Ulepszona metoda izolacji RNA z sosny taeda (P. taeda L.) i innych gatunków iglaków

Podsumowanie

Wiele tkanek roślinnych, w tym łyko i drewno sosny taeda (Pinus taeda L.), zawiera wysokie stężenia związków fenolowych i polisacharydów, które utrudniają oczyszczanie RNA. Niniejsza prezentacja omawia techniki zbioru tkanek hodowanych w warunkach polowych oraz izolacji RNA o jakości wystarczającej do analiz mikromacierzy i innych analiz genomowych.

Streszczenie

Tkanki wyizolowane z gatunków drzew iglastych, w szczególności tych należących do rodziny sosnowatych (Pinaceae), takich jak sosna loblolly (Pinus taeda(L.), zawierają wysokie stężenia związków fenolowych i polisacharydów, które utrudniają oczyszczanie RNA. Izolacja wysokiej jakości RNA z tych gatunków wymaga rygorystycznych procedur pobierania tkanek w terenie oraz zastosowania protokołu izolacji RNA obejmującego wielokrotne etapy ekstrakcji organicznej, aby uzyskać RNA o jakości wystarczającej do analiz mikromacierzy i innych analiz genomicznych. Izolacja wysokiej jakości RNA z próbek sosny loblolly pobranych w terenie może być trudna, jednak kilka modyfikacji standardowych procedur izolacji tkanek i RNA znacznie poprawia wyniki. Stopień ogólnej degradacji RNA wzrasta, jeśli próbki nie są prawidłowo pobierane i transportowane z terenu, szczególnie podczas zbiorów na dużą skalę. Wydajność całkowitego RNA można znacząco zwiększyć poprzez sproszkowanie próbek w młynku kriogenicznym z ciekłym azotem przed izolacją RNA, zwłaszcza gdy próbki pochodzą z tkanek zdrewniałych. Wynika to przede wszystkim z obecności utleniaczy, takich jak związki fenolowe, oraz polisacharydów, które występują w wysokich stężeniach w ekstraktach z tkanek zdrewniałych większości gatunków iglaków. Jeśli nie zostaną usunięte, zanieczyszczenia te mogą przenieść się do produktu końcowego, prowadząc do problemów, takich jak degradacja RNA, co skutkuje niską wydajnością i słabą jakością próbki RNA. Przeniesienie związków fenolowych, a także polisacharydów, może również zmniejszyć lub nawet całkowicie wyeliminować aktywność odwrotnej transkryptazy lub innych polimeraz powszechnie stosowanych do syntezy cDNA. W szczególności RNA przeznaczone do wykorzystania jako matryca do syntezy dwuniciowego cDNA przy tworzeniu bibliotek cDNA, syntezy jednoniciowego cDNA do PCR lub qPCR, lub do syntezy materiałów docelowych do mikromacierzy, musi być najwyższej jakości, jeśli badacze oczekują uzyskania optymalnych wyników. Techniki izolacji RNA powszechnie stosowane dla wielu innych gatunków roślin są często niewystarczające w usuwaniu tych zanieczyszczeń z próbek iglaków i w związku z tym nie pozwalają na uzyskanie próbek całkowitego RNA odpowiednich do dalszych manipulacji. W tym filmie prezentujemy metody pobierania tkanek iglaków w terenie, począwszy od ścięcia czterdziestoletniego drzewa, aż po pobieranie łyka, ksylemu wtórnego i ksylemu drewna reakcyjnego. Prezentujemy również protokół izolacji RNA, który konsekwentnie pozwala na uzyskanie wysokiej jakości RNA do późniejszych manipulacji enzymatycznych.

Protokół

Część 1: Zbiór drzew

Po wybraniu i ścięciu drzewa należy pracować jak najstaranniej i najszybciej. W miarę pobierania poszczególnych typów tkanek, powinny być one natychmiast umieszczane w osobnych naczyniach z ciekłym azotem, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej materiału próbkowego. Niniejszy protokół izolacji RNA jest skalowalny.

