Przedstawiamy użyteczność wielokolorowej cytometrii przepływowej w szczegółowej charakterystyce fenotypowej i funkcjonalnej całkowitych populacji, a także podzbiorów komórek pamięci limfocytów T CD4+ i CD8+ u makaków rhesus, które stanowią idealny model w badaniach nad szczepionkami przeciwko HIV/AIDS.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wielokolorowe analizy cytometryczne odpowiedzi immunologicznej komórkowej u makaków rezus
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Model z użyciem makaki rhesus jest obecnie najlepszym dostępnym modelem HIV/AIDS w kontekście zrozumienia patogenezy, a także opracowywania szczepionek i terapii1,2,3W niniejszej pracy opisujemy metodę szczegółowych analiz fenotypowych i funkcjonalnych odpowiedzi immunologicznych komórkowych, a konkretnie wewnątrzkomórkowej produkcji cytokin przez limfocyty T CD4+ i CD8+ oraz poszczególne subpopulacje komórek pamięci. Uzyskaliśmy precyzyjne pomiary ilościowe i jakościowe produkcji interferonu gamma (INF-γ) i interleukiny (IL)-2 w limfocytach T CD4+ i CD8+ z PBMC makaka rezusa stymulowanych PMA oraz jonomycyną (PMA+I). Profile cytokin różniły się w zależności od subpopulacji komórek pamięci. Co więcej, protokół ten zapewnił nam czułość pozwalającą na wykazanie nawet niewielkich frakcji antygenowo swoistych subpopulacji limfocytów T CD4+ i CD8+ w próbkach PBMC od makaków rezusów immunizowanych opracowaną w naszym laboratorium koktajlową szczepionką peptydową z białek otoczki HIV. Wielokolorowa cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem do precyzyjnej identyfikacji różnych populacji limfocytów T4,5ze zdolnością do produkcji cytokin6po stymulacji nieswoistej lub swoistej antygenowo5,7(empty)
Protokół
Procedury szczegółowych analiz fenotypowych i funkcjonalnych całkowitej populacji oraz podzbiorów pamięci limfocytów T można podzielić na cztery części: 1) przygotowanie komórek i stymulację antygenową, 2) barwienie markerów powierzchniowych, 3) wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin oraz 4) analizy cytometryczne.
1. Przygotowanie komórek i stymulacja antygenowa
- W niniejszym protokole wykorzystano zarówno świeżo izolowane, jak i krio-konserwowane mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC). Komórki PBMC izolowano z heparynowanych lub cytrynianowych próbek krwi żylnej makaków rhesus poprzez sedymentację w gradiencie gęstości przy użyciu Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO). Alikwoty PBMC przechowywano w zamrożeniu w 90% FCS i 10% DMSO w ciekłym azocie.
- W przypadku użycia krio-konserwowanych PBMC, fiolki z zamrożonymi komórkami wyjmowano z ciekłego azotu i szybko rozmrażano w kąpieli wodnej o temperaturze 37 C, delikatnie mieszano, przemywano medium RPMI-1640 (HyClone laboratories, logan, UT) w celu usunięcia medium do zamrażania i resuspendowano w medium kompletnym [CM; RPMI-1640 uzupełnione o 10% inaktywowanego ciepłem FCS (HyClone laboratories), 2mM L-glutaminy (Sigma-Aldrich), 100U/ml penicyliny/streptomycyny (Invitrogen)], a następnie hodowano w 6-dołkowych płytkach do hodowli tkanek przez noc w temperaturze 37°C w humidyfikowanej atmosferze 5% CO2. Następnego ranka określono liczbę żywych komórek metodą wykluczania barwnika trypan-błękitu i resuspendowano je w CM.
