Poprzeczne zwężenie aorty u myszy

Podsumowanie

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest powszechnie używanym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju przerostu serca i niewydolności serca. Tutaj opisujemy procedury zwężania aorty w celu wytworzenia powtarzalnego stopnia przerostu serca u myszy.

Streszczenie

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest powszechnie stosowanym modelem eksperymentalnym przerostu serca i niewydolności serca wywołanego przeciążeniem ciśnieniem. ¹ TAC początkowo prowadzi do wyrównanego przerostu serca, co często wiąże się z tymczasowym zwiększeniem kurczliwości serca. Z czasem jednak reakcja na przewlekłe przeciążenie hemodynamiczne staje się nieprzystosowawcza, co prowadzi do rozszerzenia serca i niewydolności serca. ² Mysi model TAC został po raz pierwszy zweryfikowany przez Rockmana i wsp. ¹ i od tego czasu jest szeroko stosowany jako cenne narzędzie do naśladowania ludzkich chorób sercowo-naczyniowych i wyjaśniania podstawowych procesów sygnalizacyjnych zaangażowanych w odpowiedź przerostową serca i rozwój niewydolności serca. W porównaniu z innymi eksperymentalnymi modelami niewydolności serca, takimi jak całkowita niedrożność lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD), TAC zapewnia bardziej powtarzalny model przerostu serca i bardziej stopniowy przebieg w czasie rozwoju niewydolności serca. Tutaj opisujemy krok po kroku procedurę wykonywania chirurgicznego TAC u myszy. Aby określić poziom przeciążenia ciśnieniowego wytwarzanego przez podwiązanie aorty, stosuje się sondę dopplerowską o wysokiej częstotliwości do pomiaru stosunku prędkości przepływu krwi w prawej i lewej tętnicy szyjnej. ^{3, 4} Przy wskaźnikach przeżycia chirurgicznego wynoszących 80-90%, poprzeczne pasmo aorty jest skuteczną techniką wywoływania przerostu lewej komory i niewydolności serca u myszy.

Protokół

Część 1: Przygotowanie pola operacyjnego

1. Pole operacyjne jest dezynfekowane 75% alkoholem izopropylowym.
2. Upewnij się, że poduszka grzewcza jest włączona i ma odpowiednią temperaturę. Zalecanym systemem jest pompa wody obiegowej Gaymar podłączona do podkładki terapeutycznej, która jest utrzymywana w temperaturze 37 °C ± 1 °C. Ważne jest, aby podczas operacji utrzymać prawidłową temperaturę ciała, aby uniknąć gwałtownego spadku częstości akcji serca.
3. Narzędzia chirurgiczne są przed zabiegiem sterylizowane w sterylizatorze z gorącymi kulkami. Do tej procedury potrzebne będą następujące narzędzia chirurgiczne: nożyczki, kleszcze zakrzywione X 2, cienkie kleszcze kątowe X 2, kątowe nożyczki sprężynowe, retraktor klatki piersiowej i uchwyt igły.
4. Bawełniane aplikatory powinny być pod ręką na wypadek krwawienia.

Część 2: Przygotowanie i intubacja myszy

1. Myszy są znieczulane w komorze indukcyjnej z 2% izofluranem zmieszanym z 0,5 -1,0 L/min 100% O₂ .
2. Maszynki do strzyżenia włosów służą do golenia sierści od dekoltu do połowy klatki piersiowej.
3. Mysz jest umieszczana w pozycji leżącej na poduszce grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała.
4. Na przednie zęby zwierzęcia nakłada się gumkę, aby przedłużyć szyję. Używając zakrzywionych kleszczy w jednej ręce, język jest delikatnie manipulowany na bok. Z drugiej strony intubacja dotchawicza jest wykonywana za pomocą rurki PE 90. Rurka dotchawicza jest następnie podłączana do respiratora dla gryzoni z cyklem objętościowym Harvard, który pracuje z prędkością 125-150 oddechów na minutę i objętością oddechową 0,1-0,3 ml. Podczas zabiegu chirurgicznego znieczulenie utrzymuje się na poziomie 1,5-2% izofluranu o stężeniu 0,5 - 1,0 L/min 100%_O2. Prawidłowy poziom znieczulenia weryfikowany jest poprzez ucisk na łożysko paznokcia myszy (odruch szczypania palca).
5. Pole operacyjne jest dezynfekowane roztworem betadyny, a następnie 70% alkoholem. Ta procedura jest powtarzana trzy razy.
6. Aby zapobiec zanieczyszczeniu pola operacyjnego podczas operacji, na mysz nakłada się sterylną zasłonę, pozostawiając odsłonięte tylko pole operacyjne.
7. Do każdej myszy z osobna używany jest zestaw sterylnych rękawiczek.

