W niniejszym filmie zaprezentowano sposób pozyskiwania hemocytów (komórek krwi) z hawajskiej mątwy, Euprymna scolopes, do wykorzystania w badaniach biologii komórki oraz testach adhezji bakteryjnej. Hemocyty zostaną zabarwione barwnikiem fluorescencyjnym i poddane działaniu bakterii znakowanych GFP.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pozyskiwanie hemocytów z hawajskiej mątwy Euprymna scolopes i obserwacja ich przylegania do bakterii symbiotycznych i niesymbiotycznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania dotyczące roli układu odpornościowego w pośredniczeniu w przesyłaniu sygnałów molekularnych między pożytecznymi bakteriami a ich gospodarzami w ostatnich latach wniosły znaczący wkład w nasze zrozumienie koewolucji eukariotów z ich mikrobiotą. Symbiotyczna relacja między hawajską mątwą bobtail,Euprymna scolopesoraz bioluminescencyjna bakteriaVibrio fischeribył wykorzystywany jako system modelowy do zrozumienia wpływu korzystnych bakterii na rozwój zwierząt. Niedawne badania wykazały, że hemocyty o charakterze makrofagowym, będące jedynym komponentem komórkowym wrodzonego układu odpornościowego organizmu gospodarza (mątwy), prawdopodobnie odgrywają istotną rolę w pośredniczeniu w nawiązywaniu i utrzymywaniu tej asocjacji. Niniejszy protokół zademonstruje, jak pozyskać hemocyty zE. scolopesa następnie należy wykorzystać te komórki w testach wiązania bakterii. Dorosłe mątwy są najpierw znieczulane przed pobraniem hemolimfy za pomocą strzykawki z głównego naczynia krwionośnego głowy. Hemocyty gospodarza, zawarte w wyekstrahowanej hemolimfie, są przytwierdzane do szkiełek przedmiotowych z komorkami, a następnie poddawane działaniu symbiontów znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnymVibrio fischerii niesymbiotycznyVibrio harveyiHemocyty barwi się kontrastowo barwnikiem fluorescencyjnym (Cell Tracker Orange, Invitrogen), a następnie wizualizuje za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Protokół
- Przygotować 500 mL sterylnej sztucznej wody morskiej filtrowanej przez filtr 0,22 μm (FSW; zasolenie 35 ppt). Przefiltrować sztuczną lub naturalną wodę morską przez filtr 0,22 μm w celu usunięcia cząsteczek i bakterii.
- Zanurzyć jednego dorosłego mątwy hawajskiej (Euprymna scolopes) w 2% roztworze etanolu w FSW w celu znieczulenia. Pozostawić zwierzę w środku znieczulającym przez około 10 minut. Mątwa przestanie pływać i nie będzie aktywnie reagować na dotyk. Należy nadal obserwować oddychanie, objawiające się ruchem płaszcza, oraz aktywność chromatoforów.
- Umieścić mątwę stroną brzuszną do góry na standardowej woskowanej kuwecie do sekcji. Zanurzyć zwierzę w FSW zawierającym 2% etanolu.
- Używając standardowego końcówki do pipety 200 μl, odsunąć lejek i płaszcz, aby odsłonić główny naczynie krwionośne głowy znajdujące się pomiędzy oczami.
- Za pomocą sterylnej strzykawki 1 mL z igłą 26,5 G nakłuć naczynie krwionośne głowy i pobrać od 50 do 100 μl hemolimfy. Przenieść hemolimfę do sterylnej probówki 1,5 mL i umieścić na lodzie.
Uwaga: Jeśli zwierzę ma służyć jako dawca wielokrotnie, należy pobierać jednorazowo tylko 10-20 μl hemolimfy. Przenieść zwierzę do zbiornika z normalną wodą morską. Zwierzę odzyska sprawność w ciągu 30 min. - Świeżo pobrane hemocyty należy przemyć i ponownie zawiesić w 500 μl roztworu Ringera dla mątwy (S-Ringers; 530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 oraz 10 mM bufor HEPES, pH 7,5).
- Stężenie hemocytów należy określić za pomocą hemocytometru, a następnie nanieść około 2000 komórek na komorowe szkiełka nakrywkowe i pozostawić do przylegania do szkła przez 10 min w temperaturze pokojowej. Przy takim zagęszczeniu hemocyty tworzą jednorodną monowarstwę na powierzchni szkiełka.
