Wykorzystanie odpowiedzi optokinetycznej do badania funkcji wzrokowych u rybek danio

Podsumowanie

Reakcja optokinetyczna była szeroko stosowana do oceny funkcji wzrokowych larw danio prążkowanego. Niemniej jednak standardowy protokół dla ryb larwalnych nie jest jeszcze łatwo stosowalny u osobników dorosłych^1-5. W niniejszej pracy przedstawiamy sposób pomiaru OKR u dorosłych danio prążkowanych z wykorzystaniem nowego protokołu opracowanego w naszym laboratorium.

Streszczenie

Odruch optokinetyczny (OKR) to zachowanie polegające na tym, że zwierzę wykonuje ruchy gałek ocznych w celu śledzenia obracającej się wokół niego kratki. Jest on powszechnie wykorzystywany do oceny funkcji wzrokowych larw zebrafish^1-5. Niemniej jednak standardowy protokół dla larb ryb nie jest jeszcze łatwo stosowalny u dorosłych osobników zebrafish. W niniejszym materiale przedstawiamy sposób pomiaru OKR u dorosłych zebrafish z wykorzystaniem naszego prostego, autorskiego urządzenia oraz nowego protokołu opracowanego w naszym laboratorium. Zarówno konstrukcja urządzenia, jak i procedura pomiaru OKR u dorosłych zebrafish krok po kroku zostały przedstawione w tym filmie. Ponadto w filmie zaprezentowano pomiary OKR u larw, a także test odruchu optomotorycznego (OMR) u dorosłych zebrafish. Przeprowadzony przez nas test OKR u dorosłych zebrafish może trwać do 4 godzin. Zastosowanie testu OKR u dorosłych ryb pozwoli na bardziej efektywne badanie funkcji wzrokowych w sytuacjach, gdy układ wzrokowy dorosłych ryb zostaje poddany manipulacjom.

Su-Qi Zou i Wu Yin wnieśli równy wkład w tę pracę.

Protokół

Część I: Konstrukcja aparatury OKR

Szczegóły przedstawiono w demonstracji wideo.

Część II: OKR dorosłych danio-pręgowanych

Jeśli w Twoim laboratorium zbudowano aparat OKR, kluczowym elementem badania OKR u dorosłych danio pręgowanych jest unieruchomienie ryby. W tej części przedstawimy ten proces krok po kroku.

Nasze urządzenie składa się z następujących części, podobnych do tych wymienionych wcześniej. Okrągła komora dla ryb ma średnicę zewnętrzną 7,0 cm, średnicę wewnętrzną 6,5 cm i wysokość 7,0 cm. Bęben otaczający komorę dla ryb ma średnicę zewnętrzną 8,5 cm, średnicę wewnętrzną 7,5 cm i wysokość 7,0 cm. Może on obracać się zgodnie i przeciwnie z ruchem wskazówek zegara z prędkością od 20~70 rpm. Jedenaście cykli czarnych i białych pasów zostało narysowanych na papierze kalkowym, który przyklejono do zewnętrznej strony bębna. System oświetlenia składa się z dwóch okrągłych świetlówek o średnicy 21 cm.

Rysunek 1. Model gąbki. Wycięcie wykonane w środku służy zapewnieniu, aby pole widzenia nie było przesłonięte.

1. Gąbka przedstawiona na Rys. 1 składa się z dwóch części. Część lewa ma wymiary: długość 3 cm x szerokość 3 cm x wysokość 2 cm. Część prawa ma wymiary: długość 3 cm x szerokość 3 cm x wysokość 3 cm.
2. Umieść tę gąbkę na dnie komory dla ryb i wlej wodę hodowlaną do głębokości około 2 cm. Należy usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione w gąbce.
3. Wbij pinezkę w przednią część prawej strony gąbki, około 2 mm za krawędzią.
4. Zanurz dorosłego zebrafisha w roztworze MS-222 w celu znieczulenia.
5. Połóż zebrafisha na gąbce grzbietem do góry, tak aby jedna z jego płetw piersiowych znajdowała się przed pierwszą pinezką.
6. Drugą pinezkę wbij za drugą płetwą piersiową. Wraz z pierwszą pinezką zapobiega to kurczeniu się ciała zebrafisha (patrz również Rys. 2).
7. Zaciśnij ogon kleszczykami naczyniowymi i zamocuj kleszczyki w kawałku gumy (plasteliny) przyklejonym do komory dla ryb.
8. Trzecią i czwartą pinezkę wbij w okolicy otworu kloaki ciała ryby. Zapobiega to intensywnemu machaniu ogonem przez zebrafisha.
9. Piątą pinezkę umieść pomiędzy pierwszą a trzecią pinezką, a następnie szóstą pinezkę po przeciwnej stronie. Zapobiegną one drżeniu ciała zebrafisha.
10. Siódmą i ósmą pinezkę wbij w okolicach skrzeli, aby utrzymać orientację głowy.
11. Dolej wodę hodowlaną do komory dla ryb.
12. Po wybudzeniu się zebrafisha pozwól mu na aklimatyzację przez 5~10 minut.
13. Włącz światło w aparacie i pozwól zebrafishowi przyzwyczaić się do oświetlenia przez 2 minuty.
14. Włącz silnik napędzający kratkę i pozwól zebrafishowi na adaptację przez 1 minutę.
15. Włącz kamerę i zarejestruj ruchy oczu.
16. Przeanalizuj kąty ustawienia oczu⁶ oraz liczbę sakad na komputerze osobistym (reprezentatywny przykład analizy kątów ustawienia oczu przedstawiono na Rys. 2).

