Niniejszy protokół wideo przedstawia technikę zgniatania stosowaną w laboratorium Johansena w celu przygotowania politenicznych chromosomów Drosophila do znakowania przeciwciałami.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie preparatów zgniatanych wieloniciowych chromosomów Drosophila do znakowania przeciwciałami
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Muszka owocówka (*Drosophila*) od dawna jest preferowanym systemem modelowym do badania zależności między strukturą chromatyny a regulacją genów ze względu na zalety cytologiczne wynikające z obecności olbrzymich chromosomów politenicznych w gruczołach ślinowych larw trzeciego stadium. W tej tkance chromosomy przechodzą wiele rund replikacji bez podziałów komórkowych, co prowadzi do powstania około 1000 kopii. DNA pozostaje wyrównane po każdym cyklu replikacyjnym, co skutkuje znacznikowym powiększeniem chromosomów, dając unikalną możliwość skorelowania morfologii chromatyny z lokalizacją specyficznych białek. W konsekwencji pojawiło się duże zainteresowanie określaniem modyfikacji epigenetycznych występujących w różnych genach oraz na różnych etapach procesu transkrypcji. Ważnym narzędziem w tego typu badaniach jest znakowanie chromosomów politenicznych przeciwciałami przeciwko interesującemu badacza enzymowi, czynnikowi transkrypcyjnemu lub modyfikacji histonów. Niniejszy protokół wideo przedstawia technikę rozgniatania (squash) stosowaną w laboratorium Johansena w celu przygotowania chromosomów politenicznych *Drosophila* do znakowania przeciwciałami.
Protokół
Poniższy protokół przygotowania preparatu do zgniatania chromosomów politenicznych został dostosowany z procedury opisanej przez Johansen et al. (2009).
1. Hodowla larw Drosophila trzeciego stadium
Aby uzyskać optymalne chromosomy politeniczne do wysokiej jakości preparatów z dyni, niezbędne są warunki hodowli zapobiegające przeludnieniu (np. umieszczenie około 20 składających jaja samic w standardowej butelce do much o średnicy 4" i przenoszenie ich do nowej butelki każdego dnia). Należy wybrać najgrubsze osobniki z pierwszej partii wspinających się larw trzeciego stadium, gdy znajdują się one ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Włączenie kwasu octowego i mlekowego do konwencjonalnych protokołów preparatyki metodą zgniatania (squash) ułatwia zarówno rozdzielczość między pasmami, jak i rozprzestrzenianie ramion chromosomowych, jednak niestety niektóre epitopy nie przeżywają takiej obróbki. Przykładem takiego epitopu jest H3S10ph (Cai et al., 2008). Ponieważ obróbka kwasowa ma również tę wadę, że wygasza naturalną fluorescencję białek znakowanych GFP, DiMario et al. (2006) opracowali niedawno opartą na formaldehydzie „bezkwasową .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Dziękujemy pani V. Lephart za utrzymanie szczepów much. Praca ta była wspierana przez grant Narodowych Instytutów Zdrowia (GM62916) oraz grant Narodowej Fundacji Nauki (MCB0817107).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development. 135, 2917-2925 (2008).
- DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
