Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Podsumowanie

Biomasa roślinna jest głównym neutralnym węglowo zasobem odnawialnym, który może być wykorzystany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu ligniny polifenolowej.

Streszczenie

Potrzeba odnawialnych, neutralnych węglowo i zrównoważonych surowców dla przemysłu i społeczeństwa stała się jednym z najpilniejszych problemów XXI wieku. Odnawia to zainteresowanie wykorzystywaniem produktów roślinnych jako surowców przemysłowych do produkcji paliw ciekłych na potrzeby transportu¹i inne produkty, takie jak materiały biokompozytowe⁷. Biomasa roślinna pozostaje jednym z największych niewykorzystanych zasobów na planecie⁴. Składa się głównie z ścian komórkowych, które zbudowane są z bogatych w energię polimerów, w tym celulozy, różnych hemiceluloz (polisacharydów macierzy) oraz polifenolu zwanego ligniną⁶i dlatego czasami określa się je mianem lignocelulozy. Jednak ściany komórkowe roślin wyewoluowały tak, by być odpornymi na degradację, ponieważ nadają one wytrzymałość na rozciąganie komórkom i całym roślinom, chronią przed patogenami oraz umożliwiają transport wody przez całą roślinę; u drzew nawet do wysokości ponad 100 m nad poziomem gruntu. Ze względu na różnorodne funkcje ścian komórkowych, występuje ogromna różnorodność strukturalna w obrębie ścian różnych gatunków roślin oraz typów komórek w obrębie pojedynczej rośliny⁴. Zatem w zależności od tego, który gatunek rośliny uprawnej, odmiana lub tkanka roślinna jest wykorzystywana w biorefinerii, konieczne jest dostosowanie i optymalizacja etapów procesowych związanych z depolimeryzacją za pomocą procesów chemicznych lub enzymatycznych oraz kolejnej fermentacji różnych cukrów do ciekłych biopaliw. Ten fakt podkreśla konieczność dokładnej charakteryzacji surowców pochodzenia roślinnego. Opisujemy kompleksową metodologię analityczną umożliwiającą określenie składu ligninoksylozę i nadającą się do analizy średniej oraz wysokiej przepustowości. W tej pierwszej części skupiamy się na analizie polifenolu ligniny (Rycina 1). Metoda rozpoczyna się od przygotowania materiału ścian komórkowych pozbawionego skrobi. Otrzymane ligninoksylozę poddaje się następnie analizie w celu określenia zawartości ligniny metodą rozpuszczania acetylobromkowego³, a także składu ligniny pod względem jednostek syryngylowych, guajacylowych i p-hydroksyfenylowych⁵Protokół analizy węglowodanów w biomasy lignocelulozowej, w tym zawartości celulozy i składu polisacharydów macierzy, omówiono w Części II².

Protokół

1. Izolacja ściany komórkowej

1. Zmielić około 60-70mg suszu roślinnego (suszonego powietrzem lub liofilizowanego) za pomocą stalowych kulek o średnicy 5,5 mm w probówce Sarstedt z nakrętką o pojemności 2 ml, używając robota do mielenia i dozowania iWall (30 s). Alternatywna, nierobotyczna procedura o niskiej przepustowości z wykorzystaniem młyna kulowego (retschmill) została przedstawiona w części II².
2. Do odmierzonego zmielonego materiału dodać 1,5 ml 70% wodnego roztworu etanolu i dokładnie wymieszać na wortexie.
3. Wirować przy 10 000 rpm przez 10 min w celu osadzenia pozostałości nierozpuszczalnych w alkoholu.
4. Odssać lub odlać nadsącz.
5. Do osadu dodać 1,5 ml roztworu chloroformu/metanolu (1:1 v/v) i dokładnie wstrząsnąć probówką, aby resuspenderować osad.
6. Wirować przy 10 000 rpm przez 10 min, a następnie odessać lub odlać nadsącz.
7. Resuspenderować osad w 500 μl acetonu.
8. Odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35°C do całkowitego wyschnięcia.
   W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszej obróbki.
9. Aby rozpocząć usuwanie skrobi z próbki, resuspenderować osad w 1,5 ml 0,1 M buforu octanu sodu o pH 5,0.
10. Zakręcić probówki Sarstedt i ogrzewać przez 20 min w temperaturze 80°C w bloku grzejnym.
11. Schłodzić zawiesinę na lodzie.
12. Do osadu dodać następujące odczynniki: 35 μl 0,01% azotku sodu (NaN3), 35 μl amylazy (50 μg/mL H₂O; z gatunków Bacillus, Sigma) oraz 17 μl pullulanazy (17,8 jednostek z Bacillus acidopullulyticus; Sigma). Zakręcić probówkę i dokładnie wymieszać na wortexie.
13. Zawiesinę inkubować przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem. Położenie probówek poziomo ułatwia lepsze mieszanie.
14. Ogrzać zawiesinę w temperaturze 100°C przez 10 min w bloku grzejnym, aby przerwać proces trawienia.
15. Wirować (10 000 rpm, 10 min) i odrzucić nadsącz zawierający rozpuszczoną skrobię.
16. Pozostały osad przemyć trzykrotnie, dodając 1,5 ml wody, mieszając na wortexie, wirować i odlewając wodę płuczącą.
17. Resuspenderować osad w 500 μl acetonu.
18. Odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35°C do całkowitego wyschnięcia. W celu lepszego wysuszenia może być konieczne rozbicie materiału w probówce za pomocą szpatułki.
    Wysuszony materiał stanowi wyizolowaną ścianę komórkową (frakcję lignocelulozową). W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszej obróbki.

