Synteza i kalibracja fosforescencyjnych nanosond do obrazowania tlenu w układach biologicznych

Podsumowanie

Przedstawiamy zasady pomiarów poziomu tlenu metodą wygaszania fosforescencji oraz omawiamy konstrukcję dendrytycznych nanoczujników opartych na porfirynach do obrazowania tlenu w systemach biologicznych.

Streszczenie

Pomiar tlenu metodą wygaszania fosforescencji [1, 2] składa się z następujących etapów: 1) wprowadzenie sondy do badanego medium (np. krwi lub płynu śródmiąższowego); 2) oświetlenie obiektu światłem o odpowiedniej długości fali w celu wzbudzenia sondy do stanu tripletowego; 3) zbieranie emitowanej fosforescencji i analiza jej przebiegu czasowego w celu wyznaczenia czasu życia fosforescencji, który jest następnie przeliczany na stężenie tlenu (lub ciśnienie parcjalne, pO₂). Sonda nie może wchodzić w interakcje z środowiskiem biologicznym, a w niektórych przypadkach powinna zostać 4) usunięta z medium po zakończeniu pomiaru. Każdy z tych etapów nakłada określone wymagania na projekt molekularny sond fosforescencyjnych, które stanowią jedyny inwazyjny element protokołu pomiarowego. W niniejszym opracowaniu przeglądamy projekt dendrytycznych nanofosforowych sensorów do pomiarów tlenu w systemach biologicznych. Sondy składają się z dendrymerów poliaryloglicyny (AG) opartych na porfirynach Pt lub Pd, zmodyfikowanych na obwodzie resztami glikolu polietylenowego (PEG). W celu efektywnego wzbudzenia dwufotonowego, końce dendrymerów mogą być zmodyfikowane chromoforami antenowymi do wzbudzenia dwufotonowego, które przechwytują energię wzbudzenia i przekazują ją do tripletowych rdzeni sond za pomocą wewnątrzmolekularnego FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Opisujemy kluczowe właściwości fotofizyczne sond oraz przedstawiamy szczegółowe protokoły kalibracji.

Protokół

1. Ogólny opis protokołu pomiaru tlenu

(Ta sekcja nie zawiera żadnych działań, ale jest kluczowa dla zrozumienia reszty pracy. Można ją sfilmować na przykład jako sekwencję kilku slajdów programu PowerPoint z towarzyszącym komentarzem głosowym.)

1.1) Sondę wprowadza się do badanego środowiska, na przykład wstrzykując ją do krwi lub płynu śródmiąższowego zwierzęcia.

1.2) Obiekt (powierzchnię tkanki) oświetla się światłem o odpowiedniej długości fali, aby doprowadzić sondę do wzbudzonego stanu tripletowego. Typowo wzbudzenie następuje poprzez mechanizm jednofotonowy. Jednak w przypadku specjalnych sond z wzmocnionym pobudzeniem dwufotonowym, wzbudzenie można przeprowadzić poprzez mechanizm dwufotonowy, który umożliwia stosowanie sond w aplikacjach mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Wzbudzenie jednofotonowe zazwyczaj zapewnia niższą rozdzielczość przestrzenną, lecz wymaga prostszej aparatury i może być wykorzystywane w pomiarach jednopunktowych z użyciem światłowodowych fosforometrów opartych na diodach LED.

1.3) Fosforescencja emitowana przez sondę pochodzi z długożyjącego stanu tripletowego. Cząsteczka sondy musi być specjalnie zaprojektowana tak, aby zapewniać wysoką wydajność kwantową stanu tripletowego i emitować fosforescencję zamiast fluorescencji. W stanie tripletowym sonda może ulegać zderzeniom z cząsteczkami tlenu, które mogą dezaktywować stan tripletowy – proces ten nazywa się „gaszeniem”. Wobec braku tlenu czas życia stanu tripletowego, a co za tym idzie, czas zaniku fosforescencji wynosi τ₀. W obecności tlenu czas życia fosforescencji (τ) ulega skróceniu w wyniku gaszenia. Istnieje bezpośrednia zależność między czasem życia stanu tripletowego a ilością tlenu w środowisku. Jest to znana zależność Sterna-Volmera, która wiąże czas życia (τ) fosforescencji z stężeniem tlenu [O₂] (lub ciśnieniem parcjalnym tlenu pO₂):

W systemach biologicznych tlen jest zdecydowanie najskuteczniejszym wygaszaczem fosforescencji, co sprawia, że metoda wygaszania fosforescencji jest bardzo selektywna w odniesieniu do tlenu.

