Ambulatoryjne zapisy EKG u myszy

Podsumowanie

Telemetry EKG stała się niezbędnym narzędziem w ocenie modeli zwierzęcych pod kątem arytmii serca i nagłej śmierci sercowej. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcję krok po kroku dotyczącą rejestracji telemetrycznego EKG w celu długoterminowego ambulatoryjnego monitorowania EKG u myszy.

Streszczenie

Telemetryjne rejestrowanie EKG u myszy jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw arytmii, zaburzeń przewodzenia oraz nagłego zgonu sercowego. Choć powierzchniowe EKG jest wykorzystywane do krótkotrwałych pomiarów odstępów w zapisie fali, nie jest ono praktyczne w przypadku długoterminowych badań zmienności rytmu serca lub rejestracji rzadkich epizodów arytmii. Implantowalne telemetry EKG oferują zalety w postaci prostej implantacji chirurgicznej, długoterminowej rejestracji elektrogramów u myszy w warunkach wolnego poruszania się oraz skalowalności poprzez jednoczesny zapis z wielu zwierząt. W niniejszej pracy przedstawiamy instrukcję krok po kroku dotyczącą implantacji telemetrów do rejestracji EKG u myszy w warunkach wolnego poruszania się. Ścisłe przestrzeganie technik aseptyki jest wymagane dla uzyskania korzystnych wyników przeżywalności, umożliwiając implantację i rejestrację danych od kilku tygodni do kilku miesięcy. Tym samym implantowalna telemetria EKG stanowi cenne narzędzie do wykrywania krytycznych informacji na temat elektrofizjologii serca w ambulatoryjnych modelach zwierzęcych, takich jak mysz.

Protokół

1. Przygotowanie telemetru do implantacji chirurgicznej

1. Przed wprowadzeniem telemetru EKG do organizmu myszy należy upewnić się, że urządzenie jest sterylne i sprawne. Nowe urządzenia telemetryczne są zazwyczaj dostarczane przez producenta w stanie sterylnym. Telemetry EKG można ponownie wykorzystać, pod warunkiem, że urządzenie zostanie oczyszczone w 1% roztworze Tergazyme przez co najmniej 4 godziny. Po czyszczeniu w Tergazyme telemetr można przepłukać sterylną wodą. Dodatkowo należy zastosować środek dezynfekcyjny Wavicide-01 przez całą noc, aby wysterylizować telemetr EKG. Należy pamiętać o spłukaniu środka dezynfekcyjnego sterylną wodą na 48 godzin przed implantacją u myszy. Przechowywać w sterylnym pojemniku.
2. Należy sprawdzić integralność przewodów telemetru, zarówno w odniesieniu do drutów przewodzących, jak i osłonki izolacyjnej. Nadajnik telemetryczny włącza się, przesuwając magnes w odległości do 5 cm od telemetru; sygnał należy przetestować za pomocą radia AM na częstotliwości 530. Sygnał powinien być silny i wyraźny, a jego intensywność i wysokość powinny zmieniać się podczas manipulacji przewodami. Należy zapisać numer modelu, numer seryjny telemetru oraz wartość kalibracji EKG. Producenci często zalecają, aby telemetr był włączony przez 24 godziny przed implantacją; szczegóły znajdują się w instrukcji obsługi konkretnego modelu urządzenia. W niniejszym przykładzie do implantacji wykorzystany zostanie telemetr firmy Data Sciences International (DSI).
3. Przygotowanie przewodów telemetru polega na przycięciu przewodu ujemnego (białego) do długości około 3,5 cm oraz przewodu dodatniego (czerwonego) do 2,5 cm. Są to optymalne długości dla implantacji przewodu ujemnego w prawej części klatki piersiowej oraz przewodu dodatniego w lewej części brzucha (patrz ryc. 2). Następnie należy usunąć osłonkę izolacyjną, aby odsłonić 7 mm drutu. Końcówkę metalowego przewodu należy pokryć sterylnym superklejem, np. Vet-Bond, a następnie przymocować nakładki do metalowych końcówek. Zapobiegnie to erozji skóry spowodowanej obecnością przewodów. W celu elektrycznego wykrywania naturalnego rytmu serca odsłonięty powinien pozostać odcinek metalowego drutu o długości około 2-3 mm.

