Programowana stymulacja elektryczna u myszy

Podsumowanie

Programowa stymulacja elektryczna umożliwia określenie właściwości przewodzenia w sercu oraz indukcję i terminację arytmii serca przy użyciu różnych protokołów stymulacji. Przy użyciu cewnika przezżylnego można uzyskać zapisy elektrogramów wewnątrzsercowych u myszy po zastosowaniu protokołów programowej stymulacji elektrycznej w celu zidentyfikowania podłoży arytmogennych.

Streszczenie

Myszy modyfikowane genetycznie stały się preferowanym modelem zwierzęcym do badania mechanizmów molekularnych leżących u podłoża zaburzeń przewodzenia, arytmii przedsionkowych i komorowych oraz nagłego zgonu sercowego.¹Badania nad stymulacją wewnątrzsercową u myszy można przeprowadzić przy użyciu cewnika ośmiobiegunowego o rozmiarze 1,1F, wprowadzonego do żyły szyjnej i przesuniętego do prawego przedsionka oraz komory. W niniejszym materiale przedstawiamy etapy przeprowadzania programowej stymulacji elektrycznej u myszy. Powierzchniowe EKG oraz wewnątrzsercowe elektrogramy są rejestrowane jednocześnie w przedsionkach, w węźle przedsionkowo-komorowym oraz w mięśniu komór, podczas gdy stymulacja wewnątrzsercowa przedsionka jest wykonywana za pomocą zewnętrznego stymulatora. W ten sposób programowa stymulacja elektryczna u myszy stwarza unikalne możliwości badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zaburzeń przewodzenia i arytmii serca.

Protokół

Część 1. Przygotowanie chirurgiczne

1. W przypadku przeprowadzania eksperymentów z programowaną stymulacją elektryczną jako operacji przeżyciowych u myszy, niezbędne będą warunki sterylne. Jednak najczęstszym rodzajem eksperymentów są procedury terminalne, w których wystarczające jest zastosowanie standardowych technik chirurgicznych w warunkach czystych.
2. Mysz jest znieczulana przy użyciu 2% izofluranu w przepływie 0,5 L/min 100% O₂.
3. Do ogolenia futra od linii szyi do poziomu środka klatki piersiowej używa się trymera do włosów.
4. Znieczuloną mysz umieszcza się w pozycji na plecach, a kończyny przytwierdza taśmą do elektrod EKG wbudowanych w płytę grzewczą (Indus Instruments, Houston, TX). Obszar operacyjny dezynfekuje się 10% jodopowidonem. Zalecany system obejmuje sondę temperatury odbytniczej podłączoną do mata grzewczego sterowanego przez system termoanalizatora, tak aby temperatura ciała była utrzymywana na poziomie 37,0 °C ± 1,0 °C.

Część 2. Kanulacja i wprowadzenie cewnika EP do prawego przedsionka i komory

1. Po potwierdzeniu za pomocą ucisku palca u stopy, że mysz jest w pełni zanurzona w narkozie, wykonuje się nacięcie o długości 1/2 cala na prawo od linii środkowej, z końcem ogonowym na poziomie obojczyka.
2. Tkankę podskórną, gruczoły ślinowe i tkankę limfatyczną rozdziela się za pomocą tępej dyssekcji, aby uwidocznić prawą żyłę szyjną.
3. Proksymalny koniec żyły zostaje podwiązany szwem 6-0. Delikatne pociąganie za ten szew pozwoli utrzymać żyłę szyjną wewnętrzną w linii prostej podczas wprowadzania cewnika. Kolejny szew umieszcza się pod żyłą na dystalnym końcu uwidocznionego segmentu. Sznur ten zostanie zawiązany wokół cewnika po jego optymalnym umieszczeniu w sercu, aby zapewnić hemostazę i utrzymać cewnik w pożądanej pozycji (Rysunek 1).
4. Uruchamia się komputerowy system akwizycji danych w celu jednoczesnej rejestracji powierzchniowego EKG oraz 4 odprowadzeń elektrogramów wewnątrzsercowych (np. oprogramowanie akwizycyjne IOX-2, Emka Technologies, VA, USA). Do rejestracji elektrogramów wewnątrzsercowych elektrody na cewniku zostają podłączone do zewnętrznego stymulatora w trybie „rejestracji” (np. model STG3008, MultiChannel Systems, Reutlingen, Niemcy).
5. Za pomocą mikronożyczek wykonuje się niewielkie nacięcie wzdłuż żyły, a następnie cewnik ośmiobiegunowy 1.1F (EPR-800, Millar Instruments, Houston, TX) wprowadza się przez żyłę do prawego przedsionka. Delikatne pociąganie za szew proksymalny pomoże utrzymać żyłę szyjną wewnętrzną w linii prostej i ułatwi przejście cewnika do prawego przedsionka i komory. Prawidłowe położenie cewnika weryfikuje się poprzez wizualizację przebiegów 4 elektrogramów wewnątrzsercowych odpowiednio na poziomie szczytu prawej komory, podstawy prawej komory, węzła przedsionkowo-komorowego oraz prawego przedsionka (Rysunek 2).
6. Następnie zawiązuje się szew dystalny, aby zabezpieczyć położenie cewnika i zapobiec ewentualnemu krwawieniu.

