Aspiracja tkanki tłuszczowej z poduszeczki tłuszczowej jest preferowaną, małoinwazyjną i niskokosztową metodą wykrywania amyloidu w diagnostyce amyloidozy systemowej w porównaniu z innymi technikami. Niniejszy artykuł wideo przedstawia schemat procedury wykonywania aspiracji tkanki tłuszczowej wraz z odpowiednim przygotowaniem preparatu w celu uzyskania optymalnego wyniku diagnostycznego.
Artykuł metodologiczny
Wykonanie i przetwarzanie cienkoigłowej aspiracji (FNA) przedniej poduszki tłuszczowej w kierunku amyloidozy
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Historycznie w celu wykazania złogów amyloidu w amyloidozie wykonywano biopsje serca, wątroby i nerek. Ponieważ obraz kliniczny tej choroby jest bardzo zmienny i nieswoisty, ryzyko związane z tymi biopsjami jest zbyt duże w stosunku do uzyskanej wartości diagnostycznej. Inne miejsca o niższym ryzyku biopsji, takie jak skóra czy dziąsła, są również stosunkowo inwazyjne i kosztowne. Ponadto w tych biopsjach nie zawsze występuje wystarczająca ilość złogów amyloidu, aby postawić diagnozę. Aspiracja tkanki tłuszczowej z podbródka wykazała dobrą korelację kliniczną przy niskich kosztach i minimalnej zachorowalności. Brakuje jednak zestandaryzowanych protokołów wykonywania tej procedury lub opracowywania aspiratu, co prowadzi do zmiennych i niepowtarzalnych wyników. Najczęściej stosowaną metodą wykrywania amyloidu w tkankach jest obserwacja jabłkowozielonego dwójłomności w przekrojach barwionych czerwienią Kongo przy użyciu mikroskopu polaryzacyjnego. Technika ta wymaga przygotowania bloku komórkowego z materiału aspiracyjnego. Niestety u pacjentów we wczesnym stadium amyloidozy występuje minimalna ilość amyloidu, co znacznie zmniejsza czułość barwienia czerwienią Kongo w przekrojach bloków komórkowych z aspiratów tkanki tłuszczowej. Dlatego też należy stosować ocenę ultrastrukturalną aspiratów tkanki tłuszczowej za pomocą mikroskopii elektronowej, ze względu na jej zwiększoną czułość w wykrywaniu amyloidu. Niniejszy artykuł przedstawia prostą i powtarzalną procedurę wykonywania aspiracji przedniej tkanki tłuszczowej w celu wykrycia amyloidu, z wykorzystaniem zarówno barwienia czerwienią Kongo przekrojów bloków komórkowych, jak i mikroskopii elektronowej do identyfikacji ultrastrukturalnej.
Protokół
Wstęp
Amyloidoza systemiczna jest chorobą o bardzo zróżnicowanym przebiegu, polegającą na pozakomórkowym odkładaniu się różnych białek, które zbiorczo określa się mianem amyloidu. Odkładanie się tych włókien amyloidu o strukturze harmonijki beta prowadzi do różnych objawów klinicznych, w zależności od zajętych narządów. Najistotniejsze klinicznie manifestacje amyloidozy systemicznej obserwuje się w przypadku zajęcia narządów krytycznych, takich jak serce, wątroba i/lub nerki. Historycznie w celu wykazania obecności amyloidu pobierano biopsje z tych narządów. Te umiarkowanie inwazyjne procedury wiązały się ze znacznym ryzykiem, w tym krwotokiem. Wykazano, że aspiracja z tkanki tłuszczowej stanowi wiarygodną i nieinwazyjną metodę wykrywania amyloidu w amyloidozie systemicznej 1. Procedura ta jest w zasadzie porównywalna z liposukcją tkanki tłuszczowej podskórnej w przedniej ścianie brzucha w znieczuleniu miejscowym w celu pobrania tkanki włóknisto-tłuszczowej do oceny niewielkich złogów amyloidu w ścianach małych naczyń krwionośnych 2.
