch tygodni, w zależności od jego wielkości. W celach testowych i optymalizacyjnych zaleca się użycie tkanki kontrolnej.
4. Należy sprawdzić, czy tkanka mieści się w kasetce do zatapiania, a następnie umieścić ją w szczelnym, nieprzezroczystym pojemniku zawierającym 70% etanol.
5. Przetwarzać tkankę w rosnących stężeniach etanolu, chroniąc przed światłem i przy stałym mieszaniu.
   1. 70% etanol przez 1 tydzień
   2. 80% etanol, 1 tydzień
   3. 90% etanol przez 1 tydzień
   4. 100% etanol, 1 tydzień
6. Następnie tkankę odtłuńcza się w butanolu przez 1 tydzień, ponownie chroniąc ją przed światłem i poddając stałemu mieszaniu.
7. Gęstość żywicy i kości powinna być ściśle dopasowana. Gęstość żywicy można zmienić (patrz krok 8); zalecamy uprzednie zatopienie próbki testowej w celu zapewnienia prawidłowej gęstości. Do mikroskopii świetlnej i analizy fluorochromów stosujemy żywicę Technovit 7100 (Heraeus Kulzer). W przypadku konieczności przeprowadzenia immunohistochemii należy zastosować alternatywną żywicę, np. Technovit 9100 (Heraeus Kulzer).
8. Roztwór przygotowawczy Technovit 7100 można, w razie potrzeby, zmieszać z niewielkimi alikwotami dołączonego do zestawu roztworu zmiękczającego, jednak w ilości nieprzekraczającej 5% objętości roztworu przygotowawczego; z naszego doświadczenia wynika, że roztwór zmiękczający jest rzadko wymagany. Równe części etanolu bezwodnego i płynu bazowego Technovit 7100 miesza się i nanosi na tkankę jako roztwór przedinfiltracyjny na 24 godziny, minimalizując ekspozycję na światło i zapewniając mieszanie.
9. Następnie przygotowuje się roztwór infiltracyjny, używając 1 g utwardzacza I (= 1 woreczek), który rozpuszcza się w 100 ml cieczy bazowej. Zastępuje on roztwór do preinfiltracji, a proces infiltracji trwa 1 tydzień przy stałym mieszaniu.
10. Umieść tkankę w formie powierzchnią cięcia skierowaną w dół. Upewnij się, że wokół tkanki znajduje się margines (w idealnym przypadku co najmniej 5 milimetrów) na żywicę; zapewni to wytrzymałość bloku. Wymieszaj 15 ml roztworu przygotowawczego Technovit 7100 z 1 ml utwardzacza II, wlej wokół preparatu w formie i przykryj go warstwą co najmniej 5 milimetrów. Proces utwardzania rozpocznie się w ciągu 2 godzin, ale zostanie zakończony w ciągu nocy.
11. Następnie wykonuje się montaż poprzez przygotowanie bloku podkładowego z użyciem Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Technovit 3040 miesza się w stosunku objętościowym 2 części proszku do 1 części płynu, aby uzyskać gęstą ciecz. Technovit 3040 wlewa się do wgłębienia z tyłu bloku do poziomu co najmniej 2 mm powyżej podstawy bloku. Po około 10 minutach można zdjąć formę, a blok jest gotowy.
12. Gęstość, a tym samym właściwości skrawania żywicy metakrylowej, są zależne od wilgotności powietrza w pomieszczeniu. Bloczki powinnyTherefore być przechowywane w eksykatorze.
13. Przecięcie metodą szlifowania pozwala na uzyskanie grubszych sekcji o grubości od 20 do 50 mikrometrów. Metoda ta jest przydatna przy analizie fluorochromów (patrz w sekcji poniżej), ponieważ grubsze sekcje dają silniejszą fluorescencję. Zamocuj ostrze diamentowe w makrotomie. Do zbiornika w makrotomie wlej środek smarujący, np. benzynę ekstrakcyjną. Umieść blok w uchwycie i ustaw go względem ostrza. Proces szlifowania powinien przebiegać powoli (około 20–30 minut na sekcję), przy zapewnieniu odpowiedniego smarowania. Pierwsza sekcja odsłania powierzchnię cięcia i służy do ustawienia orientacji – należy ją odrzucić.
14. Następnie kolejny skrawek nanosi się na szkiełko Superfrost Plus. Skrawki mają tendencję do zwijania się, dlatego zaleca się przykrycie ich fragmentem woreczka strunowego, a następnie dociśnięcie ich drugim szkiełkiem w celu ich wyprostowania. Tak przygotowane szkiełko umieszcza się w inkubatorze w temperaturze od 60 do 80 stopni Celsjusza na 1 godzinę. Zabieg ten zmiękcza metakrylan i ułatwia płaskie przyleganie skrawka do szkiełka.
15. Sekcję szlifowaną można w razie potrzeby oczyścić i wypolerować, używając w delikatny sposób papieru ściernego o drobnej ziarnistości.
