Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje mikrofluidyczny model kokultury do jednoczesnej i zlokalizowanej hodowli komórek nabłonkowych oraz bakterii. Model ten może być wykorzystany do badania roli różnych rozpuszczalnych sygnałów molekularnych w patogenezie, a także do oceny skuteczności potencjalnych probiotycznych szczepów bakteryjnych.

Streszczenie

Ludzki przewód pokarmowy (GI) to wyjątkowe środowisko, w którym współistnieją komórki nabłonka jelitowego i bakterie niepatogenne (komensalne). Przysłowiem jest, że mikrośrodowisko, z którym patogen styka się w warstwie komensalnej, odgrywa istotną rolę w określaniu stopnia kolonizacji. Obecne metody hodowli stosowane do badania kolonizacji przez patogeny nie nadają się do weryfikacji tej hipotezy, ponieważ nie umożliwiają współhodowli bakterii i komórek nabłonka w sposób naśladujący mikrośrodowisko przewodu pokarmowego. W niniejszym opracowaniu opisujemy mikrofluidyczny model współhodowli, który umożliwia niezależną hodowlę komórek eukariotycznych i bakterii oraz testowanie wpływu mikrośrodowiska komensalnego na kolonizację przez patogeny. Model współhodowli został zademonstrowany poprzez opracowanie komensalnegoEscherichia colibiofilm wśród komórek HeLa, a następnie wprowadzenie enterohemorragicznejE. coli(EHEC) do wyspy komensalnej, w sekwencji naśladującej przebieg zdarzeń podczas infekcji przewodu pokarmowego.

Protokół

1. Wykonanie krzemowych matryc za pomocą standardowej fotolitografii SU-8¹ (nie pokazano w tym filmie).

1. Zastosuj standardowe metody fotolitografii z użyciem SU-8 w celu stworzenia „matryc” z SU-8 (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) do wytwarzania różnych komponentów (membran PDMS o różnej grubości, komory do kokultury) w czystym pomieszczeniu. Takie formy matrycowe mogą być wykonane w każdym zakładzie mikrofabrykacji (np. Stanford Microfluidics Foundry; http://thebigone.stanford.edu/foundry/).
2. Przed replikacją PDMS należy poddać matryce SU-8 działaniu oparów fluorosilanu w eksykatorze podłączonym do źródła próżni, aby ułatwić oddzielenie PDMS od matrycy.. Nanieś kroplę fluorosilanu na ręcznik papierowy i zastosuj próżnię przez jedną minutę. Usuń próżnię i odczekaj 30 minut do czasu osadzenia się fluorosilanu. Przechowuj matrycę SU-8 w zamkniętym pojemniku do późniejszego użycia.

2. Odlewanie replik PDMS z matrycy SU-8²

1. Warstwa płynowa i warstwa sterująca są wykonywane poprzez odlewanie replikacyjne PDMS z matrycy SU-8.
2. Wymieszaj prepolimer PDMS i utwardzacz w stosunku masowym 10:1 i odgazuj w desykatorze przez 1 godzinę (lub do momentu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszaniny PDMS).
3. Umieść matrycę SU-8 w szalce Petriego i ostrożnie wlej mieszaninę PDMS na wierzch matrycy SU-8. Ponownie odgazuj PDMS.
4. Wirować formę przy 120 rpm przez jedną minutę, aby uzyskać jednorodną grubość PDMS na poziomie około 10μm na formie.
5. Podgrzewaj szalkę Petriego zawierającą PDMS i matrycę SU-8 w temperaturze 80°C przez jedną godzinę, aby utwardzić PDMS.
6. Zdejmij utwardzoną matrycę SU-8 pokrytą PDMS z płyty grzewczej.
7. Odlep formę PDMS od matrycy SU-8.
8. Wywierć cztery otwory w formie PDMS za pomocą tępokoniecznej igły 20G, tworząc dwa wloty dla bakterii, jeden wylot oraz jeden port pneumatyczny.