Najczęściej stosowaną metodą identyfikacji amyloidu w tkankach pozostaje charakterystyczny obraz dwójłomności w kolorze jabłkowo-zielonym, widoczny podczas obrazowania preparatów barwionych czerwienią Kongo pod mikroskopem światła spolaryzowanego 3. W przypadku wykonania aspiracji z poduszeczki tłuszczowej, barwienie czerwienią Kongo można przeprowadzić zarówno na bezpośrednich preparatach rozmazowych, jak i na blokach komórkowych z aspiratu tkanki tłuszczowej. Jednakże u pacjentów we wczesnych stadiach amyloidozy złogi amyloidu są skąpe, co znacznie obniża czułość badania sekcji bloków komórkowych barwionych czerwienią Kongo 4,5. Ocena ultrastrukturalna aspiratów z poduszeczki tłuszczowej za pomocą mikroskopii elektronowej charakteryzuje się lepszą powtarzalnością i zwiększoną czułością 4. Dlatego zaleca się przekazywanie wszystkich aspiratów z poduszeczki tłuszczowej zarówno do przygotowania bloku komórkowego, jak i do wykonania mikroskopii elektronowej 2.
Aspiracja tkanki tłuszczowej jest stosunkowo niskokosztową i nieinwazyjną metodą pozyskiwania tkanki w celu diagnostyki systemowej amyloidozy. Niniejszy artykuł opisuje procedurę aspiracji tkanki tłuszczowej wraz ze szczegółami dotyczącymi przygotowania próbek do barwienia czerwienią Kongo oraz oceny ultrastrukturalnej za pomocą mikroskopii elektronowej. W tym filmie prezentujemy tę powtarzalną i prostą procedurę pozyskiwania optymalnego materiału diagnostycznego.
1. Wykonanie FNA z przedniego poduszki tłuszczowej
A. Znieczulenie miejscowe (Rycina 1 i 2)
- Używając gazików nasączonych alkoholem lub preferowanego przez daną placówkę środka do oczyszczania skóry, oczyść skórę w dolnej ćwiartce brzucha, bocznie od linii środkowej i poniżej pępka (Rycina 1).
- Za pomocą pisaka zaznacz obszar w kształcie rombu o wymiarach około 2 x 2 cale, jak pokazano na Rycini 1.
- Naciągnij około 10 mL 1% lidokainy za pomocą igły 18G. Do strzykawki przymocuj igłę 25G o długości 1 ½ cala. Usuń uwięzione powietrze, opukując pionowo ustawioną strzykawkę i naciskając tłok, aż wypłynie płyn i nie będzie widocznych pęcherzyków powietrza.
- Znieczul obszar wzdłuż krawędzi wcześniej zaznaczonego rombu, jak pokazano na Rycini 2. Rozpocznij od wprowadzenia igły 25G tuż pod skórę w punkcie A i ostrożnie przesuń igłę podskórnie do punktu X. Cofnij tłok strzykawki, aby upewnić się, że igła nie znajduje się w naczyniu. Następnie powoli naciskaj tłok, aby wprowadzić do 2.5 mL lidokainy (około ¼ zawartości strzykawki 10 mL), wycofując jednocześnie igłę do punktu A, tak aby nie wyszła ona ze skóry w punkcie A (Rycina 2a3). Trzymając igłę nadal pod skórą, zmień kierunek w stronę punktu Y (Rycina 2a4) i przesuń igłę podskórnie do punktu Y (Rycina 2b1). Podobnie jak wcześniej, potwierdź, że igła nie znajduje się w naczyniu i podaj około 2.5 mL lidokainy, powoli wycofując igłę przez punkt A (Rycina 2b3 do 2b4). Powtórz analogiczne kroki, zaczynając od punktu B i podając lidokainę podskórnie od punktu B do X oraz od B do Y (Rycina 2c1 do 2d4). Zapobiegnij krwawieniu z miejsc nakłuć A i B, mocno dociskając sterylną gazę.