Część 3. Programowana stymulacja elektryczna

1. W przypadku selektywnej stymulacji przedsionków para elektrod umieszczona w przedsionku zostaje przełączona z trybu „rejestracji” na tryb „stymulacji”, podczas gdy pozostałe pary elektrod pozostają w trybie „rejestracji”.
2. Aby określić, czy mysz wykazuje zwiększoną podatność na arytmie przedsionkowe, wykonuje się programowaną stymulację elektryczną prawego przedsionka. Najpierw wyznacza się próg stymulacji przedsionków poprzez aplikację impulsów prądowych o czasie trwania 2 ms (co najmniej 50) przy różnych podstawowych długościach cyklu (BCL), aby sprawdzić spójność przejęcia bodźca. BCL pierwszej serii impulsów jest nieco krótsze od wewnątrzpochodnego BCL i jest zmniejszane o 10 ms (na przykład: 100 ms, 90 ms, 80 ms i 70 ms). Typowa amplituda prądu wymagana do przejęcia bodźca wynosi 100-200 μA.
3. Czas regeneracji węzła zatokowego (SNRT) pomiaru się po zastosowaniu 15-sekundowej serii stymulacji przedsionków przy BCL wynoszącym 100 ms. SNRT definiuje się jako odstęp między ostatnim bodźcem w serii stymulacji a początkiem pierwszego spontanicznego skurczu zatokowego.
4. Efektywny okres refrakcji przedsionków (AERP) wyznacza się poprzez aplikację serii stymulacji przedsionków przy stałych BCL (tj. 100 ms) z dołączonym krótszym przedwczesnym bodźcem S2. Odstęp S1-S2 jest stopniowo redukowany o 2 ms w każdej serii stymulacji, od 70 ms do 20 ms. AERP definiuje się jako najdłuższy odstęp sprzężenia S1-S2 dla przedsionków, przy którym bodziec S2 nie wywołał rozprzestrzenionego skurczu (S1 to impuls z regularnej serii, a S2 to bodziec przedwczesny). Między poszczególnymi protokołami stymulacji stosowano okres regeneracji trwający co najmniej 30 sekund.
5. Efektywny okres refrakcji węzła przedsionkowo-komorowego (AVNERP) wyznacza się poprzez aplikację serii stymulacji przedsionków przy BCL wynoszącym 100 ms z dołączonym przedwczesnym bodźcem S2. Odstęp S1-S2 jest stopniowo redukowany o 2 ms w każdej serii stymulacji, od 70 ms do 20 ms. AVNERP definiuje się jako najdłuższy odstęp sprzężenia S1-S2, przy którym przedwczesna stymulacja przedsionka wywołuje potencjał Hisa, ale nie wywołuje zespołu QRS. Między poszczególnymi protokołami stymulacji stosowano okres regeneracji trwający co najmniej 30 sekund.
6. Indukowalność arytmii przedsionkowych, w tym migotania przedsionków (AF), można badać przy użyciu protokołu stymulacji seryjnej (burst pacing) opisanego przez Verheule et al.² Stosuje się serię 2-sekundowych serii impulsów (bursts), aby określić indukowalność arytmii przedsionkowych. Pierwsza 2-sekundowa seria ma długość cyklu (CL) 40 ms, a każda kolejna 2-sekundowa seria ma CL krótsze o 2 ms od poprzedniej, aż do końcowego CL wynoszącego 20 ms. W przypadku braku podłoża arytmogennego serce natychmiast powróci do rytmu zatokowego po zakończeniu protokołu stymulacji. W przypadku trzepotania przedsionków na elektrogramie przedsionkowym pojawi się regularny wzorzec szybkich załamków A, podczas gdy częstotliwość odpowiedzi komorowej jest zazwyczaj wolniejsza, co widoczne jest na elektrogramie komorowym. W przypadku migotania przedsionków w EKG powierzchniowym wystąpią nieregularne odstępy RR przy braku załamków P. Dodatkowo elektrogram przedsionkowy wykaże szybkie i nieregularne załamki A, natomiast elektrogram komorowy wykaże nieregularne i wolniejsze załamki komorowe (Rysunek 3). Protokoły indukcji arytmii wykonuje się zazwyczaj w trzech powtórzeniach, a arytmię uznaje się za obecną, jeśli można ją wywołać w co najmniej 2 z 3 prób.^3,4.

