Artykuł metodologiczny

Poprzeczne zwężenie aorty u myszy

68.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/1729

⸱

21 kwietnia 2010

 ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine (BCM), 2The Margaret M. and Albert B. Alkek Department of Medicine, Baylor College of Medicine (BCM)

W tym artykule

Podsumowanie

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest powszechnie stosowanym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów leżących u podstaw przerostu mięśnia sercowego i rozwoju niewydolności serca. W niniejszym materiale opisujemy procedury zwężania aorty w celu wywołania powtarzalnego stopnia przerostu serca u myszy.

Streszczenie

Poprzeczna konstrikcja aorty (TAC) u myszy jest powszechnie stosowanym modelem eksperymentalnym przerostu serca i niewydolności serca indukowanych przeciążeniem ciśnieniowym.1TAC prowadzi początkowo do kompensacyjnej hipertrofii serca, której często towarzyszy tymczasowe zwiększenie kurczliwości mięśnia sercowego. Z czasem jednak odpowiedź na przewlekłe przeciążenie hemodynamiczne staje się nieadaptacyjna, co prowadzi do dylatacji serca i niewydolności serca.2Model TAC u myszy został po raz pierwszy zwalidowany przez Rockmanai wsp.empty1, i od tego czasu jest on szeroko stosowany jako cenny model do naśladowania ludzkich chorób sercowo-naczyniowych oraz wyjaśniania fundamentalnych procesów sygnalizacyjnych zaangażowanych w odpowiedź przerostową serca i rozwój niewydolności serca. W porównaniu z innymi eksperymentalnymi modelami niewydolności serca, takimi jak całkowite zamknięcie lewej przedniej tętnicy wieńcowej (LAD), TAC zapewnia bardziej powtarzalny model przerostu serca oraz bardziej stopniowy przebieg rozwoju niewydolności serca. W niniejszej pracy opisujemy szczegółową procedurę chirurgicznego wykonania TAC u myszy. Aby określić poziom przeciążenia ciśnieniowego wywołanego podwiązaniem aorty, stosuje się wysokoczęstotliwościową sondę Dopplera do pomiaru stosunku prędkości przepływu krwi w prawej i lewej tętnicy szyjnej.3, 4Przy przeżywalności pooperacyjnej na poziomie 80-90%, poprzeczne opaskowanie aorty jest skuteczną techniką indukowania przerostu lewej komory oraz niewydolności serca u myszy.

Protokół

Część 1: Przygotowanie pola operacyjnego

  1. Pole operacyjne dezynfekuje się 75% alkoholem izopropylowym.
  2. Należy upewnić się, że mata grzewcza jest włączona i ustawiona na odpowiednią temperaturę. Zalecanym systemem jest pompa cyrkulacyjna do wody Gaymar połączona z matą terapeutyczną utrzymywaną w temperaturze 37 °C ± 1 °C. Podczas operacji ważne jest utrzymanie prawidłowej temperatury ciała, aby uniknąć gwałtownego spadku częstotliwości akcji serca.
  3. Przed operacją narzędzia chirurgiczne sterylizuje się w sterylizatorze perlowym. Do przeprowadzenia tej procedury będą potrzebne następujące instrumenty chirurgiczne: nożyczki tępe, kleszczyki zakrzywione grube (2 szt.), kleszczyki precyzyjne pod kątem 45° (2 szt.), nożyczki sprężynowe kątowe, rozwierak klatki piersiowej oraz uchwyt do igieł.
  4. Patyczki bawełniane powinny być pod ręką na wypadek wystąpienia krwawienia.

Część 2: Przygotowanie i intubacja myszy

  1. Myszy są znieczulane w komorze indukcyjnej przy użyciu 2% izofluranu zmieszanego z 0,5 -1,0 L/min 10% O2.
  2. Za pomocą trymmera golona jest sierść od linii szyi do połowy klatki piersiowej.
  3. Mysz jest ułożona w pozycji grzbietowej na podkładce grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała.
  4. Gumka recepturka zostaje założona nad przednimi zębami zwierzęcia, aby wyprostować szyję. Przy użyciu zakrzywionych pęsety w jednej ręce, język jest delikatnie odsuwany na bok. Drugą ręką wykonuje się intubację endotrachealną przy użyciu rurki PE 90. Rurka endotrachealna zostaje następnie podłączona do respiratora dla gryzoni Harvard z cyklem objętościowym, ustawionego na 125-150 oddechów/minutę i objętość oddechową 0,1-0,3ml. Podczas procedury chirurgicznej znieczulenie jest utrzymywane na poziomie 1,5-2% izofluranu z 0,5 - 1,0 L/min 100% O2. Prawidłowy poziom znieczulenia jest weryfikowany poprzez ucisk łożyska paznokciowego myszy (odruchycowe ściśnięcie palca).
  5. Pole operacyjne jest odkażane roztworem betadyny, a następnie 70% alkoholem. Procedurę tę powtarza się trzykrotnie.
  6. Aby zapobiec zanieczyszczeniu pola operacyjnego podczas zabiegu, mysz przykrywa się sterylną chustą, pozostawiając odsłonięte jedynie pole operacyjne.
  7. Dla każdej myszy używana jest nowa para sterylnych rękawiczek.