- Można teraz sprawdzić, czy obszar został znieczulony, lekko dotykając skóry w obrębie znieczulonego rombu rogiem kawałka gazy bawełnianej i porównując odczucia z sąsiednim, niezniezczulonym obszarem skóry.
B. Wykonywanie aspiracji z poduszki tłuszczowej (Rysunek 3)
(Zastosowanie znieczulenia miejscowego przed wykonaniem aspiracji poduszki tłuszczowej można pominąć, w zależności od preferencji regionalnych i indywidualnych. Prawidłowo wykonaną procedurę FNAB w celu aspiracji przedniej poduszki tłuszczowej można zakończyć jednym nakłuciem. Jednak w zależności od progu bólu poszczególnych pacjentów, przesuwanie igły 18G w przód i w tył w podskórnej tkance tłuszczowej jest stosunkowo uciążliwe. Opisana tutaj metoda znieczulenia pozwala osiągnąć efekt za pomocą zaledwie dwóch nakłuć igłą 25G i zapobiega bólowi, poprawiając tolerancję zabiegu.)
- Załóż igłę 18G o długości 1 ½ cala na strzykawkę 10 mL. Zamocuj zestaw strzykawka-igła w uchwycie do strzykawki („uchwyt/pistolet FNAB”), aby zapewnić prawidłowe aplikowanie i zwalnianie próżni.
- Wprowadź końcówkę igły w tkankę tłuszczową podskórną w oczyszczonym i znieczulonym obszarze mięśnia równoległobocznego (rycina 3a).
- Przy wprowadzonej w tkankę podskórną igle całkowicie odciągnij tłok strzykawki, aby wytworzyć próżnię (rycina 3b).
- Utrzymując próżnię, przesuwaj igłę w przód i w tył w różnych kierunkach w obrębie tkanki tłuszczowej podskórnej (ryciny od 3c do 3i). Każdy ruch powinien być tak długi, jak pozwala na to długość wybranej igły, bez doprowadzenia do jej wysunięcia poza skórę. Maksymalną ilość materiału pobiera się poprzez zmianę kierunku przy każdym ruchu (rycina 3i). Ważne jest, aby kierunek igły był styczny do otrzewnej i równoległy do powierzchni skóry, aby uniknąć przebicia jamy otrzewnej.
- Tkanka włóknisto-tłuszczowa gromadzi się w strzykawce. Po pobraniu wystarczającej ilości fragmentów tkanki włóknisto-tłuszczowej (do 1 mL próbki w postaci fragmentów zmieszanych z krwią), całkowicie zwolnij próżnię i wyjmij igłę (rycina 3k).
- Poproś pacjenta lub asystenta o mocny ucisk miejsca zabiegu za pomocą gazika, aby zapobiec wynaczynianiu krwi.
2. Przetwarzanie próbek
- Umieść co najmniej 5-6 fragmentów tkanki włóknisto-tłuszczowej w roztworze glutaraldehydu do badania w mikroskopii elektronowej (Rysunek 4B).
- W zależności od protokołu instytucjonalnego, z fragmentów tkanki włóknisto-tłuszczowej można przygotować kilka rozmazów poprzez ich rozcieranie między dwoma szkiełkami przedmiotowymi (Rysunek 4A).
- Pozostaw pozostały materiał w strzykawce do czasu skrzepnięcia (może to zająć od 5 do 7 minut, w zależności od czasu krzepnięcia) (Rysunek 4C).
- Naciągnij do strzykawki 10% formalinę tak, aby skrzepnięty materiał tkanki włóknisto-tłuszczowej oddzielił się od ścianki strzykawki i swobodnie pływał (Rysunek 4C2). Wyjmij tłok ze strzykawki (Rysunek 4C3) i przenieś skrzep tkanki włóknisto-tłuszczowej do pojemnika z 10% formaliną, wysuwając go przez otwarty koniec strzykawki przeciwległy do końcówki (Rysunek 4C4).
