Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Podsumowanie

Biomasa roślinna jest głównym neutralnym pod względem emisji dwutlenku węgla zasobem odnawialnym, który może być wykorzystany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, strukturalnie złożonego materiału kompozytowego określanego mianem lignoceluloz. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu ligniny polifenolowej.

Streszczenie

Zapotrzebowanie na odnawialne, neutralne pod względem emisji dwutlenku węgla i zrównoważone surowce dla przemysłu i społeczeństwa stało się jednym z najbardziej palących problemów XXI wieku. Spowodowało to ponowne zainteresowanie wykorzystaniem produktów roślinnych jako surowców przemysłowych do produkcji paliw płynnych^{do transportu1} oraz innych produktów, takich jak materiały biokompozytowe⁷. Biomasa roślinna pozostaje jednym z największych niewykorzystanych rezerw na planecie⁴. Składa się głównie ze ścian komórkowych, które składają się z polimerów bogatych w energię, w tym celulozy, różnych hemiceluloz (polisacharydy matrycy i polifenol lignina⁶, dlatego czasami nazywane są lignocelulozami. Jednak ściany komórkowe roślin ewoluowały, aby być oporne na degradację, ponieważ ściany zapewniają wytrzymałość na rozciąganie komórkom i całym roślinom, chronią przed patogenami i umożliwiają transport wody w całej roślinie; w przypadku drzew do wysokości powyżej 100 m n.p.m. Ze względu na różne funkcje ścian, w obrębie ścian występuje ogromna różnorodność strukturalna różnych gatunków roślin i typów komórek w obrębie jednej rośliny⁴. W związku z tym, w zależności od tego, jaki gatunek uprawy, odmiana roślin uprawnych lub tkanka roślinna jest używana w biorafinerii, etapy przetwarzania depolimeryzacji w procesach chemicznych/enzymatycznych, a następnie fermentacji różnych cukrów do płynnych biopaliw muszą być dostosowane i zoptymalizowane. Fakt ten uzasadnia potrzebę dokładnej charakterystyki surowców do produkcji biomasy roślinnej. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię analityczną, która umożliwia określenie składu lignocelulozowych i jest podatna na analizę średnio- i wysokoprzepustową. W pierwszej części skupimy się na analizie ligniny polifenolowej (ryc. 1). Metoda rozpoczyna się od przygotowania wykrochmalonego materiału ściany komórkowej. Otrzymane lignocelulozy są następnie dzielone w celu określenia zawartości ligniny przez rozpuszczanie acetylobromku³ oraz składu ligniny pod względem jednostek syringylowych, gwajakylowych i p-hydroksyfenylowych⁵. Protokół analizy węglowodanów w biomasie lignocelulozowej, w tym zawartość celulozy i skład polisacharydowy matrycy, omówiono w części^{II 2}.

Protokół

1. Izolacja ściany komórkowej

1. Zmiel około 60-70 mg liofilizowanego na powietrzu lub liofilizowanego materiału roślinnego za pomocą kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 5,5 mm w probówce z nakrętką Sarstedt o pojemności 2 ml za pomocą iWall, robota mielącego i dozującego (30 s). Alternatywna, niezrobotyzowana procedura o niskiej przepustowości z wykorzystaniem młyna kulowego (retschmill) została przedstawiona w części^{II 2}.
2. Do dozowanego zmielonego materiału dodać 1,5 ml 70% wodnego roztworu etanolu i dokładnie wymieszać.
3. Wirować z prędkością 10 000 obr./min przez 10 minut, aby osadzać pozostałość nierozpuszczalną w alkoholu.
4. Odessać lub zdekantować supernatant.
5. Dodać 1,5 ml roztworu chloroformu/metanolu (1:1 v/v) do pozostałości i dokładnie wstrząsnąć probówką w celu ponownego zawieszenia osadu.
6. Wirować z prędkością 10 000 obr./min przez 10 minut i zasysać lub dekantować supernatant.
7. Zawiesić osad w 500 μl acetonu.
8. Odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza o temperaturze 35°C do wyschnięcia.
   W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania.
9. Aby rozpocząć usuwanie skrobi z próbki, należy zawiesić osad w 1,5 ml 0,1 M buforu octanu sodu o pH 5,0.
10. Zakryj rurki Sarstedt i podgrzewaj przez 20 minut w temperaturze 80°C w bloku grzewczym.
11. Ostudzić zawiesinę na lodzie.
12. Do osadu dodać następujące środki: 35 μl 0,01% azydku sodu (NaN3), 35 μl amylazy (50 μg/ml_H2O; z gatunku Bacillus, Sigma); 17 μl pullulanazy (17,8 jednostki z Bacillus acidopullulyticus; Sigma). Zakręć rurkę i dokładnie wymieszaj.
13. Zawiesinę inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C w shakerze. Orientacja probówek w poziomie pomaga w lepszym mieszaniu.
14. Podgrzewaj zawiesinę w temperaturze 100°C przez 10 minut w bloku grzewczym, aby zakończyć trawienie.
15. Odwirować (10 000 obr./min, 10 min) i odrzucić supernatant zawierający rozpuszczoną skrobię.
16. Umyj pozostały granulat trzykrotnie, dodając 1,5 ml wody, wirując, odwirowując i dekantując wodę do mycia.
17. Zawiesić osad w 500 μl acetonu.
18. Odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza o temperaturze 35°C aż do wyschnięcia. Może być również konieczne rozdrobnienie materiału w tubie szpatułką w celu lepszego wysuszenia.
    Wysuszony materiał prezentuje izolowaną ścianę komórkową (lignocelulozy). W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania.