Część 3: Podwiązanie aorty poprzecznej

  1. Pod mikroskopem chirurgicznym wykonuje się częściową torakotomię do poziomu drugiego żebra, a mostek zostaje rozchylony za pomocą rozieracza klatki piersiowej.
  2. Za pomocą pęsety o cienkim czubku i kącie 45° delikatnie oddziela się grasicę i tkankę tłuszczową od łuku aorty.
  3. Po zidentyfikowaniu aorty poprzecznej, niewielki fragment nici jedwabnej 6.0 umieszcza się pomiędzy tętnicą bezimienną a lewą tętnicą szyjną (Rysunek 1).
  4. Wokół aorty poprzecznej zawiązuje się dwa luźne węzły, a równolegle do aorty poprzecznej umieszcza się mały fragment tępej igły o rozmiarze 27½ G. Pierwszy węzeł szybko zaciska się na igle, następnie zawiązuje drugi, a igłę niezwłocznie usuwa się, aby uzyskać zwężenie o średnicy 0,4 mm. U myszy w grupie kontrolnej (sham) cała procedura jest identyczna, z wyjątkiem podwiązania aorty.
  5. Rozieracz klatki piersiowej zostaje usunięty, a odpływ z respiratora zostaje zakleszczony na 2 sekundy w celu ponownego napowietrzenia płuc.
  6. Klatka piersiowa zostaje zamknięta szwem przerywanym przy użyciu nici Prolene 6.0.
  7. Skórę zamyka się szwem ciągłym przy użyciu nici Prolene 6.0.

Część 4: Rekonwalescencja pooperacyjna

  1. W celu zapewnienia przeciwbólowego działania po operacji, myszy podaje się buprenorfinę (0.1 mg/kg) drogą dosytronewną. W przypadku wystąpienia objawów odwodnienia po zabiegu, podaje się sterylną sól fizjologiczną drogą dosytronewną.
  2. Anestezję stopniowo zmniejsza się do poziomu wyłączenia, a rurkę endotrachealną usuwa się w momencie pojawienia się oznak oddychania spontanicznego.
  3. Mysz układa się w pozycji brzusznej i pozostawia do wybudzenia na podgrzewaczce.

Część 5: Potwierdzenie pomyślnego podwiązania aorty poprzecznej

  1. Tydzień po zabiegu TAC mysz poddaje się ponownej anestezji w celu określenia stopnia przeciążenia ciśnieniowego wywołanego podwiązaniem tętnicy aortowej. Zgodnie z powyższym opisem, znieczulenie utrzymuje się przy użyciu 1,5-2% izofluranu z dopływem 0,5 - 1,0 L/min 10% O2, a temperatura ciała jest utrzymywana na poziomie 37 °C ± 1 °C.
  2. Sondę Dopplera o częstotliwości 20 MHz umieszcza się po lewej i prawej stronie szyi pod kątem 45°, aby zmierzyć prędkości przepływu. Do wyświetlania i zapisywania sygnałów Dopplera wykorzystano komputerowy procesor sygnałów Dopplera (Indus Instruments, Houston, TX).5
  3. W zależności od stopnia przeciążenia ciśnieniowego wymaganego w protokole eksperymentalnym, do dalszych analiz włączane są tylko myszy, u których stosunek przepływu w prawej tętnicy szyjnej (RC) do lewej tętnicy szyjnej (LC) mieści się w określonym zakresie. Przykładowo, umiarkowany stopień przeciążenia ciśnieniowego prowadzi do stosunku 5-8, natomiast silniejsza konstrikcja skutkująca ciężkim przeciążeniem ciśnieniowym prowadzi do stosunku 8-10 (Rysunek 5.3A). W przypadku zwierzęcia z grupy sham (poddanego operacji, ale bez podwiązania), oczekiwanym stosunkiem jest wartość ~1 (Rysunek 5.3B).

6: Reprezentatywne wyniki

Typowa przeżywalność pooperacyjna po TAC u myszy typu dzikiego wynosi około 80-90%. Prawidłowe chirurgiczne podwiązanie aortny poprzecznej prowadzi do uzyskania stosunku prędkości przepływu Dopplera między prawą a lewą tętnicą szyjną (RC/LC) w zakresie 5-10 (Rysunek 1). W porównaniu z myszami poddanymi operacji pozornej (Rysunek 2A), u myszy z przeciążeniem ciśnieniowym oczekiwany jest rozwój przerostu serca w ciągu 1-2 tygodni oraz rozszerzenie serca po 6-8 tygodniach, w zależności od stopnia zaciśnięcia więzadła (Rysunek 2B). Śmiertelność w ciągu pierwszego miesiąca po TAC jest zazwyczaj niska (<20%) u myszy typu dzikiego, choć u myszy modyfikowanych genetycznie wskaźniki przeżywalności mogą być inne.6,7