Rycina 2. Kąt pomiędzy osią oka a osią ciała.

a) Gdy kierunek prążkowania jest od strony nosowej do skroniowej, zdefiniowano, że kąt przed ciałem ryby jest kątem ujemnym, a kąt przy ciele ryby jest kątem dodatnim i na odwrót (w celu krótkiego przeglądu patrz również Ref. 6). Liczby na rysunku reprezentują kolejność pinów.

b) Przykład analizy OKR u jednej ryby z grupy kontrolnej. Jednosekundowy film przeniesiono do serii klatek, a kąty oczu na każdej klatce zmierzono za pomocą oprogramowania Image-pro Plus. Każdy punkt na tym wykresie reprezentuje każdą zmierzoną klatkę.

Uwagi:

1. Wszystkie piny służą jedynie do zapobiegania drganiom ciała danio prążkowanego; zbyt mocne ich dociśnięcie może zaszkodzić rybie.
2. Zacisk tętniczy może uszkodzić ogon ze względu na małą powierzchnię styku. Po uwolnieniu ogona bardzo trudno jest ponownie unieruchomić rybę. W niektórych przypadkach zaleca się owinięcie ogona bandażem.
3. Siódmy i ósmy pin, umieszczane w okolicy skrzeli, nie powinny zasłaniać rybie widoczności kratki.

Część III. OKR larw danio pręgowanego

1. Metyloceluloza

Larwy danio pręgowanego można unieruchomić w 6% roztworze metylocelulozy, utrzymując je przy życiu przez długi czas. Roztwór metylocelulozy należy przygotować w następujący sposób.

1. Zagotować 200 ml ddH₂O w kuchence mikrofalowej przez około 3 minuty na wysokiej mocy.
2. Przenieść gorącą wodę na mieszadło magnetyczne z podgrzewaniem i intensywnie mieszać.
3. Stopniowo dodawać 12 g metylocelulozy do gorącej wody.
4. Mieszać przez kolejne 3 minuty, aż metyloceluloza zostanie dobrze zdyspergowana.
5. Schłodzić roztwory w kąpieli lodowej, aż staną się klarowne, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C.

2. Larwy danio pręgowanego

1. W zbiorniku do tarła umieszcza się dwa samce i jedną samicę dorosłych danio pręgowanych o godzinie 17:00 po karmieniu. Następnego ranka przenosi się je do świeżego zbiornika do tarła i zbiera zarodki po 1 godzinie.
2. Jaja utrzymuje się w pożywce dla zarodków w inkubatorze w temperaturze 28,5±0,5°C przy cyklu światła i ciemności 14:10.
3. Kluski wykluwają się 48 godzin po zapłodnieniu (hpf), a OKR jest testowany w 72 hpf lub później. W tym filmie larwy znajdują się w 5 dpf.

3. Procedura OKR

1. Umieść aparat pod stereomikroskopem wyposażonym w kamerę CCD i włącz oświetlenie urządzenia.
2. Do szalki Petriego o średnicy 55 mm dodaj 20 ml 6% metylocelulozy.
3. Umieść kilka larw w rzędzie w centrum szalki.
4. Wprowadź w pole widzenia kamery pęcherzyk powietrza o objętości około 1 μl, który może służyć jako lustro do odbijania kierunku kratki.
5. Włącz silnik i zarejestruj ruchy ich oczu.

Część IV. OMR u dorosłych danio pręgowanych

Badanie OMR u dorosłych rybek danio również można przeprowadzić przy użyciu tego urządzenia; wystarczy umieścić kolumnę w komorze dla ryb, aby zapobiec ich przepływaniu przez środek (pokazano na Ryc. 3a, prędkość obrotowa wynosi 36 rpm, cykle czarno-białe wynoszą 11).

1. Umieść rybę w komorze dla ryb.
2. Ustaw kolumnę o średnicy 2 cm w centrum komory dla ryb.
3. Przeprowadź adaptację przez jedną minutę zarówno przy nieruchomej kratce, jak i przy kratce obrotowej.
4. Zarejestruj ruch zebrafish.
5. Przeanalizuj współczynnik zbieżności czasowej na komputerze osobistym (przykład pokazano na ryc. 3b; prędkość obrotowa wynosi 36 rpm, cykl czarno-biały wynosi 11)

Rysunek 3. OMR u dorosłych osobników Danio pręgowanego. (a) W centrum komory dla ryb umieszczono białą plastikową kolumnę, aby zapobiec przepływaniu ryb przez nią. (b) Wskaźnik koincydencji dorosłych osobników Danio pręgowanego podążających za prążkami. Wskaźnik koincydencji zdefiniowano jako stosunek czasu podążania za prążkami do całkowitego czasu rejestracji. Wartość 50% wskazuje na przypadkowe pływanie ryby, natomiast 100% oznacza bardzo dokładne podążanie za prążkami. Oba nerwy wzrokowe zostały zmiażdżone pęsetą jubilerską przez około 10 sekund. Po zmiażdżeniu zachowanie OMR objawiało się jako przypadkowe pływanie.

Dyskusja

Zgodnie z definicją OKR jest to zjawisko, w którym zwierzęta poruszają oczami, aby spontanicznie śledzić obracającą się kratkę. Jeśli zachowanie to trwa przez dłuższy czas (np. powyżej 6 godzin), mięśnie gałki ocznej mogą ulec zmęczeniu, co doprowadzi do osłabienia odpowiedzi OKR.

Odpowiedź optokinetyczna (OMR) u dorosłych rybek zebrafish została w pełni opisana przez innych autorów⁷. W tym filmie prezentujemy jedynie to zachowanie z wykorzystaniem naszej aparatury. Po zmiażdżeniu ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Metyloceluloza	Sigma-Aldrich	M6385	Lepkość 25 cP