Ulepszona metoda izolacji RNA z sosny taeda (P. taeda L.) i innych gatunków iglaków

Podsumowanie

Wiele tkanek roślinnych, w tym łyko i drewno sosny taeda (Pinus taeda L.), zawiera wysokie stężenia związków fenolowych i polisacharydów, które utrudniają oczyszczanie RNA. Niniejsza prezentacja omawia techniki zbioru tkanek hodowanych w warunkach polowych oraz izolacji RNA o jakości wystarczającej do analiz mikromacierzy i innych analiz genomowych.

Streszczenie

Tkanki wyizolowane z gatunków drzew iglastych, w szczególności tych należących do rodziny sosnowatych (Pinaceae), takich jak sosna loblolly (Pinus taeda(L.), zawierają wysokie stężenia związków fenolowych i polisacharydów, które utrudniają oczyszczanie RNA. Izolacja wysokiej jakości RNA z tych gatunków wymaga rygorystycznych procedur pobierania tkanek w terenie oraz zastosowania protokołu izolacji RNA obejmującego wielokrotne etapy ekstrakcji organicznej, aby uzyskać RNA o jakości wystarczającej do analiz mikromacierzy i innych analiz genomicznych. Izolacja wysokiej jakości RNA z próbek sosny loblolly pobranych w terenie może być trudna, jednak kilka modyfikacji standardowych procedur izolacji tkanek i RNA znacznie poprawia wyniki. Stopień ogólnej degradacji RNA wzrasta, jeśli próbki nie są prawidłowo pobierane i transportowane z terenu, szczególnie podczas zbiorów na dużą skalę. Wydajność całkowitego RNA można znacząco zwiększyć poprzez sproszkowanie próbek w młynku kriogenicznym z ciekłym azotem przed izolacją RNA, zwłaszcza gdy próbki pochodzą z tkanek zdrewniałych. Wynika to przede wszystkim z obecności utleniaczy, takich jak związki fenolowe, oraz polisacharydów, które występują w wysokich stężeniach w ekstraktach z tkanek zdrewniałych większości gatunków iglaków. Jeśli nie zostaną usunięte, zanieczyszczenia te mogą przenieść się do produktu końcowego, prowadząc do problemów, takich jak degradacja RNA, co skutkuje niską wydajnością i słabą jakością próbki RNA. Przeniesienie związków fenolowych, a także polisacharydów, może również zmniejszyć lub nawet całkowicie wyeliminować aktywność odwrotnej transkryptazy lub innych polimeraz powszechnie stosowanych do syntezy cDNA. W szczególności RNA przeznaczone do wykorzystania jako matryca do syntezy dwuniciowego cDNA przy tworzeniu bibliotek cDNA, syntezy jednoniciowego cDNA do PCR lub qPCR, lub do syntezy materiałów docelowych do mikromacierzy, musi być najwyższej jakości, jeśli badacze oczekują uzyskania optymalnych wyników. Techniki izolacji RNA powszechnie stosowane dla wielu innych gatunków roślin są często niewystarczające w usuwaniu tych zanieczyszczeń z próbek iglaków i w związku z tym nie pozwalają na uzyskanie próbek całkowitego RNA odpowiednich do dalszych manipulacji. W tym filmie prezentujemy metody pobierania tkanek iglaków w terenie, począwszy od ścięcia czterdziestoletniego drzewa, aż po pobieranie łyka, ksylemu wtórnego i ksylemu drewna reakcyjnego. Prezentujemy również protokół izolacji RNA, który konsekwentnie pozwala na uzyskanie wysokiej jakości RNA do późniejszych manipulacji enzymatycznych.

Protokół

Część 1: Pozyskiwanie drzew

Po wybraniu i ścięciu drzewa ważne jest, aby pracować tak starannie i szybko, jak to możliwe. Każdy pobrany typ tkanki należy niezwłocznie umieścić w oddzielnym naczyniu z ciekłym azotem, aby uniknąć wzajemnego zanieczyszczenia materiału próbkowego. Ten protokół izolacji RNA jest skalowalny.