Część 3: Podwiązanie aorty poprzecznej

1. Częściową torakotomię drugiego żebra wykonuje się pod mikroskopem operacyjnym, a mostek cofa się za pomocą retraktora klatki piersiowej.
2. Kleszczyki z cienką końcówką pod kątem 45° służą do delikatnego oddzielania grasicy i tkanki tłuszczowej od łuku aorty.
3. Po zidentyfikowaniu aorty poprzecznej mały fragment nici jedwabnej 6,0 umieszcza się między tętnicą szyjną bezimienną a lewą (ryc. 1).
4. Dwa luźne węzły są zawiązane wokół aorty poprzecznej, a mały kawałek igły o rozmiarze 271/2 jest umieszczony równolegle do aorty poprzecznej. Pierwszy węzeł jest szybko wiązany na igle, następnie drugi, a igła jest natychmiast usuwana, aby uzyskać zwężenie o średnicy 0,4 mm. U myszy kontrolnych pozorowanych cała procedura jest identyczna, z wyjątkiem podwiązania aorty.
5. Retraktor klatki piersiowej jest usuwany, a odpływ respiratora jest ściskany na 2 sekundy, aby ponownie napompować płuca.
6. Klatka piersiowa jest zamknięta za pomocą szwu prolenowego 6,0 z przerwanym wzorem szwów.
7. Skóra jest zamykana za pomocą nici prolenowej 6,0 z ciągłym wzorem szwów.

Część 4: Rekonwalescencja pooperacyjna

1. W przypadku analgezji pooperacyjnej myszowi wstrzykuje się dootrzewnowo buprenorfinę (0,1 mg/kg). Jeśli po operacji występują oznaki odwodnienia, sterylną sól fizjologiczną podaje się dootrzewnowo.
2. Znieczulenie jest stopniowo opuszczane do pozycji wyłączonej, a rurka dotchawicza jest usuwana, gdy pojawią się oznaki spontanicznego oddychania.
3. Mysz jest przesuwana do pozycji leżącej i pozostawiana do odzyskania na poduszce grzewczej.

Część 5: Potwierdzenie udanego podwiązania aorty poprzecznej

1. Tydzień po TAC mysz jest ponownie znieczulana w celu określenia stopnia przeciążenia ciśnieniowego wywołanego podwiązaniem aorty poprzecznej. Jak opisano powyżej, znieczulenie utrzymuje się na poziomie 1,5-2% izofluranu przy 0,5 - 1,0 l/min 100%_O2 i temperaturze ciała utrzymywanej na poziomie 37 °C ± 1 °C.
2. Sonda dopplerowska 20 MHz jest umieszczona po lewej i prawej stronie szyjki pod kątem 45° w celu wykrycia prędkości przepływu. Komputerowy dopplerowski procesor sygnałowy (Indus Instruments, Houston, TX) został użyty do wyświetlania i przechowywania sygnałów dopplerowskich. ⁵
3. W zależności od stopnia przeciążenia ciśnieniem wymaganego w protokole eksperymentalnym, do dalszej analizy włączane są tylko myszy ze stosunkiem przepływu prawej tętnicy szyjnej (RC) do lewej tętnicy szyjnej (LC) w określonym zakresie. Na przykład umiarkowany stopień przeciążenia ciśnieniem prowadzi do stosunku 5-8, podczas gdy ściślejsze zwężenie powodujące poważne przeciążenie ciśnieniowe prowadzi do stosunku 8-10 (rysunek 5.3A). Oczekuje się jednak, że zwierzę pozorowane (operowane, ale nie podwiązane) będzie miało stosunek ~1 (ryc. 5.3B).