2. Zawartość ligniny

Ta metoda jest oparta na metodzie opisanej przez Fukushima i Hatfield 3.

1. Odważyć 1-1,5 mg przygotowanego materiału ściany komórkowej (patrz 1) do kolby miarowej o pojemności 2 ml, pozostawiając jedną probówkę pustą na ślepą próbę.
2. Przepłukać ścianki probówki 250 μl acetonu, aby zebrać materiał ściany komórkowej na dnie probówki i bardzo delikatnie odparować aceton pod wpływem powietrza.
3. Delikatnie dodaj 100 μl świeżo przygotowanego roztworu bromku acetylu (25% v/v bromku acetylu w lodowatym kwasie octowym) wzdłuż ścianek probówki, aby zapobiec rozpryskiwaniu.
4. Zakręć kolbę miarową i podgrzewaj w temperaturze 50°C przez 2 godziny
5. Podgrzewaj przez dodatkową godzinę z wirowaniem co 15 minut.
6. Schłodzić na lodzie do temperatury pokojowej.
7. Dodać 400 μl 2M wodorotlenku sodu i 70 μl świeżo przygotowanego 0,5 M chlorowodorku hydroksyloaminy. Kolby miarowe Vortex.
8. Napełnić kolbę miarową dokładnie do oznaczenia 2,0 ml lodowatym kwasem octowym, kilkakrotnie zakręcić i odwrócić w celu wymieszania.
9. Odpipetować 200 μl roztworu do 96-dołkowej płytki specyficznej dla promieniowania UV i odczytać w czytniku ELISA przy długości fali 280 nm.
10. 
    
    
    
    
    

Dyskusja

Opisane metody umożliwiają szybką ilościową ocenę zawartości ligniny i składu biomasy roślin lignocelulozowych. Za pomocą robota iWall można zmielić i dozować około 350 próbek dziennie. Wydajność różnych metod analitycznych na osobę jest różna. Korzystając z opisanych tutaj protokołów, można przetworzyć 30 próbek pod kątem zawartości ligniny i 15 próbek pod kątem składu ligniny dziennie. Ze względu na ilościowy charakter danych można ocenić optymalne uprawy furowe lub genotypy pod kątem ich przydatności do produkcji biopaliw.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorowodorek hydroksyloaminy	Sigma-Aldrich	255580
Bromek acetylu	Aldrich	135968
Etanotiol	Sigma-Aldrich	E3708
Eterynian dietylu borontrifluorku	Fluka	15719
N,O,-Bis(trimetylosililo)acetimidid	Fluka	15241
Dioksan	Sigma-Aldrich	296309
Spectromax Plus 384	Urządzenia molekularne	Plus384
GC-MS	Agilent Technologies	6890 GC / 5975B MSD	(kompozycja ligniny)
Kulki ze stali nierdzewnej 5,5 mm	Salem Ball Company	(Nie dotyczy / A)
96-dołkowy rozdzielacz ciepła	płytowego Biocision	Coolsink 96F
Blok grzewczy	Techne	Dri-block DB-3D
Koncentrator próbek	Techne	FSC400D