Mozaikowa transgeneza u danio pręgowanego do oceny sekwencji enhancerów

Podsumowanie

Prezentujemy nasze podejście do wyszukiwania potencjalnych elementów enhansera w genach regulowanych rozwojowo oraz ocenę ich funkcji za pomocą mozaikowej transgenezy u rybek danio pręgowanych.

Streszczenie

Ukończenie sekwencjonowania genomu ludzkiego, a także wielu innych gatunków, uwydatniło problem przypisywania konkretnych funkcji sekwencjom niekodującym. Jedną z głównych funkcji pełnionych przez niekodującą frakcję genomu jest regulacja transkrypcji genów; brakuje jednak skutecznych metod szerokiego przewidywania elementów cis-regulacyjnych na podstawie pierwotnej sekwencji DNA. Opracowaliśmy wydajny protokół funkcjonalnej oceny potencjalnych elementów cis-regulacyjnych za pomocą transgenezy u danio pręgowanego. Nasze podejście oferuje znaczące zalety w stosunku do technik opartych na hodowlach komórkowych w przypadku genów istotnych dla rozwoju, ponieważ dostarcza informacji o przestrzennej i czasowej regulacji genów. Z drugiej strony jest ono szybsze i mniej kosztowne niż analogiczne eksperymenty na myszach transgenicznych, a my rutynowo stosujemy je do sekwencji wyizolowanych z genomu ludzkiego. W niniejszej pracy prezentujemy nasze podejście do wyboru elementów do testowania w oparciu o konserwację sekwencji oraz protokół klonowania sekwencji i ich mikroiniekcji do embrionów danio pręgowanego.

Protokół

1. Wybór i klonowanie sekwencji konserwatywnych do testów

1. W pierwszej kolejności należy zidentyfikować potencjalne sekwencje regulacyjne do testów funkcjonalnych. Jako kryterium wyboru sekwencji przyjmujemy ewolucyjną konserwację sekwencji, najczęściej wykorzystując algorytm PhastCons, który jest dostępny jako ścieżka w przeglądarce genomu UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Dostępnych jest jednak wiele innych algorytmów służących do oceny konserwacji sekwencji między gatunkami.
2. Po wybraniu sekwencji projektujemy startery do amplifikacji każdej z nich z DNA genomowego. Startery powinny być dobrane tak, aby amplifikować region konserwowany oraz co najmniej 30 par zasad z każdej strony.
3. Do amplifikacji wybranych sekwencji stosujemy system Takara LA TaqTM. Można użyć innych polimeraz, jednak ważne jest zastosowanie mieszaniny zawierającej enzym z aktywnością korektorską (proofreading), aby zminimalizować ryzyko wprowadzenia błędów podczas amplifikacji. Wielkość amplikonu weryfikujemy za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
4. Do sklonowania produktu PCR do wektora wejściowego zawierającego miejsca rekombinacji attL w celu wygenerowania klonu wejściowego Gateway używamy zestawu pCR 8/GW/TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen). Reakcja klonowania jest bardziej wydajna przy użyciu świeżego produktu PCR, dlatego najlepiej przeprowadzić ją w ciągu jednego dnia od przeprowadzenia PCR. Następnie wykonuje się transformację szczepów DH5α, a następnie selekcję oporności na spektynomycynę.
5. Produkt klonowania TA weryfikujemy poprzez trawienie ok. 500 ng plazmidu enzymem EcoRI w celu uwolnienia wstawki, a wielkość wstawki potwierdzamy za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Zalecamy sekwencjonowanie w celu weryfikacji sekwencji i orientacji wstawki; startery użyte do amplifikacji mogą zostać wykorzystane również do sekwencjonowania.
6. Z klonu wejściowego niekodująca sekwencja konserwowana jest przenoszona drogą rekombinacji LR do naszego wektora docelowego gotowego do Gateway, pGW_cfosGFP1, przy użyciu mieszaniny enzymów Gateway LR Clonase II (Invitrogen). Następnie wykonuje się transformację szczepów DH5α, a potem selekcję oporności na ampicylinę.
7. Produkt rekombinacji LR weryfikujemy poprzez trawienie ok. 500 ng plazmidu enzymem EcoRV w celu uwolnienia wstawki, a wielkość wstawki potwierdzamy za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Po zidentyfikowaniu prawidłowego klonu przygotowujemy DNA plazmidowe za pomocą zestawu Qiagen HiSpeed® Plasmid Midi Kit. Następnie dodatkowo oczyszczamy plazmid za pomocą zestawu QIAquick PCR Purification Kit, zgodnie z protokołami producenta, i eluujemy DNA w 30 μL wody wolnej od RNaz. Plazmid rozcieńczamy do stężenia 125 ng/μL i przechowujemy w 4°C przed iniekcjami.
8. RNA kodujące funkcjonalny enzym transpozazę Tol2 jest transkrybowane in vitro z plazmidu pDB600. Oczyszczamy plazmid za pomocą zestawu Qiagen Midi-Prep, a następnie linearyzujemy 10-20 μg enzymem XbaI. Synteza mRNA jest przeprowadzana zgodnie z protokołem zestawu mMESSAGE mMACHINE Kit (Ambion).
9. RNA oczyszczamy i wytrącamy zgodnie z instrukcjami zestawu. RNA resuspendujemy w wodzie wolnej od RNaz do stężenia końcowego ok. 1 μg/μl (lub 20 μl na jedną reakcję) i oznaczamy ilościowo za pomocą spektrofotometrii UV. Analizujemy również ok. 1 μg RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, aby zweryfikować pełną długość transkrypcji. Choć do tej analizy wystarczający jest standardowy żel TAE lub TBE, należy użyć denaturującego buforu do próbek dołączonego do zestawu do transkrypcji, zgodnie z instrukcją zestawu.
10. Każdą nową partię RNA transpozazy testujemy pod kątem skuteczności, wykonując iniekcje z znanym plazmidem (Rysunek 1). Po weryfikacji RNA dzieli się na małe alikwoty i przechowuje w -80°C, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania poszczególnych alikwotów.
    
