$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Procedury szczegółowej analizy fenotypowej i funkcjonalnej całkowitych i pamięciowych podzbiorów limfocytów T można podzielić na cztery części: 1) Przygotowanie komórek i stymulacja antygenowa, 2) Barwienie markerów powierzchniowych, 3) Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych i 4) Analizy cytometrii przepływowej.
1. Przygotowanie komórek i stymulacja antygenowa
- W protokole tym wykorzystano zarówno świeżo wyizolowane, jak i kriokonserwowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC). PBMC wyizolowano z heparynizowanych lub cytrynowanych próbek krwi żylnej makaków rezusów przez sedymentację w gradiencie gęstości przy użyciu Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO). Podwielokrotności PBMC przechowywano zamrożone w 90% FCS i 10% DMSO w ciekłym azocie.
- Podczas stosowania kriokonserwowanego PBMC, fiolki zamrożonego PBMC wyjęto z ciekłego azotu i szybko rozmrożono w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie wymieszano, przemyto RPMI-1640 (HyClone laboratories, logan, UT) w celu usunięcia pożywki zamrażającej i ponownie zawieszono w kompletnej pożywce [CM; Suplement RPMI-1640 z 10% inaktywowanym termicznie FCS (laboratoria HyClone), 2mM L-glutaminą (Sigma-Aldrich), 100U/ml penicyliny/streptomycyny (Invitrogen) i hodowany na 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych przez noc w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Następnego ranka liczbę żywotnych komórek oznaczono metodą wykluczania barwnika trypan-niebieski barwnik i ponownie zawieszono w CM.
- Komórki traktowano inaczej pod kątem stymulacji nieswoistej i specyficznej dla antygenu, a następnie analizowano cytokiny: (a) W przypadku niespecyficznej stymulacji 12-mirystynianem forbolu 13-octanem (PMA) i jonomycyną (I) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), podwielokrotności komórek w objętości 0,1 ml (1,0 x 106 komórek/dołek) posiewano w indywidualnych dołkach 96-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (BD Biosciences, Jezioro Franklin, NJ). PMA i jonomycynę stosowano w końcowym stężeniu odpowiednio 50 ng / ml i 500 ng / ml. Ostateczna całkowita objętość dla 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej wynosi 0,2 ml / dołek: (b) W przypadku stymulacji specyficznej dla antygenu, 1,0 x 106 komórek w objętości 1,0 ml posiano w indywidualnych dołkach 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych (BD Biosciences, Franklin lake, NJ), gdzie studzienki poddano wstępnej obróbce, jak opisano wcześniej z modyfikacją9. Krótko mówiąc, 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych pokryto 2,5 μg/ml/ml / studzienka kozich anty-mysich IgG (H + L) (Laboratorium Kierkegaarda i Perry'ego, Gaithersburg, MD) w 50 mM roztworze Tris (PH 8,6) przez 4 °C przez noc. Następnego ranka płytki zostały dwukrotnie umyte sterylnym PBS i kostymulującym mAb CD49d, klon 9F10 (BD Biosciences; San Jose, Kalifornia) dodawano w stężeniu 10 μg/ml/basenik, a następnie inkubowano przez godzinę w temperaturze 37°C. Po inkubacji płytki przemywano dwukrotnie sterylnym PBS w temperaturze pokojowej. Antygeny będące przedmiotem zainteresowania (w tym koktajl sześciu peptydów otoczki HIV 8) dodano w końcowym stężeniu 10 μg/ml każdego peptydu. Dodatkowe studzienki z komórkami w samym CM przygotowano jako kontrolę ujemną. Ostateczna całkowita objętość dla każdego dołka z 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej wynosiła 1,0 ml.
- Komórki hodowano przez 6 godzin w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Brefeldin A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dodano do kultury w dawce 10 μg/ml na ostatnie 4,5 godziny stymulacji. Następnie komórki przeniesiono do probówek polipropylenowych o pojemności 5 ml i przemyto zimnym (4°C) buforem do przemywania (PBS firmy Dulbecco (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD) z 2% inaktywowanym termicznie FCS), a następnie przetwarzane do barwienia różnymi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie.
2. Barwienie powierzchni markerami immunofluorescencji
- Stymulowane komórki najpierw barwiono żywym/martwym reaktywnym barwnikiem fluorescencyjnym 1ul w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut, a następnie przemywano raz buforem do płukania na zimno.
- Następnie do komórek dodano następujące odpowiednio miareczkowane fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalne: anty-CD3 PE-Cy7 (SP34-2), anty-CD8 Alexa700 (RPA-T8), anty-CD28 PerCP-cy5.5 (L293), anty-CD95 APC (DX2) i anty CD4 pacyficzny niebieski (OKT4), wszystkie z BD Biosciences (Franklin lake, NJ), z wyjątkiem CD4 pacyficznego niebieskiego (OKT4) z eBioscience (San Diego, CA). Komórki inkubowano przez 30 minut w temperaturze 4°C w ciemności.