- Komórki traktowano różnie w zależności od tego, czy przeprowadzano stymulację nieswoistą, czy swoistą antygenowo, przed kolejnymi analizami cytokin: (a) do stymulacji nieswoistej za pomocą 12-mirystylanu 13-octanu forbolu (PMA) i jonomycyny (I) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), alikwoty komórek w objętości 0,1ml (1,0 x 106 komórek/dołek) wysiano do poszczególnych dołków 96-dołkowych płytek do hodowli tkanek (BD Biosciences, Franklin lake, NJ). PMA i jonomycynę stosowano w końcowych stężeniach odpowiednio 50ng/ml i 500ng/ml. Końcowa objętość całkowita dla 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek wynosiła 0,2ml/dołek: (b) do stymulacji swoistej antygenowo, 1,0 x 106 komórek w objętości 1,0 ml wysiano do poszczególnych dołków 24-dołkowych płytek do hodowli tkanek (BD Biosciences, Franklin lake, NJ), w których dołki zostały wcześniej potraktowane zgodnie z opisaną wcześniej modyfikacją9. W skrócie, 24-dołkowe płytki do hodowli tkanek powlekano przeciwciałami kozimi anty-mysimi IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD) w stężeniu 2,5 μg/ml/dołek w 50mM roztworze Tris (pH 8,6) przez noc w temperaturze 4°C. Następnego ranka płytki przemyto dwukrotnie sterylnym PBS i dodano kostymulujące mAb CD49d, klon 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA) w stężeniu 10 μg/ml/dołek, a następnie inkubowano przez jedną godzinę w 37°C. Po inkubacji płytki przemyto dwukrotnie sterylnym PBS w temperaturze pokojowej. Antygeny docelowe (w tym koktajl sześciu peptydów otoczki HIV8) dodano w końcowym stężeniu 10μg/ml dla każdego peptydu. Dodatkowe dołki z komórkami w samym CM przygotowano jako kontrolę negatywną. Końcowa objętość całkowita dla każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek wynosiła 1,0 ml.
- Komórki hodowano przez 6 godzin w temperaturze 37°C w humidyfikowanej atmosferze 5% CO2. Brefeldyna A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) została dodana do hodowli w stężeniu 10μg/ml przez ostatnie 4,5 godziny stymulacji. Następnie komórki przeniesiono do 5 ml probówek polipropylenowych i przemyto zimnym (4°C) buforem do płukania w cytometrii (PBS Dulbecco (DPBS, bez Ca2/Mg2; Life technologies, Rockville, MD) z 2% inaktywowanym ciepłem FCS), a następnie poddano barwieniu za pomocą różnych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie.
2. Immunofluorescencyjne barwienie markerów powierzchniowych
- Stymulowane komórki najpierw barwiono 1ul fluorescencyjnym barwnikiem reaktywnym live/dead fixable aqua w temperaturze 4°C w ciemności przez 30 minut, a następnie raz przemywano zimnym buforem do płukania w cytometrii przepływowej.
- Następnie do komórek dodano odpowiednio miareczkowane przeciwciała monoklonalne znakowane fluorescencyjnie: anty-CD3 PE-Cy7 (SP34-2), anty-CD8 Alexa700 (RPA-T8), anty-CD28 PerCP-cy5.5 (L293), anty-CD95 APC (DX2) oraz anty-CD4 pacific blue (OKT4); wszystkie pochodziły od BD Biosciences (Franklin lake, NJ), z wyjątkiem anty-CD4 pacific blue (OKT4) od eBioscience (San Diego, CA). Komórki inkubowano przez 30 minut w temperaturze 4°C w ciemności.
- W każdym eksperymencie wykorzystano zarówno kontrole kompensacji, jak i kontrole FMO (fluorescence minus one)10,11. Kontrole kompensacji służyły do wyznaczenia współczynników przenikania (spillover) każdego z poszczególnych barwników do innych detektorów. W przypadku kontroli kompensacji komplet probówek zawierających zawiesiny komórkowe od jednego małpy barwiono poszczególnymi mAb sprzężonymi z fluorochromem jako barwienia jednobarwne. FMO to wielobarwna kombinacja barwień, która zawiera wszystkie odczynniki z wyjątkiem badanego, i służy do wyznaczenia granicy między populacją pozytywną a negatywną poprzez odtworzenie poziomu autofluorescencji i danych obecnych w próbce w pełni zbarwionej.
- Zbarwione komórki przemyto następnie zimnym buforem do płukania w cytometrii przepływowej i utrwalono w roztworze do utrwalania i permeabilizacji (BD Biosciences; San Jose, CA) przez co najmniej 10 minut (na tym etapie komórki można przechowywać przez noc w temperaturze 4°C w ciemności) przed przeprowadzeniem wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin.
3. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin
- Utrwalone komórki przemyto buforem do płukania w cytometrii przepływowej, a następnie dodano bufor Perm/Wash (BD Biosciences; San Jose, CA) zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, komórki inkubowano w 0,1 ml 1X buforu Perm/Wash przez 10 minut w temperaturze 4°C w ciemności.
- Następnie komórki inkubowano z odpowiednio miareczkowanym przeciwciałem anty-IFN-γ (B27) znakowanym FITC oraz przeciwciałem anty-IL-2 (MQ1-17H12) znakowanym PE przez 60 minut w temperaturze 4°C w ciemności.