1.4) W celu pomiaru czasu życia t, emitowane fotony fosforyzacji są grupowane w przedziałach czasowych. Na przykład, po impulsie wzbudzenia, w pierwszych 15 mikrosekundach może zostać zebranych 200 fotonów, w kolejnych 15 mikrosekundach 150 fotonów i tak dalej, aż do momentu, gdy fotony przestaną być rejestrowane. Liczba fotonów w przedziałach naniesiona na oś czasu obrazuje zanik fosforyzacji, którego analiza pozwala wyznaczyć czas życia τ. W obrazowaniu procedura ta jest stosowana dla każdego piksela obrazu, co pozwala na stworzenie map czasu życia fosforyzacji. Pomiary czasu życia są niewrażliwe na niejednorodność rozkładu sondy w obiekcie, co jest zjawiskiem powszechnym w próbkach biologicznych. W związku z tym, czasy życia informują wyłącznie o zawartości tlenu. Czasy życia τ są przeliczane na stężenia tlenu z wykorzystaniem równania Sterna-Volmera.

2. Konstrukcja sond fosforescencyjnych

Sondy fosforescencyjne do pomiarów tlenu w układach biologicznych składają się z chromoforów fosforescencyjnych (rdzeni), zamkniętych w klatkach zbudowanych z dendrymerów – wysoce regularnych polimerów hiperrozgałęzionych [3]. Dendrymerzy chronią rdzenie przed oddziaływaniami z otoczeniem i kontrolują szybkość dyfuzji tlenu do rdzeni, co umożliwia optymalizację czułości i zakresu dynamicznego sond (stała k_q w równaniu Sterna-Volmera). Końce dendrymerów są zmodyfikowane chemicznie obojętnymi, hydrofilowymi grupami glikolu polietylenowego (PEG), co sprawia, że sondy są bardzo dobrze rozpuszczalne w wodzie i zapobiega ich oddziaływaniom z biologicznymi makrocząsteczkami.

Rdzenie fosforyzujące sond stanowią kompleksy Pt lub Pd porfiryn oraz porfiryn z rozszerzonym układem π. Porfiryny z rozszerzonym układem π to porfiryny, w których pierścienie pirolu są skondensowane z zewnętrznymi fragmentami aromatycznymi. Rozszerzenie układu π umożliwia dostrojenie właściwości spektroskopowych sond tak, aby spełniały one wymagania konkretnej aplikacji obrazowania (np. mikroskopii w porównaniu z tomografią). Jako przykład opisujemy syntezę Pd-tetaaryltetrabenzoporfiryn (PdAr₄TBP) [4]. PdAr₄TBP charakteryzują się silnymi pasmami absorpcji w dalekiej czerwieni widma oraz intensywną fosforyzacją, co czyni je odpowiednimi do biologicznych pomiarów tlenu.

Synteza PdAr₄TBP składa się z następujących etapów:

2.1) Przygotowanie tetraaryltetracykloheksenoporfiryn (Ar4TCHP) poprzez kondensację Lindsey [5] tetrahydroizoindolu z podstawionymi benzaldehydami. Do 0,01 M roztworu tetrahydroizoindolu (1 eq) w CH₂CL₂ dodano w atmosferze argonu aldehyd aromatyczny (1 eq). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 10 min w ciemności w temp. pokojowej. Dodano BF₃xEt₂O (0,2 eq), a mieszaninę reakcyjną mieszano w temp. pokojowej przez kolejne 2 h. Dodano DDQ (1 eq), a mieszaninę pozostawiono na noc w warunkach ciągłego mieszania. Roztwór przemyto 10% wodnym roztworem Na₂SO₃, 10% wodnym roztworem Na₂CO₃, 5% wodnym roztworem HCl, a na koniec solanką. Fazę organiczną osuszono nad Na₂SO₄, a następnie zagęszczono w próżni. Pozostałość przekrystalizowano z mieszaniny CH₂Cl₂ i eteru tert-butylu, otrzymując Ar₄TCHP w postaci zielonego proszku. Wydajność wynosi około 50%.

2.2) Wprowadzenie Pd w celu otrzymania PdAr₄TCHP. Porfiryny w postaci wolnej zasady (1 eq) poddano działaniu PdCl₂ lub Pd(OAc)₂ (1,2 eq) w cofającym się CH₃CN w obecności nadmiaru Et₃N (20 eq). Konwersję monitorowano za pomocą spektroskopii UV-vis (rozpuszczalnik CH₂Cl₂-AcOH) i uznano za zakończoną po zaniku pasma Soreta przy 468-472 nm. Mieszaninie pozwolono ostygnąć, rozcieńczono ją CH₂Cl₂ i przefiltrowano przez cienką warstwę Celite w celu usunięcia Pd(0). Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość oczyszczono chromatograficznie na kolumnie z żelem krzemionkowym, używając CH₂Cl₂ jako rozpuszczalnika. Zebrano ciemnoczerwoną frakcję, a rozpuszczalnik odparowano, otrzymując docelowe PdAr₄TCHPs w wydajności niemal ilościowej.