16. Mikrotom poślizgowy służy do wycinania cienkich przekrojów, które zapewniają najlepsze preparaty do mikroskopii świetlnej. Należy użyć mikrotomu poślizgowego ze względu na jego zwiększoną sztywność, która jest niezbędna do cięcia tych twardych bloków. Alternatywnie można zastosować zautomatyzowany mikrotom obrotowy. Należy użyć ostrego ostrza ze stali nierdzewnej. Zaleca się posiadanie dwóch ostrzy, aby jedno mogło zostać naostrzone w czasie użytkowania drugiego. Ostrze powinno tworzyć kąt 45 stopni z blokiem. W razie potrzeby można zmiękczyć powierzchnię bloku, przykładając do niego mokry papier. Uzyskanie optymalnych warunków cięcia w celu otrzymania wysokiej jakości przekroju może wymagać wykonania kilku wstępnych cięć. Następnie przekrój umieszcza się na kąpieli wodnej, a potem przenosi na szkiełko przedmiotowe zgodnie z opisem w punkcie 16 powyżej.
17. Odczynniki do barwienia wymieniono poniżej w sekcji Materiały. Protokoły oparto na opracowaniu Bancrofta.⁴ it al. Ze względu na zmienną grubość preparatów zaleca się optymalizację barwień na szkiełkach testowych. Barwienie w statywach może spowodować odklejenie się tkanki od szkiełka, dlatego może być konieczne nanoszenie barwników bezpośrednio na płaskie szkiełko. W celu uzyskania spójnych wyników barwienia, niezbędnych do histomorfometrii, konieczne jest zastosowanie identycznego protokołu lub barwienia w statywach.
    1. Hematoksylina i eozyna
       1. Barwić hematoksyliną przez 5–10 minut
       2. Dokładnie przemyć wodą z kranu Scott s
       3. Barwić eozyną przez 5 minut
       4. Płukanie w wodzie z kranu
       5. Przejaśnianie w ksylenie
       6. Montowanie
       7. Wyniki
          1. Osteoid = różowy
          2. Zwapniała kość = purpurowobrązowa
          3. Jądra komórkowe = niebieskie
    2. Metoda Von Kossy
       1. Umieścić w roztworze azotanu srebra i naświetlać silnym światłem, aż zmineralizowana kość stanie się czarna (ok. 10 min).
       2. Przemyć trzykrotnie wodą destylowaną
       3. Traktować tiosiarczanem sodu przez 5 minut
       4. Przemyć wodą destylowaną
       5. Przeciwbarwienie safraniną O
       6. Przejrzyście w ksylenole
       7. Montaż
       8. Wyniki
          1. Kość zmineralizowana = czarna
          2. Osteoid = czerwony/różowy
    3. Trójbarwienie Massona-Goldnera
       1. Przemyć alkoholem alkalicznym (90 ml 80% etanolu i 10 ml 25% amoniaku przez 20 minut)
       2. Płukać w wodzie
       3. Przepłukać wodą destylowaną
       4. Barwić hematoksyliną Weigerta przez 10 minut
       5. Przepłukać wodą destylowaną
       6. Barwić końcowym roztworem Ponceau-Fuchsin przez 5 minut
       7. Płukać 1% kwasem octowym przez 15 sekund
       8. Barwić w roztworze kwasu fosfomolibdenowego i pomarańczowego G przez 5 minut
       9. Płukać 1% kwasem octowym przez 15 sekund
       10. Barwić jasnozielonym przez 5 minut
       11. Płukanie 1% kwasem octowym (3 zmiany)
       12. Płukać w wodzie destylowanej
       13. Zamocuj
       14. Wyniki
           1. Kostć zmineralizowana = zielony
           2. Osteoid = czerwony/pomarańczowy
           3. Jądra komórkowe = niebieskoszare
           4. Chrząstka = fioletowy
18. Przygotowanie fluorochromów:
19. Preparaty te podaje się w formie powolnego wstrzyknięcia dożylnego w odstępach co najmniej dwóch tygodni.
20. Dawki
    1. Kalcyna zielona 10 mg/kg i.v.
    2. Oksytetracyklina 50 mg/kg i.v.
    3. Alizarynowy komplekson 30 mg/kg i.v.
21. Przygotowanie kalceiny zielonej
    1. Jeden gram Calcein Green miancuje się za pomocą 1 M NaOH aż do całkowitego rozpuszczenia.
    2. Wartość pH reguluje się za pomocą 1% NaOH, aż do uzyskania pH = 7,1-7,2.
    3. Przefiltrować i przechowywać w ciemności
22. Przygotowanie kompleksonu alizarynowego
    1. Trzy gramy kompleksonu alizarynowego miareczkuje się 1 M NaOH do momentu rozpuszczenia.
    2. Następnie pH jest korygowane za pomocą 1% HCl lub NaOH do wartości 7,1–7,2.
    3. Przefiltrować i przechowywać w warunkach ochrony przed światłem
23. Przygotowanie oksytetracykliny
    1. Oksytetracyklina jest dostępna jako gotowy do użycia lek przeciwmikrobowy. Nie wymaga on przygotowania.