- Następnie komórki przemyto jeszcze dwukrotnie roztworem do permeabilizacji.
- Po ostatnim płukaniu komórki zawieszono ponownie w 1% paraformaldehydzie w DPBS i poddano analizie cytometrycznej w ciągu 24 godzin.
4. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej
- Barwione komórki analizowano za pomocą cytometru przepływowego LSR II (BD Biosciences; San Jose, CA) lub CyAn ADP (Dako, Carpinteria, CA). Dane FACS analizowano przy użyciu oprogramowania FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).
- Rysunek 1 przedstawia schemat bramkowania wykorzystany do analizy różnych subpopulacji limfocytów T u reprezentatywnego zwierzęcia. Limfocyty wyodrębniono najpierw za pomocą bramkowania rozproszenia przedniego (FSC) względem rozproszenia bocznego (SSC), a następnie zidentyfikowano żywe limfocyty na podstawie SSC i populacji aqua-ujemnej. Limfocyty T zidentyfikowano pozytywnie poprzez ekspresję CD3, a następnie wykryto populacje CD4+ CD8- (limfocyty T CD4+) oraz CD4- CD8+ (limfocyty T CD8+) w obrębie populacji limfocytów T CD3+. Limfocyty T CD4+ i CD8+ podzielono dalej na różne subpopulacje na podstawie ekspresji CD28 i CD95 jako komórki naiwne (Tn, CD28+ CD95-), pamięci centralnej (Tcm, CD28+ CD95+) i pamięci efektorowej (Tem, CD28- CD95+), zgodnie z opisami w literaturze5, 10.
- Rysunek 2 przedstawia sposób oceny wydolności funkcjonalnej różnych subpopulacji limfocytów T CD4+ i CD8+ pod kątem produkcji cytokin (INF-γ i/lub IL-2) w odpowiedzi na stymulację PMA i jonomycyną (PMA+I).
5. Reprezentatywne dane FACS
Skład PBMC u makaków rhesus określono za pomocą analizy FACS. Rysunek 1 przedstawia schemat bramkowania wykorzystany do analizy różnych subpopulacji limfocytów T u reprezentatywnego zwierzęcia. Limfocyty wyodrębniono najpierw poprzez bramkowanie rozpraszania w przód (FSC) względem rozpraszania bocznego (SSC), a następnie zidentyfikowano żywe limfocyty na podstawie SSC oraz populacji aqua-negatywnej. Limfocyty T zidentyfikowano następnie na podstawie ekspresji CD3. W obrębie populacji limfocytów T CD3+ określono również populacje CD4+ CD8- (limfocyty T CD4+) oraz CD4- CD8+ (limfocyty T CD8+). Jak pokazano na Rysunku 2, limfocyty T CD4+ i CD8+ podzielono dalej na różne subpopulacje na podstawie ekspresji CD28 i CD95 na komórki naiwne (Tn, CD28+ CD95-), pamięci centralnej (Tcm, CD28+ CD95+) oraz pamięci efektorowej (Tem, CD28- CD95+). Rysunek 2A przedstawia produkcję INF- γ i IL-2 w niepobudzonych oraz pobudzonych PMA / jonomycyną limfocytach T CD4+ i ich subpopulacjach, a Rysunek 2B przedstawia produkcję INF- γ i IL-2 w niepobudzonych oraz pobudzonych PMA / jonomycyną limfocytach T CD8+ i ich subpopulacjach. Należy zwrócić uwagę na odmienne profile cytokin wywołane stymulacją w każdej z subpopulacji.
Rysunek 1. Strategia bramkowania zastosowana w analizie cytometrycznej składu PBMC u makaków rezus. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.
Rysunek 2. (A) Profil produkcji cytokin dla całkowitej populacji limfocytów T CD4+ i ich subpopulacji. (B) Profil produkcji cytokin dla całkowitej populacji limfocytów T CD8+ i ich subpopulacji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2a, lub tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 2b.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Dr. Pramod Nehete i pani Bharti Nehete za próbki krwi i PBMC makaków; praca ta była częściowo finansowana ze środków z grantu NIH AI 46969, a wszystkie pożywki do hodowli komórkowych zostały przygotowane przez Central Media Laboratory, które jest finansowane z grantu NIH CA 16672.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
Roztwory i bufory | |||
| |||
Czynniki aktywujące | |||
| |||
Inhibitory sekrecji cytokin | |||
| |||
Przeciwciała | |||
|
Bibliografia
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 11-color 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