Schemat anatomii naczyń krwionośnych z przebiegami fali tętna szyjnego; ilustracja pomiaru przepływu krwi.
Rysunek 1. Potwierdzenie poprzecznego podwiązania aorty za pomocą pomiaru prędkości przepływu w badaniu Dopplera. Reprezentatywne sygnały prędkości dopplerowskiej prawej (RC) i lewej (LC) tętnicy szyjnej 6 dni po TAC. Rejestracje te wykazują pomyślną ligację z stosunkiem przepływu RC/LC wynoszącym ok. 6,8. kliknij tutaj aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

Porównanie wielkości serc zwierzęcych; badanie anatomiczne, analiza rozmiaru z użyciem linijki pomiarowej.
Rycina 2. Reprezentatywne obrazy całego serca po TAC. ASerce myszy typu dzikiego po zabiegu pozorowanym. BSerce myszy typu dzikiego 16 tygodni po zabiegu TAC. Każda linia = 1 mm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

TAC, który imituje ludzką stenozę aorty, jest powszechną metodą indukowania przerostu mięśnia sercowego i niewydolności serca u myszy. Alternatywnymi miejscami zwężenia aorty są aorta wstępująca oraz aorta brzuszna. Zwężenie aorty wstępującej powoduje ekstremne i szybsze przeciążenie lewej komory (LV). Z kolei zwężenie aorty brzusznej pozostawia nienaruszoną większą część układu krążenia, co może służyć jako mechanizm kompensacyjny.8 Dlatego TAC jest często preferowanym modelem, ponieważ zapewnia odpowiednie p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

X.H.T.W. jest wyróżniającym się młodym naukowcem w dziedzinie badań medycznych (W.M. Keck Foundation Distinguished Young Scholar in Medical Research) i otrzymuje wsparcie z grantów NIH/NHLBI o numerach R01-HL089598 oraz R01- R01HL091947, a także z grantu Muscular Dystrophy Association nr 69238. R.J.v.O. jest laureatem stypendium podoktorskiego American Physiological Society w zakresie genomiki fizjologicznej w latach 2008-2010. Praca ta jest również częściowo wspierana przez Fondation Leducq Alliance for CaMKII Signaling in Heart.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa Gaymar T/pumpHarvard ApparatusModel TP-500Pompa do obiegu wody
Podkładki do terapii termicznejHarvard Apparatus60-3414
Sterylizator kuleczkowyFine Science Tools18000-45
Nożyczki tępeRoboz Surgical Instruments Co.RS-5980
Nożyczki sprężynowe kątoweRoboz Surgical Instruments Co.RS-5668
Rozwierak klatki piersiowejFine Science Tools17002-02
Pinceta zakrzywiona grubaRoboz Surgical Instruments Co.RS-5138
Pinceta precyzyjna Dumont pod kątem 45°Fine Science Tools11253-25
IgłotrzymaczFine Science Tools12565-14
Golarka elektrycznaGE HealthcareDo golenia futra myszy
Przewód PE 90BD Biosciences427420Do intubacji
MiniVent (respirator)Harvard ApparatusType 845
BetadineFisher Scientific19-027132Można nabyć w sklepie z artykułami medycznymi
Rękawiczki sterylneMckesson20-1565
Mikroskop stereoskopowyUnicoZM186
Nici jedwabne 6-0Fine Science Tools18020-60
Igła G 27 ½BD Biosciences305109
Nici prolenowe 6-0Mckesson3286
BuprenorfinaInstitutional Animal Facility

Bibliografia

  1. Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
  2. Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7, 589-600 (2006).
  3. Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med. Biol. 34, 892-901 (2008).
  4. Reddy, A. K., Taffett, G. E., Li, Y. -H., Lim, S. -W., Pham, T. T., Pocius, J. S., Entman, M. L., Michael, L. H., Hartley, C. J. Doppler signal processing for use in mice: applications. IEEE Trans. Biomed. Eng. 52, 1771-1783 (2005).
  5. Li, Y. -H., Reddy, A. K., Ochoa, L. N., Pham, T. T., Hartley, C. J., Micheal, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. J. Gerontol. 58A, 895-899 (2003).
  6. Bourajjaj, M., Armand, A. S., Martins, daC. osta, Weijts, P. A., Nagel, B. V. ander, Heeneman, R., Wehrens, S., Windt, X. H. D. e, J, L. NFATc2 is a necessary mediator of calcineurin-dependent cardiac hypertrophy and heart failure. J. Biol. Chem. 28, 22295-22303 (2008).
  7. Oort, R. J. van, Respress, J. L., Li, N., Reynolds, C., Almeida, A. C. D. e, Skapura, D. G., Windt, L. J. D. e, Wehrens, X. H. Accelerated development of pressure overload induced cardiac hypertrophy and dysfunction in an RyR2-R176Q knockin mouse model. Hypertension. 55, (2010).
  8. Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przerost mi nia sercowegomodel niewydolno ci sercachirurgia myszypomiar pr dko ci Doppleratechnika podwi zania aortyprocedura chirurgicznaprzeci enie ci nienioweprzep yw w t tnicy szyjnejopieka pooperacyjna

Powiązane artykuły