Część 4. Usunięcie cewnika

1. Po zakończeniu wszystkich protokołów stymulacji przerywa się akwizycję danych. Szew na dystalnym końcu cewnika jest delikatnie przecinany, aby uwolnić cewnik.
2. W przypadku terminalnych badań EP węzeł jest delikatnie luzowany, aby uwolnić cewnik.
3. Po zakończeniu badania mysz zostanie humanitarnie uśpiona w znieczuleniu izofluranem poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.

Reprezentatywne wyniki

Powierzchniowe EKG oraz wewnątrzsercowe elektrogramy są rejestrowane symultanicznie przez cały czas trwania badania elektrofizjologicznego in vivo i są szczegółowo analizowane po zakończeniu wszystkich protokołów. Bazowe parametry elektrofizjologiczne obejmują odstęp PR, odstęp PQ, czas trwania zespołu QRS, odstępy QT oraz morfologię zespołu QRS. Parametry te można zmierzyć ręcznie lub automatycznie przy użyciu oprogramowania do akwizycji danych IOX-2 lub ECG-AUTO (Emka Technologies, VA, USA).

SNRT, AERP oraz AVNERP dostarczają odpowiednio informacji na temat funkcji „rozrusznika” węzła zatokowego, a także właściwości przewodzenia w przedsionkach i w węźle AV. Przykłady epizodów migotania przedsionków wywołanych stymulacją znajdują się w pracy Chelu et al.⁴

Rysunek 1. Ilustracja cewnikowania wewnątrzsercowego w badaniach elektrofizjologicznych u myszy. A. Prawą żyłę wewnętrzną szyjną izoluje się i kaniuluje. Dystalny koniec żyły podwiązuje się po uzyskaniu prawidłowego położenia cewnika. BMyszy ustawia się w pozycji grzbietowej do wykonania tej procedury. C. Schemat przedstawiający wewnątrzsercowe rozmieszczenie elektrod cewnika. Pary elektrod są rozmieszczone odpowiednio na poziomie wierzchołka prawej komory, podstawy prawej komory, węzła przedsionkowo-komorowego oraz prawego przedsionka. DZbliżenie na cewnik octapolarny 1.1F. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Mathura i wsp.za zgodą Circ Arrhythmia Electrophysiol ⁵.

Rycina 2. Reprezentatywne zapisy powierzchniowego EKG i elektrogramów wewnątrzsercowych u myszy. (A) Powierzchniowe EKG w konfiguracji odprowadzenia II wykazujące regularny rytm zatokowy z częstotliwością 540 uderzeń na minutę. (B-E) Bipolarne zapisy elektrogramów wewnątrzsercowych odpowiednio na poziomie prawego przedsionka (B), węzła przedsionkowo-komorowego (C), podstawy prawej komory (D) oraz koniuszka prawej komory (E). Należy zauważyć, że fala A w elektrogramie wewnątrzsercowym na panelu B odpowiada fali P w powierzchniowym EKG. Fala V w elektrogramie komorowym odpowiada zespołowi QRS w powierzchniowym EKG.

Rycina 3. Reprezentatywne EKG powierzchniowe i elektrogramy wewnątrzsercowe u myszy, u której rozwinął się migotanie przedsionków po seryjnej stymulacji przedsionków.

Dyskusja

Podczas cewnikowania serca obfite krwawienie może doprowadzić do zwiększenia częstotliwości akcji serca w wyniku hipowolemii. W takim przypadku podanie doprzewnowolne sterylnej soli fizjologicznej (0,3 1,0 mL) może znormalizować ciśnienie napełniania i zmniejszyć stres hemodynamiczny u myszy.

Ekspozycja na izofluran trwająca dłużej niż 2 godziny lub zastosowanie wyższych stężeń izofluranu (>2 %) może doprowadzić do upośledzenia funkcji serca i układu oddechowego u myszy. Dlatego zaleca się...