1. Przyciąć kłody na odcinki o długości około 0.5-0.75 m, a następnie za pomocą piły spalinowej naciąć korę w dwóch lub trzech miejscach wzdłuż osi podłużnej kłody.
2. Używając dłuta do drewna, opracować krawędź nacięcia, aż kora zacznie oddzielać się od drewna, a następnie kontynuować pracę dłutem, jednocześnie odciągając fragment kory, aż całkowicie oddzieli się ona od pnia.
3. Ksylem wtórny pozyskuje się poprzez skrobanie wzdłuż osi podłużnej kłody pozbawionej kory za pomocą jednostronnej żyletki o prostej krawędzi. Należy nosić rękawiczki lateksowe, aby zminimalizować zanieczyszczenie tkanki.
4. Floem, znajdujący się po wewnętrznej stronie fragmentów kory, można łatwo pozyskać poprzez ręczne obieranie.
5. Drewno reakcyjne pobiera się z dolnej strony konarów po uprzednim oznaczeniu ich farbą w sprayu, aby wskazać ich pierwotną orientację względem podłoża.
6. Konary przecina się na kłody o długości 1-2 m i nacinają po przeciwnych stronach wzdłuż osi podłużnej, zgodnie z przybliżonym rozmieszczeniem dwóch typów drewna reakcyjnego: drewna przeciwstawnego (po górnej stronie konara) i drewna kompresyjnego (po dolnej stronie konara). Korę oddziela się od konara w opisany wcześniej sposób, z zastrzeżeniem, że w jednym czasie usuwa się tylko korę pokrywającą dany typ drewna reakcyjnego. Następnie ksylem wtórny lub floem pobiera się w opisany wyżej sposób i umieszcza w ciekłym azocie.
7. Inne próbki, takie jak igły, wierzchołki pędów i młode szyszki, można pozyskiwać ręcznie lub przy użyciu sekatora, w zależności od potrzeb.
8. Zebrane próbki zamrożone w ciekłym azocie należy umieścić w oznakowanych workach lub odpowiednich pojemnikach i zapakować w suchy lód w celu transportu do laboratorium.

Część 2: Przetwarzanie próbek w młynku kriogenicznym

1. Napełnić zbiornik młyna kriogenicznego Spex 6850 ciekłym azotem, umieścić pręt uderzeniowy w jednej z fiolek do mielenia i napełnić ją ciekłym azotem w celu schłodzenia wstępnego. Odlać ciekły azot i dodać próbkę do fiolki.
2. Upewnić się, że w komorze mielącej nie pozostał nadmiar ciekłego azotu oraz że nadmiar gazowego azotu został całkowicie odprowadzony przed osadzeniem nasadki zamykającej komorę.
3. Włożyć fiolkę do mielenia do uchwytu i zamknąć.
4. Mielić próbki zdrewniałe przez dwa cykle po 1 minucie na cykl przy ustawieniu prędkości 14.
5. Użyć szpatułki schłodzonej w ciekłym azocie, aby przenieść zmieloną próbkę (mączkę drzewną) do zlewki, która została uprzednio schłodzona i zawiera niewielką ilość ciekłego azotu.
6. Przeżyć zawiesinę próbki w ciekłym azocie do pojemnika do przechowywania i umieścić w temperaturze -80° C do czasu użycia.