2. Chirurgiczne wszczepienie telemetru

1. W celu zastosowania techniki sterylnej w chirurgii myszy będą potrzebne sterylne rękawiczki, sterylny obłoż, a także szwy Prolene 6-0. Niezbędne będą również 2 pary wysterylizowanych pęset, 1 para nożyczek tępych, skalpel oraz igłotrzymacz. Instrumenty chirurgiczne można wysterylizować w sterylizatorze perłowym rozgrzanym do 250 °C. Przed użyciem należy wysterylizować i umyć telemetr zgodnie z wcześniejszym opisem.
2. Mysz przygotowuje się do operacji, najpierw poddając ją znieczuleniu w komorze indukcyjnej przy użyciu 3% izofluranu w przepływie 0,5 L/min 100% O2. Aby utrzymać temperaturę znieczulonej myszy, należy zastosować matę grzewczą, np. pompę T, która cyrkuluje ciepłą wodę. Jeśli jest to konieczne, temperaturę można monitorować za pomocą sondy rektalnej. Po odpowiednim uspokojeniu myszy należy całkowicie ogolić brzuch i klatkę piersiową za pomocą strzyżarki elektrycznej. Przed przeniesieniem myszy do rurki o stałym przepływie należy ją ponownie znieczulić izofluranem; mysz układa się na plecach, głową w stronę przeciwną, a ogonem w stronę operatora. Łapy myszy należy przymocować taśmą do podgrzewanego stołu operacyjnego. Brzuch należy przetrzeć gazikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć pozostałości sierści i oczyścić pole operacyjne. Za pomocą gazików należy nanieść trzy oddzielne warstwy betadyny w celu dezynfekcji brzucha i klatki piersiowej. Prawidłowy poziom znieczulenia weryfikuje się poprzez ucisk łożyska paznokcia myszy. Po przygotowaniu myszy do operacji należy założyć sterylne rękawiczki i założyć sterylny obłoż na pole operacyjne.
3. Implantacja telemetru do jamy otrzewnowej daje korzyść w postaci możliwości prowadzenia eksperymentów z zakresu fizjologii wysiłku. W przypadku implantacji do jamy otrzewnowej zabieg rozpoczyna się od wykonania skalpelem pionowego cięcia w linii pośrodkowej skóry nad brzuchem o długości około 2,5 cm. Należy ostrożnie oddzielić skórę od leżących poniżej tkanek łącznych za pomocą nożyczek tępych. Następnie wykonuje się pionowe cięcie w linii pośrodkowej w obrębie linea alba nad otrzewną o długości około 1,5 cm. Dodatkowo, powyżej (głowowo) cięcia otrzewnej należy wykonać mały otwór w otrzewnej, który będzie służył jako wyjście dla prowadników podskórnych. Podczas operacji należy utrzymywać pole operacyjne w wilgotnym stanie, okresowo zakraplając je sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
4. Telemetr należy wprowadzić do prawej jamy otrzewnowej. Do otworu znajdującego się powyżej telemetru wprowadza się pęsetę i wyciąga oba prowadniki przez otwór na prowadniki tak, aby wystawały one z otrzewnej. Należy użyć ciągłych szwów Prolene 6-0 do zamknięcia 1,5 cm pionowego cięcia w linii pośrodkowej otrzewnej.

