Przygotowanie preparatów zgniatanych wieloniciowych chromosomów Drosophila do znakowania przeciwciałami

Podsumowanie

Niniejszy protokół wideo przedstawia technikę zgniatania stosowaną w laboratorium Johansena w celu przygotowania politenicznych chromosomów Drosophila do znakowania przeciwciałami.

Streszczenie

Muszka owocówka (*Drosophila*) od dawna jest preferowanym systemem modelowym do badania zależności między strukturą chromatyny a regulacją genów ze względu na zalety cytologiczne wynikające z obecności olbrzymich chromosomów politenicznych w gruczołach ślinowych larw trzeciego stadium. W tej tkance chromosomy przechodzą wiele rund replikacji bez podziałów komórkowych, co prowadzi do powstania około 1000 kopii. DNA pozostaje wyrównane po każdym cyklu replikacyjnym, co skutkuje znacznikowym powiększeniem chromosomów, dając unikalną możliwość skorelowania morfologii chromatyny z lokalizacją specyficznych białek. W konsekwencji pojawiło się duże zainteresowanie określaniem modyfikacji epigenetycznych występujących w różnych genach oraz na różnych etapach procesu transkrypcji. Ważnym narzędziem w tego typu badaniach jest znakowanie chromosomów politenicznych przeciwciałami przeciwko interesującemu badacza enzymowi, czynnikowi transkrypcyjnemu lub modyfikacji histonów. Niniejszy protokół wideo przedstawia technikę rozgniatania (squash) stosowaną w laboratorium Johansena w celu przygotowania chromosomów politenicznych *Drosophila* do znakowania przeciwciałami.

Protokół

Poniższy protokół przygotowania preparatu do zgniatania chromosomów politenicznych został dostosowany z procedury opisanej przez Johansen et al. (2009).

1. Hodowla larw Drosophila trzeciego stadium

Aby uzyskać optymalne chromosomy politeniczne do wysokiej jakości preparatów z dyni, niezbędne są warunki hodowli zapobiegające przeludnieniu (np. umieszczenie około 20 składających jaja samic w standardowej butelce do much o średnicy 4" i przenoszenie ich do nowej butelki każdego dnia). Należy wybrać najgrubsze osobniki z pierwszej partii wspinających się larw trzeciego stadium, gdy znajdują się one jeszcze w fazie wędrówki, ale tuż przed przepociwieniem. Rutynowo prowadzimy hodowlę w temperaturze 21°C, jednak temperatura 18°C pozwala uzyskać grubsze chromosomy, które mogą być bardziej odpowiednie do niektórych zastosowań, na przykład gdy wymagana jest wizualizacja obszarów prążkowych i międzyprążkowych w wysokiej rozdzielczości.

2. Materiały do preparowania zgniotów chromosomów politenicznych

• Pincety sekcyjne Drummonda (2)
• Szalki Petriego (60 x 15 mm)
• Matowe szkiełka przedmiotowe (Fisher No. 12-544-3) (powlekane poli-lizyną)
• Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm No. 15 (Fisher No. 12-520B) (powlekane Sigmacote; Sigma #SL2)
• Szkiełka nakrywkowe 22 x 40 mm No. 15 (Fisher No. 12-530B)
• Chusteczki Kim-wipes
• Mikroskop kontrastowy z obiektywem 20X
• Mały naczynie Dewar (np. kolba próżniowa lub termos)
• Długa pinceta
• Żyletki
• Słoik Coplina
• Taca Rubber-Maid lub Tupperware (lub równoważna taca z możliwością uszczelnienia)
• Parafilm (pocięty w kwadraty 22 mm)
• Obciążniki 175 g