2. Zawartość ligniny

Metoda ta opiera się na opracowanej metodzie Fukushima i Hatfielda 3.

1. Odważyć 1 – 1,5 mg przygotowanego materiału ścian komórkowych (patrz pkt 1) do kolby miarowej o pojemności 2 ml, pozostawiając jedną probówkę pustą jako próbę jałową.
2. Opłukać ścianki probówki 250 μl acetonu, aby zebrać materiał ścian komórkowych na dnie probówki, a następnie bardzo delikatnie odparować aceton w strumieniu powietrza.
3. Delikatnie dodać 100 μl świeżo przygotowanego roztworu bromku acetylu (25% v/v bromku acetylu w lodowacym kwasie octowym), wlewając go po ściance probówki, aby zapobiec rozpryskiwaniu.
4. Zakręcić kolbę miarową i ogrzewać w temperaturze 50°C przez 2 h.
5. Ogrzewać przez dodatkową godzinę, mieszając w wortexie co 15 minut.
6. Schłodzić na lodzie do temperatury pokojowej.
7. Dodać 400 μl 2M wodorotlenku sodu oraz 70 μl świeżo przygotowanego 0,5 M chlorku hydroksyloaminy. Wymieszać kolby miarowe w wortexie.
8. Dopełnić kolbę miarową dokładnie do kreski 2,0 ml lodowacym kwasem octowym, zakręcić i kilkukrotnie odwrócić w celu wymieszania.
9. Pipetować 200 μl roztworu do specjalistycznej płytki 96-dołkowej do UV i odczytać w czytniku ELISA przy 280 nm.
10. Wyznaczyć procentową zawartość ligniny rozpuszczalnej w bromku acetylu (%ABSL), stosując odpowiedni współczynnik (Topola = 18,21; Trawy = 17,75; Arabidopsis = 15,69) według następującego wzoru:
    Obliczanie % ABSL:
    
    Pomnożenie wartości %ABSL przez 10 daje wynik w jednostkach ug/mg ścian komórkowych.
    
    W celu uśrednienia absorbancji (abs) zaleca się wykonanie co najmniej 3 odczytów z płytki, ponieważ cząstki stałe mogą powodować niewielkie różnice w wartościach absorbancji. Uwaga: 0,539 cm reprezentuje długość drogi optycznej, jednak w zależności od płytki parametr ten może wymagać wyznaczenia.

3. Skład ligniny

Metoda ta została opracowana na podstawie procedury opublikowanej niedawno przez Robinsona i Mansfielda⁵.