6: Reprezentatywne wyniki

Typowy chirurgiczny czas przeżycia po TAC u myszy typu dzikiego wynosi około 80-90%. Udane chirurgiczne podwiązanie aorty poprzecznej doprowadzi do dopplerowskiego stosunku prędkości przepływu między prawą i lewą tętnicą szyjną (RC/LC) wynoszącym 5-10 (ryc. 1). W porównaniu z myszami operowanymi pozorami (ryc. 2A), oczekuje się, że u myszy z przeciążeniem ciśnieniowym rozwinie się przerost serca w ciągu 1-2 tygodni, a poszerzenie serca po 6-8 tygodniach, w zależności od szczelności zwężenia (ryc. 2B). Śmiertelność w pierwszym miesiącu po TAC jest zazwyczaj niska (<20%) u myszy typu dzikiego, chociaż myszy zmodyfikowane genetycznie mogą wykazywać różne wskaźniki przeżycia. ^6,7

Rysunek 1. Potwierdzenie podwiązania aorty poprzecznej za pomocą dopplerowskiego pomiaru prędkości. Reprezentatywne dopplerowskie sygnały prędkości prawej (RC) i lewej tętnicy szyjnej (LC) 6 dni po TAC. Nagrania te pokazują udane podwiązanie ze stosunkiem przepływu RC/LC wynoszącym ~6,8. Proszę kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję rysunku 1.

Rysunek 2. Reprezentatywne obrazy całego serca po TAC. A. Fałszywe serce myszy typu dzikiego. B. Serce myszy typu dzikiego 16 tygodni po TAC. Każda linia = 1mm.

Dyskusja

TAC, który naśladuje ludzkie zwężenie zastawki aortalnej, jest powszechną metodą wywoływania przerostu serca i niewydolności serca u myszy. Alternatywnymi miejscami zwężenia aorty są aorta wstępująca i brzuszna. Zwężenie aorty wstępującej zapewnia ekstremalne i szybsze przeciążenie lewej komory (LV). Natomiast zwężenie aorty brzusznej pozostawia nienaruszoną większą część krążenia jako sposób możliwej kompensacji. ⁸ W związku z tym TAC jest często preferowanym modelem, ponieważ zapewnia odpowiednie przeciążeni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Gaymar T / pump	Aparat Harvard	Model TP-500	Pompa wody obiegowej
Temp. podkładki terapeutyczne Aparat	Harvarda	60-3414
Sterylizator gorących koralików	Fine Science Tools	18000-45
nożyczki	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5980
Kątowe nożyczki sprężynowe	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5668
Retraktor klatki piersiowej	Fine Science Tools	17002-02
Kleszcze zakrzywione kursu	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5138
Kleszcze kątowe Dumont fine 45° Fine	Science Tools	11253-25
Uchwyt na igłę	Fine Science Tools	12565-14
Golarka elektryczna	GE Healthcare		Do golenia futra myszy
Rurka PE 90	BD Biosciences	427420	Do intubacji
MiniVent (respirator)	Aparat Harvard	Typ 845
Betadine	Fisher Scientific	19-027132	Można kupić w sklepie z artykułami medycznymi
Sterylne rękawiczki	Mckesson	20-1565
Mikroskop stereoskopowy	Unico	ZM186
6-0 szew jedwabny	Fine Science Tools	18020-60
27 i frac12; igła pomiarowa	BD Biosciences	305109
6-0 szew prolenowy	Mckesson	3286
Instytucjonalny zakład			dla zwierząt z buprenorfiną