Mozaikowa transgeneza danio pręgowanego do oceny sekwencji wzmacniających

1. Wybór i klonowanie zachowanych sekwencji do testowania

1. Należy najpierw zidentyfikować potencjalne sekwencje regulacyjne dla testów funkcjonalnych. Opieramy się na zachowaniu sekwencji ewolucyjnych jako kryterium wyboru sekwencji i najczęściej korzystamy z algorytmu PhastCons, który jest dostępny jako ścieżka w przeglądarce UCSC Genome (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Istnieje jednak wiele innych algorytmów do oceny zachowania sekwencji między gatunkami.
2. Po wybraniu naszych sekwencji projektujemy startery, aby amplifikować każdą sekwencję z genomowego DNA. Startery powinny być dobrane tak, aby wzmocnić konserwatywny region plus 30 lub więcej par zasad po każdej stronie.
3. Do amplifikacji wybranych sekwencji wykorzystujemy system Takara LA TaqTM. Inne polimerazy będą działać, ale ważne jest, aby używać mieszanki, która zawiera enzym z możliwością korekty, aby zminimalizować ryzyko błędów wprowadzonych podczas amplifikacji. Wielkość amplikonu weryfikujemy za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
4. Używamy zestawu do klonowania pCR 8/GW/TOPO TA (Invitrogen) do sklonowania produktu PCR do wektora wejściowego zawierającego miejsca rekombinacji attL, w celu wygenerowania klonu wejściowego Gateway. Reakcja klonowania jest bardziej wydajna w przypadku świeżego produktu PCR, dlatego najlepiej jest przeprowadzić klonowanie w ciągu jednego dnia od PCR. Transformację w szczepach DH5α przeprowadza się, a następnie selekcję oporności na spektynomycynę.
5. Weryfikujemy produkt klonowania TA przez trawienie ~ 500ng plazmidu za pomocą EcoRI w celu uwolnienia wstawki i potwierdzamy rozmiar wkładki za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Zalecamy sekwencjonowanie w celu sprawdzenia kolejności i orientacji wstawiania; Startery używane do amplifikacji mogą być również używane do sekwencjonowania.
6. Z klonu wejściowego, niekodująca konserwatywna sekwencja jest przenoszona przez rekombinację LR do naszego wektora docelowego gotowego do bramy, pGW_cfosGFP1, przy użyciu mieszanki enzymów Gateway LR Clonase II (Invitrogen). Transformację w szczepach DH5α przeprowadza się, a następnie dokonuje się selekcji oporności na ampicylinę.
7. Weryfikujemy produkt rekombinacji LR przez trawienie ~ 500ng plazmidu za pomocą EcoRV w celu uwolnienia insertu i potwierdzamy wielkość insertu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Po zidentyfikowaniu dokładnego klonu przygotowujemy plazmidowe DNA za pomocą zestawu Qiagen HiSpeed® Plasmid Midi Kit. Następnie oczyszczamy plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania QIAquick PCR, zgodnie z protokołami producenta, i eluujemy DNA za pomocą 30 μl wody wolnej od RNazy. Plazmid rozcieńcza się do stężenia 125 ng/μl i przechowuje w temperaturze 4°C przed wstrzyknięciami.
8. Funkcjonalny enzym transpozazy Tol2 kodujący RNA jest transkrybowany in vitro z plazmidu pDB6002. Oczyszczamy plazmid za pomocą zestawu Qiagen Midi-Prep, a następnie linearyzujemy 10-20 μg za pomocą XbaI. Synteza mRNA odbywa się zgodnie z protokołem mMESSAGE mMACHINE Kit (Ambion).
9. Oczyszczamy i wytrącamy RNA zgodnie z instrukcją zestawu. Ponownie zawieszamy RNA do końcowego stężenia ~1 μg/μl lub 20 μl dla pojedynczej reakcji, w wodzie wolnej od RNaz i oznaczamy ilościowo za pomocą spektrofotometrii UV. Analizujemy również ~1 μg RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym w celu sprawdzenia transkrypcji o pełnej długości. Chociaż do tej analizy odpowiedni jest standardowy żel TAE lub TBE, bufor do denaturacji próbki dołączony do zestawu do transkrypcji powinien być używany zgodnie z instrukcją zestawu.
10. Testujemy każdą nową partię RNA transpozazy pod kątem skuteczności, wykonując iniekcje ze znanym plazmidem (ryc. 1). Po weryfikacji RNA jest dzielone na małe porcje i przechowywane w temperaturze -80°C, aby uniknąć wielokrotnego rozmrażania i ponownego zamrażania poszczególnych porcji.
    