- W każdym eksperymencie wykorzystano zarówno kontrole kompensacyjne, jak i kontrole fluorescencji minus jeden (FMO)10,11. Kontrole kompensacyjne wykorzystano do określenia współczynników rozlewania się każdej pojedynczej plamy do innych detektorów. W przypadku kontroli kompensacyjnych kompletny zestaw probówek zawierających zawiesiny komórkowe jednej z małp barwiono fluorescencyjnie sprzężonymi mAb indywidualnie jako barwienia jednokolorowe. FMO to wielokolorowa kombinacja barwienia, która zawiera wszystkie odczynniki oprócz jednego interesującego i służy do określania granicy między populacją dodatnią i ujemną poprzez powielanie poziomu autofluorescencji i danych obecnych w całkowicie wybarwionej próbce.
- Wybarwione komórki przemywano następnie buforem do płukania na zimno i utrwalono w roztworze utrwalającym/przepuszczalnym (BD Biosciences; San Jose, Kalifornia) przez co najmniej 10 minut (na tym etapie komórki mogą być przechowywane przez noc w temperaturze 4°C w ciemności) przed wykonaniem wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin.
3. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych
- Stałe komórki przemyto buforem przepływowym, a następnie buforem Perm/Wash (BD Biosciences; San Jose, CA) został dodany zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, komórki inkubowano w 0,1 ml buforu 1X Perm/Wash przez 10 minut w temperaturze 4°C w ciemności.
- Następnie komórki inkubowano z odpowiednio miareczkowanym anty-IFN-γ znakowanym FITC (B27) i anty-IL-2 znakowanym PE (MQ1-17H12) przez 60 minut w temperaturze 4°C w ciemności.
- Następnie komórki przemyto jeszcze dwa razy roztworem permeabilizacyjnym
- Po ostatnim płukaniu komórki zostały ponownie zawieszone w 1% paraformaldehydzie w DPBS i poddane analizie cytometrii przepływowej w ciągu 24 godzin.
4. Analiza cytometrii przepływowej
- Wybarwione komórki pozyskano za pomocą cytometru przepływowego LSR II (BD Biosciences; San Jose, Kalifornia) lub CyAn ADP (Dako, Carpinteria, Kalifornia). Dane FACS analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).
- Rysunek 1 przedstawia schemat bramkowania wykorzystany do analiz różnych podzbiorów limfocytów T z reprezentatywnego zwierzęcia. Limfocyty najpierw bramkowano za pomocą rozproszenia do przodu (FSC) w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SSC), a następnie zidentyfikowano żywe limfocyty na podstawie SSC i populacji akwa-ujemnej. Limfocyty T zostały następnie pozytywnie zidentyfikowane przez ekspresję CD3, a następnie wykrycie CD4 + CD8- (limfocyty T CD4 +) i CD4 - CD8 + (limfocyty T CD8 +) w populacji limfocytów T CD3 +. Limfocyty T CD4 + i CD8 + zostały dalej rozróżnione na różne podzbiory na podstawie ekspresji CD28 i CD95 jako komórek naiwnych (Tn, CD28 + CD95-), pamięci centralnej (Tcm, CD28 + CD95 +) i pamięci efektorowej (Tem, CD28-CD95 +), jak opisano w literaturze5, 10.
- Rysunek 2 pokazuje, w jaki sposób różne podzbiory limfocytów T CD4 + i CD8 + oceniano pod kątem zdolności funkcjonalnej pod względem produkcji cytokin (INF-γ i / lub IL-2) w odpowiedzi na stymulację PMA i jonomycyną (PMA + I).
5. Reprezentatywne dane FACS
Skład PBMC u makaków rezusów został określony za pomocą analizy FACS. Rysunek 1 przedstawia schemat bramkowania wykorzystany do analiz różnych podzbiorów limfocytów T od reprezentatywnego zwierzęcia. Limfocyty najpierw bramkowano za pomocą rozproszenia do przodu (FSC) w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SSC), a następnie zidentyfikowano żywe limfocyty na podstawie SSC i populacji akwa-ujemnej. Limfocyty T zostały następnie zidentyfikowane przez ekspresję CD3. Określono również populacje CD4 + CD8- (limfocyty T CD4 +) i CD4 - CD8 + (limfocyty T CD8 +) w populacji limfocytów T CD3 +. Jak pokazano na rysunku 2, limfocyty T CD4 + i CD8 + zostały dalej rozróżnione na różne podzbiory na podstawie ekspresji CD28 i CD95 jako komórek naiwnych (Tn, CD28 + CD95-), pamięci centralnej (Tcm, CD28 + CD95 +) i pamięci efektorowej (Tem, CD28- CD95 +). Rysunek 2A pokazuje produkcję INF-γ i IL-2 w niestymulowanych i stymulowanych PMA / jonomycyną limfocytach T CD4 + i podzbiorach, a Figura 2B pokazuje produkcję INF-γ i IL-2 w niestymulowanych i stymulowanych PMA / jonomycyną limfocytach T CD8 + i podzbiorach Zwróć uwagę na odrębne profile cytokin wywołane stymulacją w każdym podzbiorze.
Rysunek 1. Strategia bramkowania stosowana do analizy składu PBMC metodą cytometrii przepływowej u makezów rezusów. Proszę kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku 1.
Rysunek 2. (A) Profil produkcji cytokin całkowitych limfocytów T CD4 + i podzbiorów. (B) Profil produkcji cytokin całkowitych limfocytów T CD8 + i podzbiorów. Proszę kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję rysunku 2a, lub tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku 2b.