1. Przenieść około 2 mg materiału ściany komórkowej (patrz pkt 1.) do szklanej probówki z nakrętką do przeprowadzenia tioacidolizy.
2. Ostrożnie przygotować roztwór 2,5% trifluorku boru w eterze dietylowym (BF³) i 10% etanotiolu (EtSH). Należy użyć balonu wypełnionego azotem, aby zastąpić utraconą objętość w butelce z dioksanem azotem. Dioksan jest substancją bardzo niebezpieczną, nie należy wyjmować próbek ani sprzętu z dygestorium. Objętości potrzebne do przygotowania roztworu na jedną próbkę: 175 μl dioksanu; 20 μl EtSH; 5 μl BF³.
3. Do każdej próbki dodać 200 μl roztworu EtSH, BF³ i dioksanu.
4. Przepłukać przestrzeń nad próbką gazem azotowym i natychmiast zakręcić.
5. Ogrzewać w temperaturze 100°C przez 4 godziny, delikatnie mieszając co godzinę.
6. Zatrzymać reakcję poprzez chłodzenie na lodzie przez 5 minut.
7. Dodać 150 μl 0,4M wodorowęglanu sodu i wymieszać w wortexie.
8. W celu oczyszczenia dodać 1 ml wody i 0,5 ml octanu etylu, wymieszać w wortexie i odczekać do rozdzielenia się faz (octan etylu na górze, woda na dole).
9. Przenieść 150 μl warstwy octanu etylu do probówki Sarstedt o pojemności 2 ml. Należy upewnić się, że nie przeniesiono wody.
10. Odparować rozpuszczalnik za pomocą koncentratora z przepływem powietrza.
11. Dodać 200 μl acetonu i odparować (powtórzyć łącznie dwa razy, aby usunąć nadmiar wody).
12. W celu derywatyzacji TMS do każdej probówki dodać 500 μl octanu etylu, 20 μl pirydyny oraz 100 μl N,O-bis(trimetylosilylo)acetamidu.
13. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 25°C.
14. Przenieść 100 μl mieszaniny poreakcyjnej do fiolki GC/MS i dodać 100 μl acetonu.
15. Próbki analizować za pomocą GC wyposażonego w kwadrupolowy spektrometr mas lub detektor jonizacji płomieniowej. Zainstalowano kolumnę Agilent HP-5MS (30 mm X 0,25 mm X 0,25 μm grubości filmu). Stosuje się następujący gradient temperatury z 30-minutową zwłoką rozpuszczalnika i szybkością przepływu 1,1 ml/min: temperatura początkowa 130 °C przez 3 min; wzrost o 3 °C/min do 250 °C i utrzymanie tej temperatury przez 1 min; następnie powrót do temperatury początkowej 130 °C.
16. Piki identyfikuje się na podstawie względnych czasów retencji przy użyciu tetrakosanu jako standardu wewnętrznego (opcjonalnie) lub na podstawie charakterystycznych jonów widma masowego 299 m/z, 269 m/z i 239 m/z odpowiednio dla monomerów S, G i H (patrz rys. 2). Skład komponentów ligniny określa się ilościowo, przyjmując całkowitą powierzchnię pików za 100%.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład analizy ścian komórkowych przedstawiono na rysunku 2. W tym przypadku łodyga topoli (drewno) została poddana analizie zgodnie z różnymi procedurami opisanymi w sekcji protokołu. Przedstawiono przykładowy chromatogram rozdziału składników ligniny po tioacidolizie i derywatyzacji TMS. Wyraźnie można określić względną zawartość jednostek syringylowych (S), guajacylowych (G) oraz p-hydroksyfenolowych (H). Zawartość ligniny rozpuszczalnej w bromku acetylu jest oczywista; można oczekiwać wartości w przedziale 20-50% suchej masy ścian komórkowych. Należy zauważyć, że bromek acetylu nie rozpuszcza całej ligniny obecnej w ścianie komórkowej, a stopień solubilizacji może się różnić w zależności od materiału. Niemniej jednak metoda ta jest stosunkowo łatwa do przeprowadzenia, szybka i daje doskonałe przybliżenie zawartości ligniny w materiale lignocelulozowym.

Rysunek 1: Przegląd analiz lignocelulozowych. Ściany komórkowe (frakcje lignocelulozowe) są izolowane z surowego, wysuszonego materiału roślinnego. Materiał ścian jest następnie ważony w alikwotach i dzielony na części przeznaczone do różnych analiz. Materiał ścian poddaje się działaniu bromku acetylowego, a rozpuszczoną ligninę oznaczono metodą spektroskopii UV. W celu określenia składu ligniny materiał ścian poddaje się tioacidolizie. Rozpuszczone związki fenolowe podlegają derywatyzacji TMS, a następnie mogą zostać rozdzielone i ilościowo oznaczone za pomocą analizy GC-MS. Protokół określania składu polisacharydów macierzy oraz zawartości celulozy krystalicznej omówiono w Części II².

Rycina 2: Kompleksowa analiza lignocelulozowa drewna topoli. Wióry drewniane z topoli (Populus tremoloides) poddano opisanym protokołom.
Skład ligniny; H – jednostki p-hydroksyfenylowe; G – jednostki guaiacylowe; S – jednostki syringylowe.

Dyskusja

Opisane metody umożliwiają szybką ilościową ocenę zawartości oraz składu ligniny w lignocelulozowej biomasie roślinnej. Przy użyciu robota iWall dziennie można zmielić i rozdzielić około 350 próbek. Przepustowość poszczególnych metod analitycznych na jedną osobę jest zróżnicowana. Stosując opisane tutaj protokoły, dziennie można przetworzyć 30 próbek pod kątem zawartości ligniny oraz 15 pod kątem jej składu. Dzięki ilościowemu charakterowi danych można ocenić optymalne rośliny surowcowe, odmiany lub genotypy pod kątem ich przydatności do produkcji biopaliw.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wodorochlorek hydroksyloaminy	Sigma-Aldrich	255580
Bromek acetylu	Aldrich	135968
Etanotiol	Sigma-Aldrich	E3708
Dietylowy eter trifluororku boru	Fluka	15719
N,O-bis(trimetylosilil)acetamid	Fluka	15241
Dioksan	Sigma-Aldrich	296309
Spectromax Plus 384	Molecular Devices	Plus384
GC-MS	Agilent Technologies	6890 GC/5975B MSD	(skład ligniny)
Stalowe kulki 5.5mm	Salem Ball Company	(N/A)
Rozpraszacz ciepła do płytek 96-dołkowych	Biocision	Coolsink 96F
Blok grzejny	Techne	Dri-block DB-3D
Koncentrator próbek	Techne	FSC400D