- Odpowiednio opisz pojemniki i przekaż próbki w glutaraldehydzie do mikroskopii elektronowej oraz w formalinie do przygotowania skrawków barwionych H & E oraz czerwoną kongą w celu oceny w mikroskopii spolaryzowanej. Jeśli przygotowano rozmazy, mogą one zostać przetworzone zgodnie z protokołem danej jednostki laboratoryjnej.
Rycina 1. Obszar poddawany znieczuleniu w celu wykonania FNAB przedniego płata tłuszczowego.
Rysunek 2. Znieczulenie miejscowe.
Rycina 3. Wykonywanie FNAB z przedniego poduszki tłuszczowej.
Rysunek 4. Obróbka aspiratu z przedniego poduszki tłuszczowej przeznaczonego do badania laboratoryjnego w celu wykrycia złogów amyloidu.
3. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 5. Amyloid w ścianie małych naczyń krwionośnych w fragmentach tkanki włóknisto-tłuszczowej. Tkankę włóknisto-tłuszczową utrwalono w formalinie, zatopiono w parafinie, zabarwiono czerwoną czerwienią i zbadano za pomocą mikroskopii w świetle spolaryzowanym. Amyloid w ścianie małych naczyń krwionośnych wykazuje jabłkowozieloną dwójłomność (biała strzałka).
Rycina 6. Tkanka bez amyloidozy. W tkankach innego pacjenta bez amyloidozy nie występuje jabłkowo-zielone dwójłomienie. Niebieskie dwójłomienie (biała strzałka) włókien kolagenowych jest zazwyczaj obecne w prawie wszystkich preparatach.
Rycina 7. Włókna odpowiadające amyloidowi w ścianie naczynia krwionośnego. Mikrograf elektronowy prostych, nierozgałęzionych, losowo rozproszonych włókien o średnicy 8-10 nm utworzonych przez amyloid w ścianie naczynia krwionośnego.
Dyskusja
Rozpoznanie amyloidozy zazwyczaj stawia się na podstawie biopsji tkankowej dotkniętych narządów, takich jak nerki, wątroba i/lub serce. Podejście to charakteryzuje się wysoką wartością diagnostyczną, jest jednak inwazyjne i może wiązać się z powikłaniami, w tym z krwawieniem 2. W latach 60. XX wieku preferowano biopsje odbytnicy, dziąseł i szpiku kostnego jako podejścia stosunkowo mniej inwazyjne 6,7,8. W 1973 roku opisano aspirację tkanki tłuszczowej z okolic brzucha jako bezpieczną, małoinwazyjną, prostą i tańszą procedurę diagnostyki tkankowej układowej amyloidozy 1. Jednak szczegóły procedury oraz podejście do przetwarzania pobranego materiału nie zostały opisane w sposób spójny. Niniejszy film oraz artykuł opisują tę procedurę krok po kroku.