2.3) Związki PdAr₄TBP otrzymano poprzez utlenianie PdAr₄TCHP dwukrotnym nadmiarem DDQ (16 eq) w THF w temperaturze wrzenia. Podczas ogrzewania w zwrocie barwa zmieniła się z ciemnoczerwonej na ciemnozieloną. Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość rozcieńczono CH₂Cl₂ i przemyto 10% aq Na₂SO₃, wodą oraz solanką. Fazę organiczną osuszono nad Na₂SO₄ i zagęszczono w próżni. Pozostałość oczyszczono chromatograficznie na żelu krzemionkowym (eluent CH₂Cl₂). Zebrano pierwszą ciemnozieloną frakcję i zagęszczono ją w próżni, otrzymując 85-90% PdAr4TBP w postaci niebiesko-zielonego proszku.

2.4) Obwodowe grupy estrowe Pd tetrakis-(3,5-dibutoksykarbonylofenyl)-tetrabenzoporfiryny (PdAr4TBP) poddano hydrolizie przy użyciu 10-krotnego nadmiaru KOH w 1% (v/v) roztworze woda/THF w rt. Rozpuszczalnik oddzielono od osadu powstałych soli potasu pochodnych kwasów karboksylowych PdAr4TBP. Substancje stałe rozpuszczono w wodzie, mieszano przez kolejne 2 h, a następnie zakwaszono stężonym HCl do pH~4-5. Otrzymany osad wyizolowano poprzez wirowanie, przemyto wodą i wysuszono w próżni.

Ochrona dendronów. Każda pojedyncza gałąź dendrymeru nazywana jest dendronem. Dendrony ochronne są budowane z bloków budulcowych arylo-glicyny (AG). Dendrony AG można łatwo syntetyzować z niedrogich materiałów wyjściowych i izolować z wysoką czystością i wydajnością metodami bez użycia chromatografii. Synteza dendronu AG drugiej generacji (G2) składa się z następujących etapów:

2.4) Synteza bloków budulcowych, Boc-chronionego 3,5-dikarboksyfenyloglicynamidu oraz 3,5-dibutoksykarbonylofenyloglicynamidu, z zastosowaniem metody haloacylidenków Fischera.

2.5) Sprzęganie bloków budulcowych przy użyciu chemii sprzęgania peptydowego CDMT/NMM.

2.6) Deprotekcja ogniskowej grupy aminowej poprzez mieszanie roztworu dendronu G2 w TFA przez 2 h w temperaturze pokojowej.

2.7) W celu syntezy dendronów wyższych generacji powtarza się etapy sprzęgania i deprotekcji.

Montaż dendrymeru osiąga się poprzez sprzęganie odchronionych dendronów z PdAr4TBP (lub inną porfiryną) z wykorzystaniem chemii sprzęgania HBTU/DIPEA.

2.8) W pierwszej kolejności z dendronu usuwa się grupy ochronne Boc. Na przykład, dendron G3 chroniony grupami Boc (0,58 g) rozpuszczono w TFA (15 ml), a mieszaninę pozostawiono do reakcji w temperaturze pokojowej przez 2 h. Kwas usunięto za pomocą odparowania rotacyjnego, otrzymując dendron w postaci soli TFA. Pozostałość rozpuszczono w suchym NMP (10 ml) i dodano kilka kropli DIPEA, aby zneutralizować śladowe ilości TFA.

2.9) Przed rozpoczęciem reakcji sprzęgania kluczowe jest całkowite rozpuszczenie porfiryny. Na przykład Pt tetrakarboksyfenylporfirynę (0.061 g) rozpuszczono w suchym NMP (65 ml), podgrzewając w temperaturze 140°C przez 10 min w strumieniu azotu.

2.10) Roztwór schłodzono do temperatury pokojowej, dodano HBTU (0,211 g), a mieszaninę mieszano przez 5 min.

2.11) Do mieszaniny w jednej porcji dodano DIPEA (0,35 ml), a następnie niezwłocznie dodano roztwór soli TFA dendronu w NMP (patrz 2.8) i pozostawiono mieszaninę do mieszania przez noc.