- Aby zaobserwować wiązanie bakterii z hemocytami gospodarza, hemocyty poddaje się działaniu szczepów bakteryjnych znakowanych fluorescencyjnie, takich jak Vibrio fischeri ES114 i/lub Vibrio harveyi B392, z których każdy zawiera zielony reporter fluorescencyjny. V. fischeri ES114 oraz V. harveyi B392 hoduje się do środkowej fazy logarytmicznej w pożywce tryptonowo-morskiej (SWT) w temperaturze 28°C w inkubatorze orbitalnym. Gęstość optyczną przy 600 nm mierzy się spektrofotometrycznie w celu określenia zagęszczenia komórek. Bakterie osadza się przez wirowanie (5000 rpm przez 5 min), odrzuca nadsącz, a osad zawiesza ponownie w S-Ringers.
- Do każdej komory dodaje się 100 000 komórek bakteryjnych, tak aby średnio na jeden hemocyt przypadało 50 bakterii. Mieszaniny hemocytów i bakterii inkubuje się w roztworze S-Ringers w temperaturze 25°C przez 1 h, co jest czasem ustalonym dla uzyskania maksymalnego poziomu wiązania.
- Cytoplazmę hemocytów barwi się następnie fluorescencyjnie barwnikiem 0,005% CellTracker Orange (Invitrogen), a następnie przemywa w S-Ringers w celu wizualizacji komórek.
- Zbarwione hemocyty wraz z powiązanymi bakteriami obserwuje się w świetle fluorescencyjnym przy użyciu stereoskopu fluorescencyjnego Zeiss Discovery V20 lub spektralnego konfokalnego mikroskopu laserowego Leica SP2, a następnie zlicza się je na całej powierzchni komórki zwierzęcej.
Reprezentatywne wyniki
Ponieważ hemolimfa głowonogów zawiera zewnątrzkomórkową hemocyjaninę, a nie hemoglobinę, po natlenieniu hemolimfa przybierze ciemnoniebieski kolor. Przy zastosowaniu tej metody uzyska się średnio ~5000 hemocytów na μl hemolimfy. Po przyleganiu do komorowych szkiełek nakrywkowych i barwieniu fluorescencyjnym hemocyty powinny wykazywać intensywną czerwoną fluorescencję i mieć kształt ameboidalny. W przypadku adhezji bakteryjnej V. fischeri będą słabo przylegać do hemocytów (1-2 komórki bakteryjne na komórkę krwi), podczas gdy V. harveyi będą przylegać silnie (10-15 komórek bakteryjnych na hemocyt).
Rysunek 1. Dorosła mątwka hawajska Euprymna scolopes z zaznaczonym położeniem naczynia krwionośnego głowy.
Rycina 2. Wyniki ekspozycji hemocytów na Vibrio fischeri (A) oraz Vibrio harveyi (B). Czerwony: Cell Tracker Orange; Zielony: bakterie znakowane GFP.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badania dotyczące roli układu odpornościowego w pośredniczeniu sygnałów molekularnych między korzystnymi bakteriami a ich gospodarzami wniosły w ostatnich latach istotny wkład w nasze zrozumienie koewolucji eukariotów z ich mikrobiotą. System mątwica/vibrio okazał się być praktycznym modelem badawczym pozwalającym na udzielenie odpowiedzi na fundamentalne pytania w tej dziedzinie2,3,5,6,8. Organ świetlny mątwicy Euprymna scolopes umożliwia kolonizację wyłącznie przez luminescencyjną bakterię Vibri...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Źródła finansowania: University of Connecticut Research Foundation oraz Department of Molecular and Cell Biology dla SVN, Sigma Xi Grant-in-Aid-of Research oraz Antonio H. and Majorie R.
Romano Graduate Education Fellowship dla AJC
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System szkiełek nakrywek z borokrzemianu Lab-Tek z komorami #1.0 (8 komór) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| Strzykawka insulinowa 1 ml 26.5 G bez lateksu | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| Mikroskop SteREO Discovery V20 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Mikroskop konfokalny SP2 | Leica Microsystems |
Bibliografia
- Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis. Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).
- McFall-Ngai, M. J. Unseen forces: the influence of bacteria on animal development. Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes. Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri. Biol Bull. 195, 89-97 (1998).
- Visick, K. L., Ruby, E. G. Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango. Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
