Wykorzystanie odpowiedzi optokinetycznej do badania funkcji wzrokowych danio pręgowanego

Podsumowanie

Odpowiedź optokinekińska jest szeroko stosowana do oceny funkcji wizualnych larw danio pręgowanego. Niemniej jednak standardowy protokół dla larw ryb nie jest jeszcze łatwy do zastosowania u dorosłych^{osobników w wieku 1-5} lat. W tym artykule przedstawiamy, jak mierzyć OKR dorosłych ryb danio pręgowanego przy użyciu nowego protokołu, który został opracowany w naszym laboratorium.

Streszczenie

Reakcja optokinekińska (OKR) to zachowanie, w którym zwierzę wibruje oczami, podążając za obracającą się wokół niego kratą. Jest szeroko stosowany do oceny funkcji wzrokowych larw danio pręgowanego^1-5. Niemniej jednak standardowy protokół dla larw ryb nie jest jeszcze łatwy do zastosowania u dorosłych ryb zabrafish. W tym artykule przedstawiamy, jak mierzyć OKR dorosłych ryb danio pręgowanego za pomocą naszego prostego, niestandardowego urządzenia przy użyciu nowego protokołu, który został opracowany w naszym laboratorium. Zarówno nasza aparatura, jak i procedura OKR krok po kroku u dorosłych danio pręgowanego są zilustrowane w tym filmie. Ponadto w tym filmie pokazano również pomiary OKR larw, a także test odpowiedzi optomotorycznej (OMR) dorosłego danio pręgowanego. Ten test OKR dorosłego danio pręgowanego w naszym eksperymencie może trwać do 4 godzin. Taki test OKR zastosowany u dorosłych ryb przyniesie korzyści w bardziej efektywnym badaniu funkcji wzrokowych, gdy system widzenia dorosłych ryb jest manipulowany.

Su-Qi Zou i Wu Yin w równym stopniu przyczynili się do powstania tego artykułu.

Protokół

Część I: Konstruowanie aparatu OKR

Szczegóły są pokazane w demonstracji wideo.

Część II: OKR dorosłych ryb pręgowanych

Jeśli twoje laboratorium zbudowało urządzenie OKR, kluczem do OKR dla dorosłego danio pręgowanego jest trzymanie ryby. W tej części pokażemy Ci krok po kroku.

Nasze urządzenie składa się z następujących części podobnych do innych wymienionych. Okrągła komora na ryby ma 7,0 cm średnicy zewnętrznej, 6,5 cm średnicy wewnętrznej i 7,0 cm wysokości. Bęben wokół komory rybnej ma 8,5 cm średnicy zewnętrznej, 7,5 cm średnicy wewnętrznej i 7,0 cm wysokości. Może obracać się zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara z prędkością od 20 ~ 70 obrotów na minutę (obr./min). Jedenaście cykli czarno-białych pasków jest narysowanych na kalce technicznej, która przylega na zewnątrz bębna. System oświetleniowy składa się z dwóch okrągłych rur świetlnych o średnicy 21 cm.

Rysunek 1. Model gąbki. Klif wykonany w tym środku ma na celu upewnienie się, że pole widzenia nie jest osłonięte.

1. Gąbka, jak pokazano na rys.1, składa się z dwóch części. Lewa część ma długość 3 cm x szerokość 3 cm x wysokość 2 cm. Prawa część ma długość 3 cm x szerokość 3 cm x wysokość 3 cm.
2. Umieść tę gąbkę na dnie komory rybnej i zalej wodą z hodowli na głębokość około 2 cm. Pęcherzyki powietrza, które chowają się w gąbce, należy wypuścić.
3. Włóż szpilkę z przodu prawej części gąbki, około 2 mm za klifem.
4. Znieczulij dorosłego danio pręgowanego w MS-222.
5. Połóż danio pręgowanego na gąbce grzbietem do góry i pozwól jednej stronie płetwy piersiowej przed pierwszą szpilką.
6. Drugi kołek jest wkładany za drugą płetwę piersiową. Mogłoby to zapobiec kurczeniu się ciała danio pręgowanego poprzez współpracę z pierwszym kołkiem (patrz również na rys. 2).
7. Zaciśnij jego ogon za pomocą zacisku tętniczego i zamocuj zacisk tętnicy w kawałku gumy (plasteliny), który przykleja się do komory rybnej.
8. Trzecią i czwartą szpilkę sadzi się w miejscu w pobliżu porów kloaki ciała ryby. Może to zapobiec intensywnemu machaniu ogonem przez danio pręgowanego.
9. Piąty pin znajduje się między pierwszym a trzecim pinem, a szósty pin znajduje się po jego drugiej stronie. Mogą zapobiec potrząsaniu ciałem danio pręgowanego.
10. Siódmy i ósmy kołek jest wkładany w miejsca w pobliżu skrzeli, aby utrzymać orientację głowy.
11. Wlej wodę z chowu do komory rybnej.
12. Po przebudzeniu danio pręgowanego pozwól mu się przystosować przez 5 ~ 10 minut.
13. Włącz światło tego urządzenia i pozwól danio pręgowanemu dostosować to oświetlenie przez 2 minuty.
14. Włącz silnik, aby napędzać kratę i pozwól danio pręgowanemu przystosować się przez 1 minutę.
15. Włącz kamerę i nagraj ruch gałek ocznych.
16. Przeanalizuj kąty oczu⁶ i liczby sakkad na swoim komputerze osobistym (reprezentatywny przykład analizy kątów oczu pokazano na rys. 2).