1. Przeciąć kłody na odcinki o długości około 0,5-0,75 m i za pomocą piły spalinowej naciąć korę w dwóch lub trzech miejscach wzdłuż osi podłużnej odcinka.
2. Za pomocą dłuta do drewna opracować krawędź naciętego obszaru, aż kora zacznie oddzielać się od drewna, a następnie kontynuować pracę dłutem, odciągając fragment kory, aż do jej całkowitego oddzielenia od pnia.
3. Ksylem wtórny pozyskuje się za pomocą jednostronnej żyletki o prostej krawędzi, skrobiąc wzdłuż osi podłużnej odcinka pozbawionego kory. Należy stosować rękawiczki lateksowe, aby zminimalizować zanieczyszczenie tkanki.
4. Floem, znajdujący się po wewnętrznej stronie fragmentów kory, można łatwo pozyskać poprzez ręczne obieranie.
5. Drewno reakcyjne pobiera się z dolnej strony konarów po uprzednim oznakowaniu ich farbą w sprayu, aby wskazać ich pierwotną orientację względem gruntu.
6. Konary przecina się na odcinki o długości 1-2 m i nacinają po przeciwnych stronach wzdłuż osi podłużnej, zgodnie z przybliżonym rozmieszczeniem dwóch typów drewna reakcyjnego: drewna przeciwstawnego (na górnej stronie konaru) i drewna kompresyjnego (na dolnej stronie konaru). Korę oddziela się od konaru w opisany wyżej sposób, z zastrzeżeniem, że jednorazowo usuwa się tylko korę pokrywającą dany typ drewna reakcyjnego. Następnie ksylem wtórny lub floem pobiera się zgodnie z powyższym opisem i umieszcza w ciekłym azocie.
7. Inne próbki, takie jak igły, wierzchołki pędów i młode szyszki, można pobierać ręcznie lub przy użyciu sekatora, w zależności od potrzeb.
8. Zebrane próbki zamrożone w ciekłym azocie należy umieścić w oznakowanych workach lub odpowiednich pojemnikach i zapakować w suchy lód w celu transportu do laboratorium.

Część 2: Przetwarzanie próbek w młynku kriogenicznym

1. Napełnić zbiornik młyna kriogenicznego Spex 6850 ciekłym azotem, umieścić pręt uderzeniowy w jednej z probówek do mielenia i napełnić ją ciekłym azotem w celu wstępnego schłodzenia. Odlać ciekły azot i dodać próbkę do probówki.
2. Upewnić się, że w komorze mielenia nie pozostał nadmiar ciekłego azotu oraz że nadmiar gazowego azotu został całkowicie odprowadzony przed osadzeniem nasadki w celu uszczelnienia komory.
3. Włożyć probówkę do mielenia do uchwytu i zamknąć.
4. Mielić próbki zdrewniałe przez dwa cykle po 1 minucie na cykl, przy ustawieniu prędkości na 14.
5. Używając szpatułki schłodzonej w ciekłym azocie, przenieść zmieloną próbkę (mączkę drzewną) do wcześniej schłodzonego zlewki zawierającej niewielką ilość ciekłego azotu.
6. Przelać zawiesinę z ciekłego azotu i próbki do pojemnika do przechowywania i umieścić w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

Część 3: Izolacja RNA, dzień 1

1. Wlej 20mL buforu do izolacji RNA do zakręcanej probówki Falcon o pojemności 50mL, dodaj 400 μL β-merkaptoetanolu, krótko wymieszaj w vorteksie, a następnie podgrzej w kąpieli wodnej o temperaturze 60° C.
2. Do każdej probówki dodaj 4 g zamrożonej tkanki. Zakręć i energicznie wstrząśnij ręcznie, a następnie wymieszaj w vorteksie przez 10 sekund.
3. Do probówki dodaj taką samą objętość chloroformu i delikatnie odwróć, aby wymieszać zawartość. Umieść probówkę na rotatorze i mieszaj w systemie end-over-end przez 5 minut.
4. Przelej mieszaninę do probówki Oak Ridge o pojemności 50 mL i odwiruj przy 12 000 (17 200 xg) obr./min w rotorze stałokątnym SS34 przez 5 minut.
5. Przenieś fazę wodną do nowej probówki Oak Ridge i dodaj połowę objętości chloroformu.
6. Mieszaj w vorteksie przez 1 minutę, a następnie kontynuuj mieszanie na rotatorze przez 5 minut. Odwiruj przy 12 000 obr./min (17 200 xg) w rotorze stałokątnym SS34 przez 5 minut.
7. Przenieś fazę wodną do nowej probówki Oak Ridge i dodaj połowę objętości chloroformu. Mieszaj w vorteksie przez 1 minutę. Odwiruj przy 12 000 obr./min (17 200 xg) w rotorze stałokątnym SS34 przez 10 minut.
8. Przenieś fazę wodną do wysokoprędkościowej probówki z polipropylenu o pojemności 50 mL. Odwiruj przy 10 000 obr./min (11 900 xg) w rotorze stałokątnym SS34 przez 20 minut.
9. Zlej supernatant do probówki Falcon o pojemności 50 mL i dodaj do niego jedną czwartą objętości roztworu 10 M LiCl. Krótko wymieszaj w vorteksie i pozostaw w temperaturze 4° C na noc w celu wytrącenia osadu.