3. Bondowanie urządzeń z wielowarstwowego PDMS: Urządzenie to składa się z trzech warstw – górnej warstwy zawierającej główny kanał, środkowej warstwy pneumatycznej oraz dolnej warstwy bakteryjnej z kanałami dla bakterii. Trzy warstwy są montowane zgodnie z poniższym opisem.

1. Zwilżone metanolem membrany PDMS należy ostrożnie oddzielić od formy matki SU-8 za pomocą czystej pęsety. Następnie należy umieścić membranę na arkuszu teflonowym.
2. Umieść membranę pneumatyczną i warstwę fluidyczną w komorze do plazmy tlenowej. Włącz plazmę na 40 s (przepływ tlenu 10 sccm, moc RF 10 W).
3. Po ekspozycji na plazmę, w ciągu 10 minut, należy wyrównać membranę względem dolnego kanału PDMS za pomocą pęsety. Dodanie metanolu na membranę i warstwy PDMS ułatwia przesuwanie warstw, co usprawnia proces wyrównywania. W tym przypadku urządzenie umieszcza się na kawałku gazy, aby umożliwić odparowanie oparów metanolu.
4. Utwardzaj wyrównane warstwy PDMS na płycie grzewczej w temperaturze 80°C przez 8 h.
5. Po przyklejeniu membrany pneumatycznej do warstwy dolnej, powtórz kroki 3.2 – 3.4, aby przykleić górny kanał do złożonego kompozytowego urządzenia z PDMS.

4. Montaż urządzenia z PDMS^3,4

1. Wywierć otwory w portach wlotowych i wylotowych używanych do zasiewu komórek eukariotycznych i bakterii.
2. Podłącz rurki Tygon (0.01 inch O.D.) do portów i uruchom warstwę pneumatyczną, zasysając ciecz strzykawką 20mL.
3. Umieść model PDMS oraz uprzednio oczyszczone szkiełko przedmiotowe w komorze plazmy tlenowej. Włącz plazmę na 20 sec (przepływ tlenu 20 sccm, moc RF 30W) bez przykładania próżni.
4. Aby zapobiec przywieraniu ścianki wyspy (PDMS) do szkiełka przedmiotowego, natychmiast podłącz strzykawkę do urządzenia i wytwórz podciśnienie, zasysając tłok strzykawki i utrzymując go w tej pozycji.
5. Delikatnie dociśnij model PDMS do szkła (w ciągu 2 minut).
6. Utwardź urządzenie PDMS w temperaturze 80°C przez 10 minut.

5. Obróbka powierzchni szklanej fibonektyną

1. Sterylizować urządzenie pod działaniem promieniowania UV przez 15 minut po podłączeniu przewodów Tygon do każdego portu.
2. Napełnić kanał sterylnym PBS i przepuścić go, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z kanału. Przeprowadzać przepływ przez 10 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza mogą łatwo przenikać przez PDMS ze względu na jego przepuszczalność dla gazów.
3. Wprowadzić do kanału pneumatycznego roztwór barwnika, aby zapobiec tworzeniu się w nim pęcherzyków powietrza.
4. Aby ułatwić osadzanie komórek eukariotycznych na szkle, wprowadzić do urządzenia roztwór fibronektyny o stężeniu 1 μg/mL i inkubować przez 40 min w temperaturze 37°C.
5. Wypłukać nadmiar fibronektyny za pomocą 1 mL pożywki wzrostowej.

6. Tworzenie i pomiar biofilmu komensalnego E. coli w wyspach

1. Rozcień bakterie komensalne (np. E. coli BW2513/pCM18) w minimalnym medium M9 do OD₆₀~1 w celu uformowania biofilmu komensalnego w zamkniętych komorach/wyspach.
2. Zamknij ścianę wyspy, przykładając nadciśnienie cieczy. Do zapobiegania powstawaniu pęcherzyków powietrza w kanale zastosowano własnej konstrukcji przetwornik ciśnienia powietrze-ciecz.
3. Wprowadź komensalne E. coli do wysp przy zamkniętym zaworze i pozostaw bakterie do przytwierdzenia na 1 godzinę w temperaturze 32°C.
4. Wypłucz nieprzytwierdzone bakterie i perfunduj rozcieńczoną zawiesinę bakteryjną (OD₆₀~0.05) z prędkością 0.25mL/hr przez 12 godzin.
5. Przepłucz biofilm świeżą pożywką wzrostową DMEM, aby usunąć słabo przytwierdzone bakterie i przygotować układ do przytwierdzenia komórek eukariotycznych.
6. Wykonaj obrazowanie biofilmu przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego Leica TCS SP5 (Bannockburn, IL) i zwizualizuj architekturę biofilmu za pomocą oprogramowania IMARIS⁵.