3. Fiksatywy i roztwory

1. Roztwór zapasowy formaldehydu 5X. Przygotować świeży roztwór, rozpuszczając 0,74 g paraformaldehydu w 4,0 ml dH₂O z dodatkiem 28 μl 1N KOH. Podgrzać do 65°C w celu rozpuszczenia paraformaldehydu, a następnie przechowywać w lodzie.
2. Fiksatyw 1. Przygotować świeży roztwór, mieszając 0,5 ml 10X PBS, 50μl Triton X-100, 3,45 ml dH₂O oraz 1,0 ml roztworu zapasowego formaldehydu 5X. Podgrzać w celu rozproszenia Triton X-100 i zużyć w ciągu 1 godziny.
3. Fiksatyw 2. Przygotować świeży roztwór, mieszając 1,5 ml dH₂O, 2,5 ml octu lodowatego oraz 1,0 ml roztworu zapasowego formaldehydu 5X i zużyć w ciągu 1 godziny.
4. Roztwór kwasu laktooctowego. Przygotować roztwór składający się z 1 ml kwasu mlekowego, 2 ml dH₂O i 3 ml kwasu octowego.

4. Przygotowanie preparatu zgniotu chromosomów politenicznych:

1. Przepłukać larwy wodą i przenieść do PBS w naczyniu do hodowli tkanek w celu przeprowadzenia sekcji.
2. Chwycić końcówkę haczyków gębowych jedną pęsetą, przytrzymać ciało w około 2/3 długości drugą pęsetą i pociągnąć za haczyki gębowe, aby odsłonić gruczoły ślinowe. Oddzielić gruczoły ślinowe od mózgu i tarczek oko-antenalnych, a następnie usunąć ciało tłuszczowe oraz wszelkie inne tkanki towarzyszące gruczołom.
3. Dodać 200 µl Fixative 1 do pierwszej studni dwustudziennego szkiełka zagłębnikowego oraz 200-300 µl Fixative 2 do studni drugiej. Przenosić po jednej parze gruczołów ślinowych do Fixative 1 w pierwszej studni i inkubować przez czas wymagany dla danego epitopu, zazwyczaj około 1-2 minut. (Uwaga: niektóre epitopy, np. w przypadku większości modyfikacji histonów, mogą wymagać fiksacji przez 5 minut lub dłużej).
4. Za pomocą pęsety przenieść gruczoły ślinowe do Fixative 2 w studni 2 i inkubować przez dwie minuty.
5. Przenieść gruczoły do 10-30 μl roztworu kwasu laktooctowego na czystym szkiełku podstawowym Sigmacoted. Ostrożnie opuścić pokrywkę mikroskopową powleczoną polilizyną na szkiełko podstawowe i, nie wywierając nacisku pionowego, podnieść szkiełko tak, aby gruczoły znalazły się pomiędzy szkiełkiem a pokrywką. Natychmiast ułatwić lizę komórek i rozprzestrzenianie się chromosomów, ostrożnie chwytając krawędź pokrywki pęsetą i delikatnie przesuwając ją w przód i w tył, starając się zminimalizować nacisk pionowy na tkankę. Alternatywnie można użyć gumki z ołówka lub nawet opuszka palca, aby delikatnie przesuwać pokrywkę w przód i w tył. Należy pamiętać, że każda zwłoka w przesuwaniu pokrywki prawdopodobnie zmniejszy stopień rozprzestrzenienia ramion chromosomowych, ponieważ mają one tendencję do sztywnienia po wystawieniu na działanie roztworu kwasu laktooctowego. Zmętnienie roztworu jest często dobrym wskaźnikiem separacji komórek. Kilkukrotne delikatne opukanie pokrywki pod kątem (aby uniknąć nacisku pionowego) gumką z ołówka może również wspomóc rozprzestrzenianie się chromosomów.
6. Natychmiast zbadać tkankę pod mikroskopem fazowo-kontrastowym z obiektywem 20x lub 40x, aby ocenić, czy chromosomy są dobrze rozprzestrzenione.
7. Gdy rozprzestrzenienie chromosomów będzie wystarczające, położyć szkiełko stroną z pokrywką do dołu na stosie czystych chusteczek Kim-wipes. Położyć na wierzchu drugą chusteczkę Kim-wipe i spłaszczyć chromosomy, kładąc kciuk w miejscu, gdzie znajduje się pokrywka i mocno dociskając, unikając jakiegokolwiek poziomego ruchu pokrywki, który mógłby uszkodzić chromosomy.
8. Ponownie zbadać szkiełko pod mikroskopem, aby ustalić, czy preparat nadaje się do zamierzonego celu. Jeśli chromosomy znacznie przesunęły się podczas zgniatania, w kolejnych preparatach należy użyć mniejszej objętości roztworu kwasu laktooctowego. Powtarzać kroki 4.1-4.8 do momentu uzyskania odpowiedniej liczby właściwych szkiełek. Na pokrywki szkiełek położyć obciążniki o masie 175 g.
9. Napełnić mały naczynie Dewar (np. termos) ciekłym azotem. Używając długiej pęsety, zanurzyć szkiełko w ciekłym N₂ aż do ustania wrzenia, wyjąć szkiełko i natychmiast użyć krawędzi czystego ostrza brzytwy w jednym rogu, aby odłupać pokrywkę. Jeśli szkiełko ma być użyte natychmiast, umieścić je w naczyniu Coplin z PBS w temperaturze 4°C. W przeciwnym razie zebrać szkiełko do naczynia Coplin wypełnionego 95% etanolem. Zbadać pokrywkę po odparowaniu szronu, aby potwierdzić, że tkanka przylgnęła do szkiełka i nie pozostała na pokrywce. Powtórzyć czynność z pozostałymi szkiełkami, aż wszystkie zostaną przechowywane w PBS (do użycia w ciągu kilku godzin) lub etanolu (do dłuższego przechowywania).