    Rysunek 1. Zarodek danio pręgowanego wstrzyknięty mysim wzmacniaczem Sox10 jako kontrola.(Góra) Obraz w jasnym polu (na dole) Obraz fluorescencyjny GFP. Każda nowa partia RNA transpozazy jest testowana pod kątem skuteczności.

2. Mikroiniekcja zarodków danio pręgowanego do mozaikowej analizy transgenicznej

1. Wyciągamy igły do mikroiniekcji ze szkła kapilarnego z filamentem o średnicy zewnętrznej 1,2 mm na ściągaczu do mikropipet Sutter P-97, z programem zaprojektowanym tak, aby uzyskać mocną końcówkę z dość ostrym stożkiem do penetracji nienaruszonej kosmówki. Końcówki łamiemy ręcznie pod mikroskopem stereoskopowym do średnicy zewnętrznej około 15 μm, używając czystej żyletki i szkiełka mikrometrycznego. Igły mogą być wykonane dzień przed wstrzyknięciem i przechowywane w przykrytym naczyniu do przechowywania w celu utrzymania w czystości.
2. Utrzymujemy naszego danio pręgowanego w regularnym cyklu jasno-ciemnym, z 14 godzinami światła, w standardowych warunkach3. Dzień przed wykonaniem mikroiniekcji ustawiamy ryby do krycia w małych zbiornikach hodowlanych, z których każdy składa się ze zbiornika podstawowego, wkładki szczelinowej i plastikowej pokrywy. Umieszczamy trzy samice lub dwa samce na zbiornik w równoległych rzędach.
3. Rankiem w dniu mikroiniekcji, wkrótce po rozpoczęciu cyklu świetlnego, zaczynamy łączyć samce i samice w czystej, uzdatnionej systemowo wodzie do produkcji jaj. Ważne jest, aby często sprawdzać ryby i zbierać jaja w ciągu kilku minut od złożenia, aby uzyskać dobrze zsynchronizowane partie. Produkcja jaj może być utrzymana przez dwie do trzech godzin, kontynuując łączenie świeżych grup ryb przez cały poranek.
4. Za pomocą szklanej pipety Pasteura o średnicy 5 1/4" z szerokim otworem, wyposażonej w lateksową gruszkę, sortujemy zebrane zarodki na szalki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm, częściowo wypełnione pożywką Embryo Medium2, w grupach po 50 zarodków i zaznaczamy czas zebrania na wieczku każdej szalki.
5. Gdy ryby zaczną nieść, przygotowujemy świeży roztwór do wstrzykiwań, mieszając następujące składniki w probówce do mikrofuge na lodzie: składnik   Zapas plazmidu transpozonu (125 ng / μl) 1μl Zapas RNA transpozazy (175 ng / μl) 1μl Czerwony barwnik fenolowy (2% w_H2O) 0,5 μl Woda wolna od RNaz 2,5 μl
   Igły do wstrzykiwań umieszcza się w naczyniach do przechowywania i napełnia przez pipetowanie 500 nl kropli roztworu do wstrzykiwań na szeroki koniec każdej igły. Po wciągnięciu cieczy do końcówki poprzez działanie kapilarne, można dodać dodatkowy roztwór, w sumie 1,5-2 μl. Do każdego roztworu do wstrzykiwań przygotowujemy co najmniej dwie igły.
6. Napełniona igła jest ładowana do ręcznego uchwytu igły pneumatycznej pompy Pico-Pump lub podobnego wtryskiwacza ciśnieniowego, skonfigurowanego i podłączonego do zbiornika N2 zgodnie z instrukcjami producenta. Kalibrujemy objętości wtrysku, mierząc średnicę kropel wydalanych do oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym. Zazwyczaj czas wstrzykiwania wynoszący 120 ms przy ciśnieniu 20 p.s.i. daje kroplę o objętości około 1 nl, ale niewielkie różnice w średnicy igły wpływają na te parametry i może być wymagana ponowna kalibracja między igłami.
7. Iniekcje wykonywane są pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 6-10X. Używamy pary cienkich kleszczyków, aby przytrzymać zarodek na miejscu, wpychamy igłę do wstrzykiwań ze stałym naciskiem przez kosmówkę i do żółtka zarodka w stadium jednokomórkowym lub wczesnym etapie dwukomórkowym. Idealnie byłoby, gdybyśmy umieścili końcówkę igły w żółtku tuż pod blastomerami. Około 1 nl roztworu do wstrzykiwań jest wydalane, a igła usuwana. Do każdego konstruktu wstrzykujemy ≥ 200 zarodków. Bardzo ważne jest również, aby na każdy pobrany lęg zarodków zachować miskę z niewstrzykniętymi zarodkami kontrolnymi.
8. Po zakończeniu iniekcji sortujemy zarodki, usuwając niezapłodnione komórki jajowe, uszkodzone zarodki i nieudane iniekcje (zarodki bez czerwieni fenolowej w blastomerach). Następnie inkubujemy zarodki w pożywce zarodkowej w temperaturze 28,5°C do odpowiedniego czasu na obserwacje.