7. Wysiewanie komórek eukariotycznych wokół wysp bakteryjnych^6-8

1. Poddać komórki HeLa z kolby hodowlanej trypsynizacji i resuspendować w pożywce DMEM do uzyskania gęstości wysiewu 5 x 10⁵ komórek/mL.
2. Wprowadzić komórki HeLa do urządzenia z prędkością przepływu 2 mL/min, używając pompy strzykawkowej Picoplus (Harvard Apparattus, MA). Należy upewnić się, że ścianka wyspy jest obniżona, tak aby biofilm bakteryjny był oddzielony od obszaru komórek HeLa. Krok ten należy wykonać na stoliku mikroskopu świetlnego, aby móc określić jednorodność wysiewu.
3. Zablokować wylot komórek, aby ograniczyć ruch zawiesiny komórkowej w kanale, i inkubować przez 6 h w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO₂.
4. Przepłukać urządzenie pożywką wzrostową z prędkością 0,5 mL/hr w celu usunięcia nieprzytwierdzonych komórek.
5. Odświeżać pożywkę DMEM dla komórek HeLa oraz komensalnych E. coli co 6 godzin.

8. Wprowadzenie patogennych bakterii na wyspę i ekspozycja komórek eukariotycznych

1. Przygotować szczep E. coli O157:H7 (EHEC) do zakażenia komórek HeLa z wielokrotnością zakażenia (m.o.i) wynoszącą od 100:1 do 20:1 (liczba bakterii EHEC na jedną komórkę HeLa).
2. Wypłukać i usunąć słabo przytwierdzone bakterie komensalne.
3. Wprowadzić rozcieńczoną zawiesinę EHEC (OD₆₀ ~ 0,1) do wysepek.
4. Inkubować urządzenie w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO₂ przez 6 godzin bez przepływu, aby umożliwić ekspozycję EHEC na sygnały obecne w biofilmie komensalnym.
5. Podnieść ściankę PDMS, aby wystawić EHEC w wysepkach komensalnych na działanie komórek HeLa przez 6 godzin.
6. Wypłukać kanał za pomocą PBS i przeprowadzić barwienie komórek żywych i martwych przy użyciu zestawu Live/Dead (L3224, Invitrogen, CA).
7. Wykonać obrazy z wielu lokalizacji przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss Axiovert 20M i oszacować liczbę żywych oraz martwych komórek.

9. Reprezentatywne wyniki ⁹

Sekwencja zdarzeń w infekcjach przewodu pokarmowego została odtworzona poprzez wytworzenie monowarstwy komórek HeLa oraz biofilmu komensalnego E. coli , a następnie wystawienie EHEC na działanie biofilmu komensalnego przed zakażeniem komórek HeLa. Kroki zaangażowane w przygotowanie mikrofluidycznego modelu kokultury przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2A przedstawia trójwymiarowy rendering urządzenia do kokultury. Dwa regiony w urządzeniu do kokultury – komora hodowli komórek eukariotycznych oraz wyspa bakteryjna – są pokazane na Rysunku 2B za pomocą barwników o różnych kolorach (fioletowy dla regionów eukariotycznych i zielony dla wyspy bakteryjnej). Możliwość odizolowania regionów hodowli bakteryjnej od otaczającego regionu eukariotycznego została wykazana na Rysunku 2C przy użyciu barwników. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wyniki kokultury komórek nabłonka i bakterii. Rysunek 3A pokazuje kolonizację wyspy biofilmu komensalnego (zielony) przez EHEC (czerwony). Rysunek 3B przedstawia zestawienie komórek nabłonka i komensalnego E. coli z EHEC na wyspie bakteryjnej. Ekspresujące RFP EHEC oraz ekspresujące GFP bakterie komensalne lokalizują się na wyspie po obniżeniu ścianki PDMS, co ilustruje możliwość odizolowania wyspy bakteryjnej od komórek nabłonka.