2.12) Mieszaninę wlano do 3% roztworu wodnego NaCl (350 ml), a powstały osad zebrano poprzez wirowanie i przemyto wodą, MeOH oraz Et₂O poprzez wielokrotne zawieszenie i wirowanie, aby otrzymać docelowy porfirynowy dendrymer.

2.13) Aby zhydrolizować peryferyjne grupy estrowe, dendrymer poddano najpierw działaniu NMe₄OH (~ 5 mM) w DMSO/MeOH przez okres od 20 do 60 min, a następnie całkowicie usunięto rozpuszczalnik. Procedura ta pozwoliła na otrzymanie dendrymerów z wystarczającą liczbą grup karboksylowych, aby zapewnić rozpuszczalność w wodzie. W celu zakończenia hydrolizy dendrymer poddano działaniu 0,1N wodnego roztworu NaOH (przez noc). W rezultacie udało się wyizolować czyste kwasy karboksylowe porfiryna-dendrymer z wydajnością 80-95%.

Modyfikacja peryferii dendrymeru. Na tym etapie, zaczynając od tego samego porfiryna-dendrymeru, można zsyntetyzować sondy jedno- lub dwufotonowe. W pierwszym przypadku wszystkie peryferyjne grupy karboksylowe są modyfikowane jednostkami PEG – jest to metodologia znana jako PEGylacja. W drugim przypadku kilka grup karboksylowych jest najpierw sprzęganych z dwufotonowymi chromoforami antenowymi (kumaryna-343) zmodyfikowanymi łącznikami z etylenodiaminy (EDA), a następnie przeprowadza się PEGylację pozostałych grup karboksylowych [6]. Dendrymeru poddano PEGylacji przy użyciu monometoksyoligoetylenoglikolaminy (m-PEG-NH₂, średnia MW 1000), wykorzystując chemię sprzęgania HBTU/DIPEA.

2.14) Do roztworu dendronu w NMP (lub DMF) (1-10 mM) dodano 1,25-krotny nadmiar HBTU, a mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 min. Następnie dodano 6,25-krotny nadmiar DIPEA, a bezpośrednio po nim 1,25-krotny nadmiar m-PEG-NH2. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 dni w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny reakcyjnej dodano eter dietylowy, powstały osad oddzielono poprzez wirowanie, a następnie ponownie wytrącono z THF poprzez dodanie eteru dietylowego.

2.15) Ostateczne oczyszczanie przeprowadzono za pomocą chromatografii wykluczania wielkości poprzez zebranie pierwszej fazy czołowej. PEGylowaną porfirynę-dendrymer rozpuszczono w niewielkiej ilości THF (~15 ml) i naniesiono na górę kolumny chromatograficznej wypełnionej fazą SEC z polistyrenu (Biorad, Biobeads S-X1). Kolumnę eluoowano czystym THF, a następnie zebrano ciemnobarwny prążek przemieszczający się z czołem.

2.16) THF usunięto za pomocą ewaporatora rotacyjnego, a pozostały materiał wysuszono w próżni.

3. Charakterystyka sondy

Charakterystyka fotofizyczna obejmuje pomiary widm absorpcji i emisji sondy, czasów życia fosforescencji τ₀ oraz stałych wygaszania tlenowego Sterna-Volmera k_q w warunkach fizjologicznych.

3.1) Widma absorpcji i emisji uzyskuje się w warunkach otoczenia przy użyciu standardowej aparatury (spektrofotometru i fluorometru stacjonarnego). Stosuje się roztwory sondy o stężeniu ~1 μM.

3.2) Następnie sporządza się wykres kalibracyjny Sterna-Volmera. Jest to najważniejszy pomiar, ponieważ pozwala on powiązać czas życia sondy z stężeniem tlenu.

3.3) Roztwór sondy w buforze PBS (pH 7.2) umieszcza się w specjalnej kuwecie cylindrycznej, która jest ustawiona wewnątrz komory z kontrolą temperatury, znajdującej się w nieprzepuszczalnej dla światła klatce z portami dla światłowodów wzbudzenia i emisji. Światłowody są doprowadzane w bezpośredni kontakt z kuwetą wewnątrz komory w geometrii kąta prostego.

3.4) Kuwetę zamyka korek, w którym umieszczona jest wysokoczuła elektroda tlenowa typu Clarka (elektroda tlenowa CK). Korek zawiera również dwa porty igłowe dla dopływu i odpływu argonu. Elektrodę zanurza się w roztworze, natomiast igły służą jedynie do zapewnienia przepływu gazu nad powierzchnią roztworu. Początkowo argon nie jest podłączony do wlotu.