Reprezentatywne wyniki

Pierwszym krytycznym krokiem w celu uzyskania wysokiej jakości preparatu zgniotu chromosomów politenicznych jest hodowla tucznych larw z dużymi jądrami komórkami gruczołów ślinowych. Drugim jest opanowanie techniki rozprzestrzeniania, która może wymagać pewnej praktyki. Jedną z wskazówek pozwalających zwiększyć skuteczność rozprzestrzeniania jest ustalenie minimalnej objętości roztworu kwasu laktooctowego podczas etapu zgniotu. Sprzyja to odpowiedniemu rozprzestrzenieniu się chromosomów, nie generując jednocześnie nadmiernych sił przepływu, które mogłyby wypłukać ramiona chromosomów. Warto również zauważyć, że każda zwłoka w przesuwaniu szkiełka nakrywkowego w przód i w tył zmniejszy rozprzestrzenianie się ramion chromosomowych, ponieważ stają się one sztywniejsze po wystawieniu na działanie roztworu kwasu laktooctowego.

Jeśli wszystko przebiegnie pomyślnie, powinno powstać wiele dobrze rozprzestrzenionych chromosomów politenicznych. Rysunek 1 przedstawia przykład takiego preparatu, poddanego podwójnemu znakowaniu markerem dla regionów międzyprążkowych w kolorze zielonym oraz barwnikiem barwiącym regiony prążkowane na niebiesko. W przypadku niewystarczającego rozprzestrzenienia chromosomy będą wyglądać jak małe kuleczki, co przedstawiono na Rysunku 2. Z kolei, jeśli rozprzestrzenienie było zbyt silne, chromosomy będą zbyt cienkie i rozciągnięte lub w niektórych przypadkach pofragmentowane na małe części, co pokazano na Rysunku 3.

Rysunek 1. Preparat zgniatany chromosomów politenicznych z podwójnym znakowaniem przeciwciałem przeciwko kinazie JIL-1 histonu H3S10 (na czerwono) oraz Hoechst (na niebiesko).

Rysunek 2. Preparat zgniatany z chromosomami politenicznymi o niewystarczającym stopniu rozprzestrzenienia.

Rycina 3. Preparat zgniatany politennych chromosomów z nadmiernym rozprzestrzenieniem.

Dyskusja

Włączenie kwasu octowego i mlekowego do konwencjonalnych protokołów preparatyki metodą zgniatania (squash) ułatwia zarówno rozdzielczość między pasmami, jak i rozprzestrzenianie ramion chromosomowych, jednak niestety niektóre epitopy nie przeżywają takiej obróbki. Przykładem takiego epitopu jest H3S10ph (Cai et al., 2008). Ponieważ obróbka kwasowa ma również tę wadę, że wygasza naturalną fluorescencję białek znakowanych GFP, DiMario et al. (2006) opracowali niedawno opartą na formaldehydzie „bezkwasową ...