Rysunek 1: Schemat wysiewu komórek w modelu kokultury(1) Ściankę z PDMS opuszczono, aby utworzyć wyspę, następnie do wnętrza wyspy wprowadzono bakterie komensalne, a wokół niej przepływiono fibronektyną. (2) Komórki HeLa wysiano w obszarach otaczających wyspę. (3) Po osiągnięciu przez komórki HeLa konfluencji oraz wykształceniu się biofilmu bakteryjnego komensali, do wyspy wprowadzono EHEC. (4) Ściankę z PDMS podniesiono, aby odsłonić komórki HeLa otaczające wyspę na działanie EHEC. Wstawka przedstawia szczegóły działania zaworu.

Rysunek 2: Mikropłynowy model do kokultury komórek nabłonkowych i bakterii(A) Trójwymiarowe przedstawienie urządzenia do kokultury, pokazujące pneumatycznie sterowane obszary wychwytywania służące do tworzenia wysp bakteryjnych wśród komórek nabłonkowych. Każda wyspa bakteryjna (1200 μm średnica i 1000 μm (apart) posiada oddzielny wlot i wylot służący do dostarczania pożywki wzrostowej i usuwania produktów przemiany materii z wyspy. (B) Mikrofotografia urządzenia do kokultury z barwnikami kolorystycznymi obrazującymi poszczególne obszary (strefę komórek nabłonkowych, wyspy bakteryjne). (C) Precyzję pneumatycznego systemu pułapkowania wykazano poprzez obniżenie ścianki PDMS (panel lewy) za pomocą pneumatycznie aktywowanego kanału (kolor niebieski), wprowadzenie fioletowego barwnika do zamkniętych wysp oraz przepływ żółtego barwnika wokół nich przez 48 h. Po podniesieniu ścianki PDMS (panel prawy) obszar wyspy zostaje wystawiony na działanie otaczającego go żółtego barwnika. Pasek skali oznacza 500 μm.

Rysunek 3: Współuprawa komórek HeLa i bakterii(A) Obraz fluorescencyjny EHEC wykazującego ekspresję RFP oraz wykazującego ekspresję GFP E. coli BW25113 na wyspie. (B) Nałożenie obrazów w świetle przechodzącym oraz fluorescencji zielonej i czerwonej w urządzeniu. Pasek skali reprezentuje 200 μm.

Dyskusja

Konwencjonalne testy przyczepiania i kolonizacji patogenów wykorzystują monowarstwę komórek eukariotycznych w naczyniach do hodowli tkankowej, do których dodaje się patogeny. Modele te nie są istotne fizjologicznie, ponieważ nie uwzględniają komensalnego biofilmu bakteryjnego rozwijającego się na komórkach eukariotycznych. Proste dodanie wcześniej wyhodowanej kultury bakteryjnej do komórek eukariotycznych mało prawdopodobnie doprowadzi do powstania takiej konfiguracji, gdyż biofilmy są wysoce zorganizowanymi strukturami,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SU-8 2050	MicroChem Corp.
maska fotolitograficzna o wysokiej rozdzielczości (16 256 dpi)	Fineline-Imaging Inc, CO
Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridekafluorooktylo)silan	Sigma-Aldrich	77279
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30002.02
Programowalna powłokownia wirowa	Laurell Tech Corp	WS0650S
Saparator masek	Neurotronix	Q4000
Trawacz plazmowy tlenowy	March Plasma System, CA	CS-1701
Pompa strzykawkowa	Harvard Apparatus
Zestaw do oceny żywotności i cytotoksyczności Live/Dead	Invitrogen	L-3224