    Rysunek 1. Zarodek danio pręgowanego z wstrzykniętym wzmacniaczem Sox10 myszy jako kontrolą.(Góra) Obraz w świetle przechodzącym (Dół) obraz fluorescencji GFP. Każda nowa partia RNA transpozazy jest testowana pod kątem skuteczności.

2. Mikroiniekcja embrionów zebrafish do mozaikowej analizy transgenicznej

1. Igły do mikroiniekcji wyciągamy z kapilar szklanych o średnicy zewnętrznej 1,2 mm za pomocą wyciągacza mikropipet Sutter P-97, korzystając z programu opracowanego w celu uzyskania wytrzymałej końcówki o dość ostrym zwężeniu, umożliwiającym przebicie nienaruszonych chorionów. Końcówki odłamujemy ręcznie pod stereomikroskopem do średnicy zewnętrznej wynoszącej około 15 μmprzy użyciu czystego ostrza brzytwy i szkiełka mikrometrycznego. Igły można przygotować dzień przed iniekcjami i przechowywać w przykrytym naczyniu, aby zachować ich czystość.
2. Zebrafish utrzymujemy w regularnym cyklu światła i ciemności, z 14-godzinnym okresem oświetlenia, w warunkach standardowych3. Dzień przed wykonaniem mikroiniekcji przygotowujemy ryby do zapłodnienia w określonym czasie w małych zbiornikach hodowlanych, z których każdy składa się z podstawowego zbiornika, wkładki z nacięciami oraz plastikowej pokrywy. W równoległych rzędach umieszczamy w każdym zbiorniku trzy samice lub dwa samce.
3. W dniu przeprowadzania mikroiniekcji, krótko po rozpoczęciu cyklu świetlnego, przystępujemy do łączenia samców i samic w czystej wodzie systemowej w celu uzyskania ikry. Ważne jest częste monitorowanie ryb i zbieranie jaj w ciągu kilku minut od ich złożenia, aby uzyskać dobrze zsynchronizowane partie. Produkcję ikry można utrzymać przez dwie do trzech godzin, sukcesywnie łącząc świeże grupy ryb przez cały poranek.
4. Za pomocą szklanej pipety Pasteura o szerokim otworze (5 1/4") wyposażonej w lateksową gruszkę, sortujemy zebrane zarodki do szalek Petriego o wymiarach 60 x 15 mm, częściowo wypełnionych pożywką Embryo Medium2, dzieląc je na grupy po 50 zarodków, a na pokrywie każdej szalki zaznaczamy czas zbioru.
5. Gdy ryby zaczną składać ikrę, przygotowujemy świeży roztwór do iniekcji, mieszając w probówce do wirówki w lodzie następujące składniki:

   Komponent
   Zapas plazmidu transpozonu (125 ng/μl)	1μl
   stok RNA transpozazy (175 ng/μl)	1μl
   Roztwór zapasowy czerwieni fenolowej (2% w H2O)2O)	0.5μl
   woda wolna od RNaz	2.5μl

   
   Igły do iniekcji umieszcza się w naczyniach utrzymujących i napełnia, pipetując krople 500 nl roztworu do iniekcji na szeroki koniec każdej igły. Po wciągnięciu cieczy do czubka na drodze działania kapilarnego można dodać kolejny roztwór do łącznej objętości 1,5-2 μlPrzygotowujemy co najmniej dwie igły dla każdego roztworu do wstrzyknięcia.
6. Napełnioną igłę umieszcza się w ręcznym uchwycie igłowym pneumatycznej pompki Pico-Pump lub podobnego wstrzykiwacza ciśnieniowego, skonfigurowanego i podłączonego do zbiornika z N2 zgodnie z instrukcjami producenta. Kalibrujemy objętości wstrzykiwania poprzez pomiar średnicy kropel wydalanych do oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym. Zazwyczaj czas wstrzykiwania wynoszący 120 ms przy ciśnieniu 20 p.s.i. pozwoli uzyskać kroplę o objętości około 1 nl, jednak niewielkie różnice w średnicy igły wpływają na te parametry, co może wymagać ponownej kalibracji przy zmianie igły.
7. Iniekcje wykonuje się pod stereomikroskopem przy powiększeniu 6-10X. Za pomocą precyzyjnej pęsety unieruchamiamy zarodek, a następnie jednostajnym naciskiem wprowadzamy igłę do iniekcji przez chorion do żółtka zarodka w stadium jednej komórki lub wczesnego dwukomórkowego stadium. Optymalnie końcówkę igły umieszcza się w żółtku bezpośrednio pod blastomerami. Wstrzykuje się około 1 nl roztworu iniekcyjnego, po czym igłę wycofuje się. Dla każdego konstruktu wykonuje się iniekcje w ≥ 200 zarodkach. Bardzo ważne jest również, aby z każdej zebranej partii zarodków zachować szalkę z nieiniekcyjnymi zarodkami kontrolnymi.
8. Po zakończeniu iniekcji dokonujemy selekcji embrionów, usuwając niezapłodnione komórki jajowe, embriony uszkodzone oraz przypadki nieudanych iniekcji (embriony bez czerwieni fenolowej w blastomerach). Następnie inkubujemy embriony w pożywce dla embrionów w temperaturze 28.5°C do odpowiedniego momentu przeprowadzenia obserwacji.