Część 3: Izolacja RNA, dzień 1

1. Odmierzyć 20mL buforu do izolacji RNA do zakręcanej probówki Falcon 50mL, dodać 400 μL β-merkaptoetanolu, krótko wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 60° C.
2. Do każdej probówki dodać 4 g zamrożonej tkanki. Zakręcić i energicznie wstrząsnąć ręcznie, a następnie mieszać w wirówce typu vortex przez 10 sekund.
3. Dodać do probówki taką samą objętość chloroformu i delikatnie odwrócić w celu wymieszania. Umieścić probówkę na mielarce i mieszać metodą end-over-end przez 5 minut.
4. Przełożyć mieszaninę do probówki Oak Ridge 50 mL i wirować z prędkością 12 000 rpm (17 200 xg) w rotorze stałokątnym SS34 przez 5 minut.
5. Przenieść fazę wodną do nowej probówki Oak Ridge i dodać połowę objętości chloroformu.
6. Mieszać w wirówce typu vortex przez 1 minutę, a następnie kontynuować mieszanie na mielarce przez 5 minut. Wirować z prędkością 12 000 rpm (17 200 xg) w rotorze stałokątnym SS34 przez 5 minut.
7. Przenieść fazę wodną do nowej probówki Oak Ridge i dodać połowę objętości chloroformu. Mieszać w wirówce typu vortex przez 1 minutę. Wirować z prędkością 12 000 rpm (17 200 xg) w rotorze stałokątnym SS34 przez 10 minut.
8. Przenieść fazę wodną do wysokoprędkościowej probówki polipropylenowej 50 mL. Wirować z prędkością 10 000 rpm (11 900 xg) w rotorze stałokątnym SS34 przez 20 minut.
9. Odlać nadosad do probówki Falcon 50 mL i dodać do nadosadu jedną czwartą objętości roztworu LiCl 10 M. Krótko wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować w temperaturze 4° C przez noc w celu wytrącenia osadu.

Część 4: Izolacja RNA, dzień 2

1. Przed rozpoczęciem pracy podgrzać bufor SSTE w łaźni wodnej o temperaturze 65° C.
2. Przenieść próbkę wytrąconą za pomocą LiCl do probówki z polipropylenu i zpelletować RNA poprzez wirowanie z prędkością 11 000 rpm w rotorze stałokątnym SS34 (14 450 xg) przez 30 minut w temperaturze 4° C.
3. Po wirowaniu odlać i usunąć ciecz, a następnie odwrócić probówki na chusteczkach Kimwipes na około 1 minutę. Za pomocą pipety usunąć pozostały naddatek.
4. Resuspendować każdy pellet w 800 μL podgrzanego buforu SSTE, używając pipety do dokładnego wymieszania próbek. Przenieść zresuspendowaną próbkę do 2 mL probówek do mikrowirowarki Ambion wolnych od RNaz.
5. Podgrzewać próbki w temperaturze 65° C przez 2 minuty, a następnie energicznie wymieszać w wibratorze (vortex), aby zapewnić całkowitą resuspensję.
6. Do każdej probówki z próbką dodać równą objętość fenolu z chloroformem, pH 8. Mieszać każdą próbkę w wibratorze przez 30 sekund, a następnie wirować w mikrowirowarce z prędkością 14 000 rpm przez 3 minuty.
7. Przenieść fazę wodną do nowych 2 mL probówek do mikrowirowarki Ambion wolnych od RNaz i dodać równą objętość chloroformu. Mieszać każdą próbkę w wibratorze przez 30 sekund i wirować w mikrowirowarce z prędkością 14 000 rpm przez 3 minuty.
8. Przenieść fazę wodną do probówek Phase-Lock Gel, które zostały wcześniej przygotowane poprzez wirowanie z prędkością 11 000 rpm przez 2 minuty. Dodać połowę objętości chloroformu i delikatnie wymieszać za pomocą pipety.
9. Wirować z prędkością 11 000 rpm przez 5 minut i przenieść fazę wodną do świeżych 2 mL probówek do mikrowirowarki Ambion wolnych od RNaz.