3. Implantacja elektrod i zamknięcie powłok brzusznych

1. Elektrody EKG są rozmieszczane w konfiguracji odprowadzenia II. Elektroda z białą/przezroczystą izolacją jest ujemna i zostaje umieszczona w lewej górnej części brzucha. Najpierw wykonaj nacięcie skóry o długości 0,5 cm w prawej górnej części klatki piersiowej myszy. Następnie, za pomocątępych nożyczek, utwórz tunel prowadzący z powrotem do nacięcia brzusznego. Przeciągnij elektrodę przez tunel i użyj szwy Prolene 6-0, aby przymocować elektrodę do mięśnia piersiowego. Upewnij się, że szew znajduje się nad odsłoniętą częścią elektrody i zapewnia dobry kontakt elektrody z leżącym pod nią mięśniem. Użyj drugiego szwu proksymalnie względem wspomnianego wcześniej, aby unieruchomić elektrodę w mięśniu. Zamknij nacięcie skóry za pomocą szwy Prolene 6-0.
2. Elektrodę dodatnią (czerwona izolacja) umieść w lewej części brzucha, poniżej lewej przepony i poniżej serca. Elektroda zostaje przymocowana do podścielającej tkanki otrzewnej szwem Prolene 6-0 i powinna mieć dobry kontakt z tkanką otrzewną. Dodatkowe nacięcie na tym etapie nie jest konieczne, ponieważ miejsce implantacji elektrody znajduje się blisko pionowego nacięcia po linii środkowej, zatem można do niego łatwo dotrzeć w obrębie istniejącego pola operacyjnego. Należy pamiętać, że tkankę otrzewną należy unieść, aby uniknąć perforacji leżącego poniżej jelita.
3. Zamknij powięź brzuszną i skórę kolejno warstwami za pomocą szwy Prolene 6-0.

4. Opieka pooperacyjna

1. Niezwłocznie po operacji podaj myszy 0,1 mL buprenorfiny w stężeniu [1 mg/mL] w celu zapewnienia analgezji. Pozostaw mysz na podgrzewanej podkładce do czasu wybudzenia z narkozy. Jeśli operacja trwała dłużej niż > 30 min lub jeśli mysz wydaje się odwodniona, można wstrzyknąć 0,2-0,3 mL jałowej soli fizjologicznej do otrzewnej w celu nawodnienia. W ramach standardowej procedury analgezji pooperacyjnej myszom podaje się buprenorfinę dwa razy dziennie przez trzy dni, a następnie co osiem godzin w razie potrzeby.
2. Usuń betadynę za pomocą gazika nasączonego alkoholem, aby uniknąć podrażnień pooperacyjnych. Pamiętaj o zapisaniu masy ciała po operacji w celu późniejszej oceny stanu zdrowia zwierzęcia.
3. Od 8 do 24 godzin po operacji podaj myszy dodatkową dawkę buprenorfiny w razie potrzeby; pozwoli to zmniejszyć ból oraz zredukować ryzyko przemieszczenia elektrody spowodowane drapaniem przez mysz miejsca operowanego.

5. Reprezentatywne wyniki

Przy prawidłowym wykonaniu nacięcia brzuszne u myszy powinny być zamknięte, a pod skórą powinny znajdować się elektrody podskórne. Zazwyczaj mysz potrzebuje od 10 do 30 minut na wybudzenie z narkozy. Pełna rekonwalescencja po zabiegu trwa około 7-10 dni, co potwierdza odzyskanie utraconej pooperacyjnie masy ciała oraz normalizacja ruchomości.

Najczęstszym powikłaniem pooperacyjnym jest przerwanie ciągłości skóry przez elektrody kończyn w ciągu pierwszych 10 dni po zabiegu. Tego powszechnego powikłania można uniknąć poprzez trwałe przymocowanie elektrod podskórnych do tkanek podskórnych lub otrzewnej. Technika ta zapobiega powstawaniu luzów w przewodach, które podczas poruszania się myszy powodują ucisk i tarcie skóry. Choć zdarza się to rzadziej, z powodu błędów w technice sterylnej lub niepełnego oczyszczenia używanych telemetrów mogą wystąpić infekcje i sepsa.