3. Analiza mozaikowych wzorców ekspresji

1. Po odpowiednim czasie inkubacji badamy wstrzyknięte zarodki pod kątem fluorescencji. Czas zależy od normalnego wzorca ekspresji endogennego genu danio pręgowanego, ale zwykle patrzymy codziennie przez pierwsze 5 dni po zapłodnieniu.
2. Badamy zarodki pod kątem fluorescencji na makroskopie Olympus MVX10 przystosowanym do epifluorescencji, ale każdy podobny mikroskop zdolny do obrazowania o niskiej mocy będzie działał. Jeśli istnieje duża liczba zarodków, które obumarły lub rozwinęły się nieprawidłowo w pierwszym dniu, spójrz na niewstrzyknięte kontrole dla tego lęgu, aby sprawdzić, czy wyglądają normalnie. Jeśli kontrole wyglądają normalnie, najczęstszym problemem jest niewystarczająca czystość wstrzykniętego DNA. Ponadto zarodki we wczesnych stadiach są wrażliwe na całkowitą ilość wstrzykniętego plazmidu, więc możliwe jest, że oznaczanie ilościowe było niedokładne i wstrzyknięto zbyt dużo DNA.
3. Podczas badania zarodków należy pamiętać, że wszystkie będą mozaiką dla wstrzykniętego konstruktu. Konieczne będzie dokładne przyjrzenie się wszystkim zarodkom, zwłaszcza jeśli oczekiwana domena ekspresji jest niewielka. Pamiętaj również, że wyrażenie może być dynamiczne; Silna fluorescencja w dniu 1 może zniknąć w dniu 2, a zarodki ujemne pod względem ekspresji w ciągu pierwszych 3 dni mogą wykazywać coś w dniu 4.
4. Wybieramy niektóre zarodki o bardziej rozbudowanej ekspresji i używamy ich do udokumentowania wzoru fluorescencji za pomocą fotomikroskopii. Po 5 dniach obserwacji zarodki powinny zostać zwrócone do placówki i hodowane jako stado. W ciągu kilku miesięcy dorosłe osobniki mogą zostać poddane badaniom przesiewowym pod kątem transmisji transgenów w linii zarodkowej.

4. Wyniki

Widzimy szeroką gamę wzorców i poziomów ekspresji, w zależności od analizowanego elementu wzmacniającego. Zwykle interesują nas bardzo specyficzne dla tkanek wzorce ekspresji i często skupiamy się na genach ulegających ekspresji w szkielecie. i często koncentrują się na genach ulegających ekspresji w szkielecie. Rycina 2 przedstawia przykłady mozaikowych wzorców ekspresji, które zaobserwowaliśmy w naszych wstrzykniętych zarodkach, z wzmacniaczami regulującymi ekspresję w chrząstkach i kościach. Wreszcie, znaczna część badanych sekwencji nie reguluje ekspresji specyficznej dla tkanki. W ich przypadku najczęściej obserwujemy bardzo małą fluorescencję, być może kilka rozproszonych komórek na zarodek. Rzadziej możemy zaobserwować fluorescencję, ale tylko w dwóch typowych miejscach ekspresji ektopowej, naskórku i mięśniach szkieletowych (ryc. 3).

Rysunek 2. Przykład wzorców ekspresji chrząstki i kości obserwowanych w zarodkach, którym wstrzyknięto zastrzyk.

Rysunek 3. Istnieje niewielka korelacja między lokalizacją wzmacniacza w stosunku do genu a regulacją ekspresji.Znaczna część badanych sekwencji nie reguluje ekspresji specyficznej dla tkanek. Często mają one bardzo małą fluorescencję lub mogą mieć dwa wspólne miejsca ekspresji ektopowej: naskórek i mięśnie szkieletowe. (Góra) Obraz w jasnym polu (na dole) Obraz fluorescencyjny GFP.

We have demonstrated the approach used in our laboratory for the efficient analysis of potential enhancers using zebrafish transgenesis. Most often, we use this approach to look for tissue-specific enhancers associated with human genes. Despite the lack of obvious sequence homology most of the time between human and fish non-coding sequences, we find that this approach is usually successful in identifying enhancers for the genes of interest to us. The critical factors for success are taking care in the preparation of the plasmid DNA and the transposase RNA, and injecting and examining a sufficient number of embryos for each construct. The general methods of transgene construction, embryo microinjections, and mosaic expression analysis would be applicable to generating transgenic zebrafish lines for many other purposes.