Część 5: Wytrącanie RNA i przemywanie etanolem

1. Do fazy wodnej dodać 50 μL 3.0 M octanu sodu, pH 4.8 oraz 1 mL 100% etanolu. Wymieszać w wortexie i wytrącić w temperaturze -80° C przez 30 minut lub przez noc w temperaturze -20° C.
2. Próbki wirować w mikrowirowce z prędkością 14,000 rpm przez 30 minut w temperaturze 4° C, a następnie ostrożnie odessać nadsącz. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu.
3. Osady RNA przemyć 1 mL 70% (v/v) etanolu w temperaturze -20° C. Wirować w mikrowirowce z prędkością 14,000 rpm przez 1 minutę i odessać etanol.
4. Powtórzyć krok 5.3.
5. Zdjąć nakrętki z probówek i pozostawić osady do wyschnięcia na powietrzu na blacie przez 3-5 minut.

Część 6: Końcowe resuspensowanie i kwantyfikacja

1. Każdy osad zawiesić w 100 μL wody traktowanej DEPC. Wymieszać za pomocą wortexa i inkubować probówki w temperaturze 65° C przez 2 minuty, a następnie umieścić na lodzie. W razie potrzeby powtórzyć czynność, aby zapewnić pełne zawieszenie próbki.
2. W razie potrzeby połączyć podobne próbki i przygotować 50 μL rozcieńczenia 1:10 w 10mM Tris, pH 7.5, do oznaczania ilościowego metodą spektrofotometryczną. Stosunki absorbancji 260/280 oraz 260/230 są zazwyczaj odpowiednio wyższe niż 2.1 i 2.2. Wydajność izolacji RNA wynosi od 60-120μg/g zamrożonej tkanki.
3. Próbki przeanalizować, nakładając 1.5-2.5 μg RNA na 1% żel agarozowy w buforze TAE. W przypadku bardziej krytycznych próbek przeanalizować RNA za pomocą Agilent 2100 Bioanalyzer zgodnie z instrukcjami producenta.

Reprezentatywne wyniki:

Wydajność izolacji RNA z różnych tkanek drzew iglastych wynosi od 60-120 μg/g mrożonej tkanki, przy czym próbki zdrewniałe zazwyczaj dają około 70-80 μg/g mrożonej tkanki. Diagnostyczne stosunki 260/280 oraz 260/230 są zazwyczaj większe niż 2,1 i stanowią dobre wskaźniki tego, że próbka RNA jest odpowiednio wolna od znaczących zanieczyszczeń fenolowych lub węglowodanowych. Próbki analizowane metodą elektroforezy w żelu agarozowym z następującym barwieniem EtBr powinny wykazywać trzy wyraźne prążki dla RNA 25S, 18S i 5S (Rycina 1). Wyznaczanie stechiometrii 28S do 18S na żelach agarozowych jest nieco subiektywne, a czynniki takie jak warunki prowadzenia żelu, barwienie i ilość naniesionej próbki mogą mieć wpływ na wynik. Generalnie stosunek 28S:18S będzie wynosił > 1,5. Jednak niektóre próbki drzew iglastych wykazują niższe stosunki. Na przykład w analizach za pomocą Agilent 2100 zaobserwowaliśmy kilka przypadków próbek drzew iglastych z różnych typów tkanek, w których stechiometria była bliższa 1,2:1. Zatem pozornie niska stechiometria 28S:18S w elektroforezie w żelu agarozowym nie musi wskazywać na niską jakość próbki. W próbkach liści, pędów i szyszek często występują dodatkowe wyraźne prążki ze względu na rybosomalne RNA chloroplastowe. Materiały barwione EtBr, które nie migrują z dołka startowego lub prążki o wysokiej masie cząsteczkowej (>8-10 kb), zazwyczaj wskazują na zanieczyszczenie genomowym DNA (Rycina 2). Smugi o niskiej masie cząsteczkowej w pobliżu lub poniżej prążka 5S oraz osłabione barwienie prążków rybosomalnych lub pozorna stechiometria 18S > 28S są dobrymi wskaźnikami zajścia degradacji RNA (Rycina 3). W analizie elektroferogramu Agilent 2100 linia bazowa powinna być niska i stosunkowo gładka, z głównymi pikami odpowiadającymi rybosomalnemu RNA 18S i 28S, przy czym stosunki 28S:18S wahają się od 1,2 do 2,0. Wartość Agilent RNA Integrity Number (RIN) może być lepszym predyktorem jakości RNA i powinna wynosić co najmniej 7 lub więcej dla RNA, które ma zostać użyte do przygotowania celów do mikromacierzy. Rycina 4 przedstawia typowy elektroferogram Agilent 2100 dla RNA z ksylemu ze stosunkiem 28S:18S równym 1,4 i wartością RIN wynoszącą 8,6, podczas gdy Rycina 5 pokazuje słaby preparat RNA z ksylemu o bardzo wysokiej linii bazowej i wyraźnej degradacji, co ujawnia stosunek 28S:18S równy 0,65 oraz wartość RIN wynosząca 3,4.