3.5) Temperaturę ustawia się na pożądaną wartość (zazwyczaj 36-37°C), a roztwór pozostawia się pod ciągłym mieszaniem w celu wyrównania temperatury.

3.6) Włókno wzbudzenia jest podłączone do portu wzbudzenia cyfrowego fosforometru sterowanego przez komputer PC. Źródłem światła w fosforometrze jest wysokiej mocy dioda LED, której wyjście jest sterowane przez płytkę D/A o częstotliwości 333 kHz. Włókno emisji jest podłączone do innego portu optycznego fosforometru, który jest sprzężony z wysoce czułą na podczerwień fotodiodą lawinową (APD). Sygnał wyjściowy diody jest wzmacniany i wprowadzany do kanału A/D tej samej płyty sterującej, co umożliwia synchronizację między kanałami wzbudzenia i emisji.

3.7) Oprogramowanie sterujące umożliwia generowanie impulsów wzbudzenia o dowolnej pożądanej długości (np. 5 lub 10 ms), po których następuje pomiar zaniku fosforescencji w dowolnie wybranym przedziale czasu (zazwyczaj 2-3 ms). Czas wymagany do pojedynczego pomiaru czasu życia wynosi zazwyczaj 0,5-1 s, jednak pomiary mogą być wykonywane z częstotliwością do 10-20 na sekundę.

3.8) Sygnał z elektrody tlenowej jest wzmacniany i kierowany do drugiej płyty A/D w tym samym komputerze PC. Jest to płyta niskiej częstotliwości (maks. 1 kHz), która służy do rejestrowania prądu elektrody w wybranych odstępach czasu. Program do rejestracji danych z elektrody działa równolegle z oprogramowaniem fosforometru.

3.9) Po wyrównaniu temperatury roztworu, programy fosforometru i elektrody są inicjowane jednocześnie w celu wykonywania pomiarów co 10 s. Wyniki są rejestrowane synchronicznie w dwóch oddzielnych plikach. Następnie argon zostaje podłączony do wlotu w korku kuwety.

3.10) Gdy argon przepływa nad powierzchnią mieszanego roztworu, stopniowo zastępuje on tlen. Skutkuje to spadkiem prądu elektrody i wydłużeniem czasu życia fosforyzacji, który jest pomiarowy za pomocą fosforometru. Zazwyczaj tlen zostaje całkowicie usunięty z roztworu po około 2 h, podczas których dane są w pełni automatycznie rejestrowane w plikach.

3.11) Po zakończeniu serii miareczkowania dane z elektrody oraz czasy życia fosforescencji są importowane do standardowego programu analitycznego (np. Microcal Origin). Prąd elektrody zależy liniowo od stężenia tlenu, a w przypadku użytej elektrody wynosi on praktycznie zero przy zerowej zawartości tlenu. Przy ciśnieniu atmosferycznym pO₂ jest znane (około 150 mm Hg). Zatem dane z elektrody mogą zostać bezpośrednio przeliczone na skalę tlenową, co pozwala na sporządzenie wykresu odwrotności czasu życia fosforescencji w funkcji pO₂. Wykres ten jest dopasowywany do linii prostej metodą najmniejszych kwadratów, aby wyznaczyć stałą wygaszania tlenowego kq jako nachylenie tej prostej. Czas życia fosforescencji t0 uzyskuje się albo z tego samego dopasowania (jako odwrotność punktu przecięcia z osią rzędnych), albo bezpośrednio z pomiaru przy zerowej zawartości tlenu.

3.12) W razie potrzeby miareczkowanie powtarza się, używając roztworu sondy w obecności albuminy – białka występującego w osoczu krwi w wysokich stężeniach – w celu odwzorowania warunków panujących w rzeczywistym układzie eksperymentalnym (krew zwierzęcia in vivo). Uzyskane wykresy Sterna-Volmera powinny być identyczne, jeśli dendrymer dobrze chroni sondę, a grupy PEG izolują sondę od kontaktu z albuminą. W przeciwnym razie sonda i białka we krwi będą oddziaływać ze sobą, co doprowadzi do zmiany wykresu Sterna-Volmera, powodując niejednoznaczność w pomiarach tlenu.

W ten sposób uzyskane stałe kalibracyjne są wykorzystywane w eksperymentach obrazowania, w których stężenia tlenu są a priori nieznane.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
N-metylopirolidnon			NMP
kwas trifluorooctowy			TFA
diizopropyloetyloamina			DIPEA
heksafluorofosforan 2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylouroniu			HBTU
dimetylosulfotlenek			DMSO
CDMT=1-chloro-3,5-dimetoksytriazyna			CDMT
NMM=N-metylomorfolina			NMM