Podejście do wykrywania amyloidy w aspiracie z tkanki tłuszczowej również nie jest w pełni zestandaryzowane, a nieliczne badania porównują i oceniają różne metody 1,5,6,7,8. Ocena aspiratów z przedniego podkładu tłuszczowego przy użyciu barwienia czerwienią Kongo jest mniej czuła i charakteryzuje się niższą powtarzalnością międzyobserwatorową, szczególnie we wczesnych przypadkach amyloidozy ze skąpymi złogami amyloidy 5. Doniesiono, że immunohistochemia wykonywana na przekrojach bloków komórkowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie oraz fluorescencyjne barwienie czerwienią Kongo na rozmazach cytologicznych poprawiają czułość diagnostyczną 9,10. Mikroskopia elektronowa usprawnia wykrywanie i identyfikację skąpych włókien amyloidy w ścianach małych naczyń krwionośnych w tkance włóknisto-tłuszczowej w aspiratach z podkładu tłuszczowego 4, 5. W oparciu o te informacje artykuł ten opisuje proces przygotowania preparatu w celu wytworzenia bloków komórkowych (do oceny przekrojów bloków komórkowych barwionych czerwienią Kongo pod mikroskopem polaryzacyjnym w celu stwierdzenia diagnostycznego jabłkowozielonego dwójłomowania oraz do immunohistochemii, jeśli jest to wskazane) oraz do mikroskopii elektronowej. Jednak w zależności od wybranej metody oceny materiału pod kątem obecności amyloidy, może on zostać poddany przygotowaniu rozmazu cytologicznego, przygotowaniu bloku komórkowego oraz procesowaniu do mikroskopii elektronowej. Niektóre laboratoria wykonują testy na rozmazach przygotowanych z aspiratowych fragmentów tkanki włóknisto-tłuszczowej i barwionych czerwienią Kongo w celu badania fluorescencji 10.
Zazwyczaj w późnej fazie amyloidozy mikroskopia świetlna z wykorzystaniem mikroskopii polaryzacyjnej z czerwienią Kongo może być wystarczająca; jednak we wczesnych stadiach choroby barwienie czerwienią Kongo z mikroskopią polaryzacyjną na sekcjach bloków komórkowych jest mniej czułe i wiarygodne w przypadku aspiratów z poduszeczki tłuszczowej 4,5,11. Inne barwienia specjalne, w tym tioflawiną T, mogą być stosowane z podobnymi ograniczeniami. Inne podejścia do wykrywania amyloidu obejmują ocenę rozmazów z aspiratu pod kątem obecności amyloidu przy użyciu mikroskopii polaryzacyjnej z czerwienią Kongo oraz fluorescencji 10. W naszym doświadczeniu metoda ta jest mniej powtarzalna. Ocena naczyń krwionośnych w poduszeczce tłuszczowej pod kątem obecności amyloidu za pomocą mikroskopii elektronowej pozwala przezwyciężyć te ograniczenia 4,11. Dalsza charakterystyka amyloidu była raportowana przy użyciu immunomikroskopii elektronowej 12; jednak metody te mogą nie być powszechnie dostępne w ośrodkach opieki pozatertiaryjnej.
Igły stosowane do zabiegów aspiracji można sklasyfikować według ich rozmiaru (gauge) na cienkie (21-25G), średnie (18-20G) oraz grube (np. 14G) 11. Doniesiono, że aspiracje z przedniej poduszeczki tłuszczowej wykonywano przy użyciu igieł o różnych rozmiarach, od średnich (18 do 20G) po cienkie (21 do 22G) 2,10. Większość zmian guzowatych aspiruje się igłami o mniejszym rozmiarze (np. 25G) w celu uzyskania dobrych rozmazów cytologicznych, wykonując dodatkowe wkłucia igłą o większym rozmiarze (np. 18G) w celu pobrania dodatkowego materiału do bloków komórkowych.
Podczas aspiracji przedniego pęczka tkanki tłuszczowej spójna tkanka włóknisto-tłuszczowa nie daje się łatwo aspirować przy użyciu cieńszych igieł. Przygotowanie bloku komórkowego i mikroskopia elektronowa są istotne dla oceny ścian małych naczyń krwionośnych w fragmentach tkanki włóknisto-tłuszczowej w aspiratach tłuszczowych. W celu uzyskania diagnostycznie odpowiedniego materiału zaleca się stosowanie igieł o większej średnicy (np. 18G) 2,10. Ponieważ procedura ta jest porównywalna do konwencjonalnej cienkoigłowej aspiracji biopsyjnej (FNAB), aspirację pęczka tkanki tłuszczowej określa się mianem FNAB, mimo że do jej wykonania mogą być używane igły o większej średnicy 5.