Rysunek 1. Analiza żelu agarozowego wysokiej jakości RNA sosny. Ścieżka 1, standard NEB 1 kb, ścieżka 2 pokazuje typową izolację całkowitego RNA z ksylemu wtórnego sosny loblolly z charakterystycznymi prążkami rybosomalnymi 28S, 18S i 5S oraz wyraźnym stosunkiem 28S:18S >1.

Rycina 2.Analiza w żelu agarozowym próbki RNA sosny zanieczyszczonej DNA genomowym. Ścieżka 1, standard NEB 1 kb, ścieżka 2, próbka RNA z ksylemu wykazująca zanieczyszczenie DNA genomowym.

Rycina 3.Analiza w żelu agarozowym próbki sosny wykazująca degradację RNA i zanieczyszczenie genomowym DNA. Ścieżka 1, standard NEB 1 kb, ścieżka 2, próbka RNA z ksylemu wykazująca zanieczyszczenie genomowym DNA i silną degradację RNA.

Rycina 4.Elektroforegram Agilent 2100 całkowitego RNA ksylemu wyizolowanego opisaną metodą z ksylemu sosny loblolly. Stosunek 28S:18S wynosi 1,4, wartość RIN wynosi 8,6

Rycina 5. Elektroforegram Agilent 2100 całkowitego RNA z wierzchołka apikalnego wykazujący silną degradację i kontaminację genomową. Stosunek 28S:18S wynosi 0,65, wartość RIN wynosi 3,4

Dyskusja

Uzyskanie wysokiej jakości RNA z gatunków iglaków może być trudnym zadaniem ze względu na wysoką zawartość związków fenolowych i polisacharydów występujących w tkankach zdrewniałych. Opierając się na protokole opracowanym przez Chang i wsp. (1), stwierdziliśmy, że bardziej rygorystyczne etapy ekstrakcji i oczyszczania prowadzą do spójnej izolacji całkowitego RNA bardzo wysokiej jakości z różnych tkanek zdrewniałych i niezdrewniałych pobranych od szerokiej gamy gatunków iglaków. W tym filmie zaprezentowano nie tylko nasz ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do izolacji RNA			2% CTAB (bromek heksadecylotrimetylammonium), 2% PVP (poliwinylo-pirolidon; Mw 30-40 000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L espermidyny
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Fenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Przygotowano z wody traktowanej DEPC
Bufor SSTE			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Octan sodu (NaOAc) 3M pH4.8			Przygotowano z wody traktowanej DEPC
Fenol-chloroform (pH8.0)			120mL fenolu, 160mL chloroformu miareowanego wielokrotnymi zmianami 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Teflonowe probówki do wirowania wysokich prędkości Oak Ridge	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polipropylenowe probówki do wirowania wysokich prędkości 50mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon, sterylne, zakręcane stożkowe probówki jednorazowe 50mL	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Probówki do mikrowirowarki wolne od RNaz Ambion, 2mL	Ambion	#AM12425