Rysunek 2. Kąt między osią oka a osią ciała.

a) Gdy kierunek siatki jest nosowo-skroniowy, zdefiniowaliśmy, że kąt przed ciałem ryby jest kątem ujemnym, a kąt ciała ryby jest kątem dodatnim, odwrotnie (dla krótkiego przeglądu patrz również Ref. 6). Liczby na tym rysunku reprezentują sekwencję pinów.

b) Przykład analizy OKR z jednej ryby w normalnej grupie. Jednosekundowy film został przeniesiony na serię klatek, a kąty widzenia każdej klatki zostały zmierzone za pomocą oprogramowania Image-pro Plus. Każdy punkt na tym rysunku reprezentuje każdą zmierzoną przez nas klatkę.

Uwagi:

1. Wszystkie szpilki służą tylko do tego, aby danio pręgowany nie trząsł swoim ciałem, zbyt ciasne będzie szkodliwe dla ryb.
2. Zacisk tętniczy może uszkodzić ogon, ponieważ jego powierzchnia styku jest mała. Gdy ogon jest wolny, bardzo trudno jest naprawić tę rybę. W pewnych warunkach zaleca się owinięcie bandaża wokół ogona.
3. Siódma i ósma szpilka, które są posadzone w miejscu w pobliżu skrzeli, nie powinny być chronione przed ich wzrokiem kraty.

Część III. OKR larw danio pręgowanego

1. Metyloceluloza

Larwy danio pręgowanego mogą być unieruchomione w 6% roztworze metylocelulozy, utrzymując się przy życiu przez długi czas. Przygotować roztwór metylocelulozy w następujący sposób.

1. Zagotuj 200 ml ddH₂O w kuchence mikrofalowej około 3 minuty na wysokim poziomie.
2. Przelej gorącą wodę na mieszającą płytę grzejną i energicznie wymieszaj.
3. Stopniowo dodawaj 12 g metylocelulozy do gorącej wody.
4. Mieszaj przez 3 minuty po tym, jak metyloceluloza zostanie dobrze zdyspergowana.
5. Schłodzić roztwory lodowatą wodą, aż staną się klarowne, a następnie umieścić je w temperaturze 4°C.

2. Larwy danio pręgowanego

1. Łączy w pary dwóch samców i samicę dorosłego danio pręgowanego w zbiorniku godowym o godzinie 17:00 po karmieniu. Następnego ranka przenieś je do świeżego zbiornika godowego i zbierz zarodki po 1 godzinie.
2. Jaja są utrzymywane w pożywce zarodkowej w inkubatorze o temperaturze 28,5±0,5°C z cyklem światło: ciemność 14:10.
3. Jaja wyklują się po 48 godzinach od zapłodnienia (hpf), a OKR zostanie przetestowany przy 72 hpf lub później. Na tym filmie larwy są na poziomie 5 dpf.

3. Procedura OKR

1. Umieść aparat pod stereoskopem wyposażonym w kamerę CCD i włącz światło tego aparatu.
2. Dodaj 20 ml 6% metylocelulozy na szalkę Petriego o średnicy 55 mm.
3. Umieść kilka larw w rzędzie na środku tego naczynia.
4. Umieść pęcherzyk powietrza o objętości około 1 μl w polu kamery, może to być lustro odbijające kierunek kraty.
5. Włącz silnik i nagrywaj ruch ich oczu.

Część IV. OMR dorosłego danio pręgowanego

Za pomocą tego urządzenia można również przeprowadzić OMR dla dorosłych ryb danio pręgowanego, wystarczy umieścić kolumnę w komorze rybnej, aby zapobiec przepływaniu ryb przez środek (pokazano na rys.3a, prędkość obrotowa wynosi 36 obr./min, cykle czarno-białe to 11).

1. Umieść rybę w tej komorze na ryby.
2. Postaw kolumnę o średnicy 2 cm w środku tej komory rybnej.
3. Adaptuj przez jedną minutę zarówno w ruszcie rusztowym, jak i obrotowym.
4. Rejestruj ruch danio pręgowanego.
5. Przeanalizuj współczynnik koincydencji czasu na swoim komputerze osobistym (przykład pokazano na rys.3b, prędkość obrotowa wynosi 36 obr./min, cykl czarno-biały to 11)

Rysunek 3. OMR dorosłego danio pręgowanego. (a) Biała kolumna z tworzywa sztucznego została umieszczona w centrum komory rybnej w celu uniemożliwienia rybom przepłynięcia przez nią. b) Współczynnik koincydencji dorosłych ryb danio pręgowanego po kratowaniu. Współczynnik koincydencji zdefiniowano jako stosunek czasu następnego siatkowania do całkowitego czasu nagrywania. Wartość 50% wskazuje, że ryba pływa losowo, podczas gdy 100% bardzo dobrze wskazuje, że ryba podąża za kratą. Oba nerwy wzrokowe zostały zmiażdżone kleszczami jubilerskimi po około 10 sekundach. Zachowanie OMR wyglądało jak losowe pływanie po zmiażdżeniu.

Dyskusja

Zgodnie z definicją OKR jest to zjawisko polegające na tym, że zwierzęta spontanicznie poruszają oczami, aby podążać za obracającą się kratą. Jeśli takie zachowanie było prowadzone przez długi czas (np. powyżej 6 godzin), mięśnie oka mogą być zmęczone, a OKR zostanie osłabiony.

Dorosły danio pręgowany OMR został całkowicie opisany przez innych⁷. W tym filmie pokazujemy tylko to zachowanie z naszym aparatem. Gdy nerwy wzrokowe zostaną zmiażdżone, nie mogą one zbyt dobrze podążać za ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Metyloceluloza	Sigma-Aldrich	M6385	Lepkość 25 cP