3. Analiza mozaikowych wzorców ekspresji

1. Po odpowiednim czasie inkubacji badamy wstrzyknięte embriony pod kątem fluorescencji. Termin badania zależy od normalnego wzorca ekspresji endogennego genu danino pręgowanego, jednak zazwyczaj obserwujemy je codziennie przez pierwsze 5 dni po zapłodnieniu.
2. Embriony badamy pod kątem fluorescencji przy użyciu makroskopu Olympus MVX10 przystosowanego do epifluorescencji, choć sprawdzi się każdy podobny mikroskop umożliwiający obrazowanie przy niskim powiększeniu. Jeśli duża liczba embrionów obumarła lub rozwijała się nieprawidłowo w pierwszej dobie, należy sprawdzić niezatrzymane kontrole z danego lęgu, aby ocenić, czy wyglądają one normalnie. Jeśli kontrole są prawidłowe, najczęstszym problemem jest niewystarczająca czystość wstrzykniętego DNA. Ponadto embriony we wczesnych stadiach są wrażliwe na całkowitą ilość wstrzykniętego plazmidu, więc możliwe jest, że kwantyfikacja była niedokładna i wstrzyknięto zbyt dużo DNA.
3. Podczas badania embrionów należy pamiętać, że wszystkie będą one mozaikami w odniesieniu do wstrzykniętej konstrukcji. Konieczne jest uważne obejrzenie wszystkich embrionów, zwłaszcza jeśli oczekiwany obszar ekspresji jest niewielki. Należy również pamiętać, że ekspresja może być dynamiczna; silna fluorescencja w 1. dniu może zniknąć do 2. dnia, a embriony negatywne pod kątem ekspresji przez pierwsze 3 dni mogą wykazać sygnał w 4. dniu.
4. Wybieramy kilka embrionów z bardziej rozległą ekspresją i wykorzystujemy je do udokumentowania wzorca fluorescencji za pomocą fotomikroskopii. Po 5 dniach obserwacji embriony powinny zostać przekazane z powrotem do jednostki hodowlanej i hodowane jako stado. Po kilku miesiącach u osobników dorosłych można przeprowadzić screening w kierunku transmisji transgenów w linii zarodkowej.

4. Wyniki

Obserwujemy szeroką różnorodność wzorów i poziomów ekspresji, w zależności od analizowanego elementu enhansera. Zazwyczaj interesują nas wzory ekspresji ściśle tkankowo specyficzne, często koncentrując się na genach wykazujących ekspresję w szkielecie. Rycina 2 przedstawia przykłady mozaikowych wzorów ekspresji zaobserwowanych w naszych wstrzykniętych embrionach, z enhanserami regulującymi ekspresję w chrząstce i kościach. Wreszcie, znaczna część przetestowanych sekwencji nie reguluje ekspresji tkankowo specyficznej. W ich przypadku najczęściej obserwujemy bardzo słabą fluorescencję, ograniczoną być może do kilku rozproszonych komórek na embrion. Rzadziej może wystąpić fluorescencja, ale tylko w dwóch typowych miejscach ekspresji ektopowej: w naskórku i mięśniach szkieletowych (Rycina 3).

Rycina 2. Przykład wzorów ekspresji w chrząstce i kościach zaobserwowanych w wstrzykniętych embrionach.

Rycina 3. Istnieje niewielka korelacja między położeniem enhansera względem genu a regulacją ekspresji. Znaczna część przetestowanych sekwencji nie reguluje ekspresji tkankowo specyficznej. Te często wykazują bardzo słabą fluorescencję lub mogą mieć dwa typowe miejsca ekspresji ektopowej: naskórek i mięśnie szkieletowe. (Góra) Obraz w polu jasnym (Dół) obraz fluorescencji GFP.

Dyskusja

Zaprezentowaliśmy podejście stosowane w naszym laboratorium do wydajnej analizy potencjalnych enhancerów z wykorzystaniem transgenezy u danio pręgowanego. Najczęściej stosujemy tę metodę do poszukiwania enhancerów tkankowo swoistych powiązanych z genami ludzkimi. Mimo że większość czasu brakuje wyraźnej homologii sekwencji między ludzkimi a rybimi sekwencjami niekodującymi, stwierdzamy, że podejście to zazwyczaj pozwala na skuteczną identyfikację enhancerów dla interesujących nas genów. Krytycznymi czynnikami warunkujący...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Takara LA Taq	Takara Bio Inc	RR02M
Zestaw do klonowania pCR8/GW/TOPO TA	Invitrogen	K2500-20
Mieszanina enzymów Gateway LR Clonase II	Invitrogen	11791-100
Komórki kompetentne Library efficiency DH5α	Invitrogen	12535-019
Komórki kompetentne Library efficiency DB3.1	Invitrogen	11782-018
Zestaw mMESSAGE mMACHINE	Ambion	AM1340
Zestaw HiSpeed Plasmid Midi	Qiagen	12643
Zestaw do oczyszczania PCR QIAquick	Qiagen	28104
Wytwarzarka pipet mikropipetowych Flaming/Brown	Sutter Instrument Co.	P-97
Pneumatyczna pompa PicoPump	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820