Oświadczenia
Brak konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy pani Bonnie Phetteplace, RN, za pomoc podczas nagrywania demonstracji procedury FNAB.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Gaziki z alkoholem | |||
| gaziki | |||
| marker do znakowania | |||
| strzykawki 10 mL x2 | |||
| 1% lidokaina | znieczulenie miejscowe – jeśli lidokaina jest stosowana samodzielnie, po podaniu powoduje początkowe uczucie pieczenia. Można tego uniknąć, stosując mieszaninę 1% lidokainy i 1% wodorowęglanu sodu w stosunku 1:1 | ||
| igły 18 gauge(G) 1 ½ cala x2 (do wykonywania FNAB) | |||
| igła 25G 1 ½ cala | do wstrzykiwania znieczulenia miejscowego | ||
| uchwyt do strzykawki do FNA ("pistolet") | |||
| opatrunek | |||
| fiolka z glutaraldehydem | do mikroskopii elektronowej | ||
| pojemnik na biopsję z 10% formaliną |
Bibliografia
- Westermark, P., Stenkvist, B. A new method for the diagnosis of systemic amyloidosis. Arch Intern Med. 132, 522-523 (1973).
- Devata, S., Hari, P., Markelova, N., Li, R., Shidham, V. B. Detecting AL Amyloid in Abdominal fat pad aspirates: Is Congo red sufficient? Amyloid. , Forthcoming Forthcoming.
- Merlini, G., Bellotti, V. Molecular Mechanisms of Amyloidosis. New Engl J Med. 349 (6), 583-596 (2003).
- Shidham, V. B., Kumar, N., Cihlar, K., Varsegi, G., Markelova, N., Li, R., Hari, P. Fine needle aspiration of abdominal fat pad for diagnosis of early amyloidosis: How can the clinical role of the test be improved? Mod Pathol. 20, Suppl ement 2. 1A-380A (2007).
- Halloush, R., Lavrovskaya, E., Mody, D., Lager, D., Truong, L. D. Diagnosis and typing of systemic amyloidosis: The role of abdominal fat pad fine needle aspiration. Cytojournal. 6, 24-24 (2010).
- Hazenberg, I. I., Rijswijk, C. V. an, H, M. Diagnostic Accuracy of Subcutaneous Abdominal Fat Tissue Aspiration for Detecting Systemic Amyloidosis and Its Utility in Clinical Practice. Arthritis Rheum. , 54-546 (2006).
- Guy, C. D., Jones, C. K. Abdominal fat pad aspiration biopsy for tissue confirmation of systemic amyloidosis: specificity, positive predictive value, and diagnostic pitfalls. Diagn Cytopathol. 24, 181-185 (2001).
- Westermark, P. Diagnosing Amyloidosis. Scand J Rheumatol Suppl. 24, 327-329 (1995).
- Linke, R. P. Highly Sensitive Diagnosis of Amyloid and Various Amyloid Syndromes Using Congo Red Fluorescence. Virchow Arch. 436, 439-448 (2000).
- Giorgadze, T. A., Shiina, N., Baloch, Z. W., Tomaszewski, J. E., Gupta, P. K. Improved detection of amyloid in fat pad aspiration: an evaluation of Congo red stain by fluorescent microscopy. Diagn Cytopathol. 31, 300-306 (2004).
- DeMay, R. M. Fine Needle Aspiration Biopsy. The Art & Science of Cytopathology. , ASCP Press, American Society of Clinical Pathology. Chicago. 465-46 (1996).
- Arbustini, E., Vrga, L., Concardi, M., Pallandini, G., Obici, L., Merlini, G. Electron and Immuno-electron Microscopy of Abdominal Fat Identifies and Characterizes Amyloid Fibrils in Suspected Cardiac Amyloidosis. Amyloid. 9, 108-114 (2002).
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid
Posted by JoVE Editors on 12/20/2010. Citeable Link.
A correction was made to Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Safwan S. Jaradeh
instead of:
Safwan S. Jardeh