Wyniki EKG mogą być rejestrowane przez macierz odbiorczą połączoną z oprogramowaniem do akwizycji danych, takim jak Data Sciences International (DSI). Wyniki przebiegu fali powinny zawierać wyraźnie zdefiniowaną załamkę P, oznaczającą depolaryzację przedsionków, a także zespół QRS, który oznacza depolaryzację komór, jak pokazano na poniższej Rysunku 3. Wysokiej jakości zapis EKG powinien charakteryzować się wyraźnie zdefiniowaną załamką P poprzedzającą wyraźnie zdefiniowany zespół QRS w stosunku 1:1. W przypadku myszy typu dzikiego sygnał tła powinien być niski, a odstępy R-R regularne. Zapis EKG złej jakości może wykazywać niewyraźne załamki P lub QRS bądź silny sygnał tła, co może utrudnić późniejszą analizę komputerową. Wadliwy zapis EKG można naprawić poprzez ponowną implantację elektrod telemetrii, zazwyczaj po jednej. Aby ponownie zaimplantować elektrodę telemetrii, należy podać myszy anestezję i za pomocą techniki chirurgicznej wykonać nacięcie skóry bezpośrednio nad odpowiednią elektrodą. Po uzyskaniu dostępu do elektrody należy przeciąć szew ją mocujący, przenieść elektrodę w pożądane miejsce, a następnie ponownie ją zamocować. Na koniec miejsce operacyjne należy zamknąć szwem 6-0 Prolene.

Rycina 1: Przykład telemetru dla małych zwierząt z elektrodami dodatnią i ujemną. Zazwyczaj czerwony przewód jest elektrodą dodatnią, a biały przewód jest elektrodą ujemną. Każdy przewód powinien posiadać izolacyjną osłonę, 5-7 mm odsłoniętego drutu oraz plastikową zaślepkę na końcówce, która zapobiega przetracaniu się przewodu przez skórę.

Rycina 2: Schemat przedstawiający prawidłowe miejsca implantacji telemetru u myszy. Biały przewód (ujemny) jest implantowany w prawej górnej części klatki piersiowej myszy, a czerwony przewód (dodatni) jest umieszczany w lewym brzuchu, tak aby telemetr rejestrował sygnał w konfiguracji „lead two”.

Rysunek 3: Reprezentatywny zapis EKG myszy w rytmie zatokowym. Załamki P reprezentują depolaryzację przedsionków, a kompleks QRS reprezentuje depolaryzację komór. Wysokiej jakości zapis powinien charakteryzować się wyraźnym załamkiem P poprzedzającym każdy kompleks QRS w stosunku 1:1.

Dyskusja

Kluczowymi etapami tej procedury są właściwe oczyszczenie i przygotowanie myszy przed operacją z zachowaniem życia zwierzęcia. Prawidłowe oczyszczenie telemetru oraz miejsca operacyjnego u myszy znacząco poprawia wyniki pooperacyjne. Ponadto szczególną uwagę poświęconą rozmieszczeniu elektrod udaje się ograniczyć erozję skóry po operacji. Możliwe modyfikacje tej techniki obejmują alternatywne konfiguracje do oceny funkcji bocznej ściany LV (konfiguracja odprowadzenia I) lub wykorzystanie telemetru nie tylko do analizy pr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sterylizator do koralików Steri 250	Inotech	IS-250
Nożyce z tępymi końcami	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5980
Pincety z tępymi końcami (x2)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5138
Weterynaryjny parownik do znieczulenia	Surgivet	Isotec 4
Pompa T/Pump	Gaymar Industries	P/N11184-000
Monofilamentowa nić chirurgiczna Propylene Blue	Ethicon Inc.	8718
Powlidon jodowy, 10%	Equate	N/A
Gaziki nasączone alkoholem	PDI	B339
Tergazyme	Alconox, Inc.	21837-118
Wavidicde-01	Medical Chemical Corporation	Wavicide-01
Telemetr EKG	DataSciences International	EA-F20