Część 4: Izolacja RNA, dzień 2

1. Przed rozpoczęciem pracy podgrzać bufor SSTE w kąpieli wodnej o temperaturze 65° C.
2. Przenieść próbkę wytrąconą za pomocą LiCl do probówki polipropylenowej i odwirować RNA, centrifugując przy 11 000 rpm w rotorze o stałym kącie SS34 (14 450 xg) przez 30 minut w temperaturze 4° C.
3. Po wirowaniu zlać i usunąć ciecz, a następnie odwrócić probówki na chusteczkach Kimwipes na około 1 minutę. Odessać pipetą pozostały supernatant.
4. Resuspendować każdy osad w 800 μL podgrzanego buforu SSTE, używając pipety do dokładnego wymieszania próbek. Przenieść zresuspendowaną próbkę do 2 mL probówek do mikrowirowania Ambion wolnych od RNazy.
5. Podgrzewać próbki w temperaturze 65° C przez 2 minuty, a następnie intensywnie mieszać w wirówce typu vortex, aby zapewnić całkowitą resuspensję.
6. Do każdej probówki z próbką dodać taką samą objętość fenolu z chloroformem o pH8. Mieszać każdą próbkę w wirówce typu vortex przez 30 sekund, a następnie wirować w mikrowirowarce przy 14 000 rpm przez 3 minuty.
7. Przenieść fazę wodną do nowej 2 mL probówki do mikrowirowania Ambion wolnej od RNazy i dodać taką samą objętość chloroformu. Mieszać każdą próbkę w wirówce typu vortex przez 30 sekund i wirować w mikrowirowarce przy 14 000 rpm przez 3 minuty.
8. Przenieść fazę wodną do probówek Phase-Lock Gel, które zostały uprzednio przygotowane poprzez wirowanie przy 11 000 rpm przez 2 minuty. Dodać połowę objętości chloroformu i delikatnie wymieszać pipetą.
9. Wirować przy 11 000 rpm przez 5 minut i przenieść fazę wodną do nowych 2 mL probówek do mikrowirowania Ambion wolnych od RNazy.

Część 5: Wytrącanie RNA i przemywanie etanolem

1. Do fazy wodnej dodać 50 μL octanu sodu 3.0 M, pH 4.8, oraz 1 mL 100% etanolu. Wymieszać na wortexie i wytrącić w temperaturze -80° C przez 30 minut lub przez noc w temperaturze -20° C.
2. Próbki wirować w mikrowirówce z prędkością 14 000 rpm przez 30 minut w temperaturze 4° C, a następnie ostrożnie odessać nadsącz. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu.
3. Osady RNA przemyć 1 mL 70% (v/v) etanolu w temperaturze -20° C. Wirować w mikrowirówce z prędkością 14 000 rpm przez 1 minutę i odessać etanol.
4. Powtórzyć krok 5.3.
5. Zdjąć nakrętki z probówek i pozostawić osady do wysuszenia na powietrzu na blacie przez 3-5 minut.

Część 6: Końcowe resuspensowanie i kwantyfikacja

1. Każdy osad zawiesić ponownie w 100 μL wody traktowanej DEPC. Wymieszać za pomocą wortexa i inkubować probówki w temperaturze 65° C przez 2 minuty, a następnie umieścić na lodzie. W razie potrzeby powtórzyć czynność, aby zapewnić pełne zawieszenie próbki.
2. Jeśli jest to pożądane, połączyć podobne próbki i przygotować 50 μL rozcieńczenia 1:10 w 10mM Tris, pH 7.5, do oznaczania ilościowego spektrofotometrycznie. Stosunki absorbancji 260/280 oraz 260/230 są zazwyczaj większe niż odpowiednio 2,1 i 2,2. Wytrzymałość izolacji RNA wynosi od 60-120μg/g mrożonej tkanki.
3. Próbki przeanalizować, nakładając 1,5-2,5 μg RNA na 1% żel agarozowy w buforze TAE. W przypadku próbek szczególnie istotnych przeanalizować RNA za pomocą urządzenia Agilent 2100 Bioanalyzer zgodnie z instrukcjami producenta.

Reprezentatywne wyniki:

Wydajność izolacji RNA z różnych tkanek drzew iglastych mieści się w zakresie 60-120 μg/g zamrożonej tkanki, przy czym próbki zdrewniałe zazwyczaj dają około 70-80 μg/g zamrożonej tkanki. Diagnostyczne stosunki 260/280 oraz 260/230 są zazwyczaj większe niż 2,1 i stanowią dobre wskaźniki tego, że próbka RNA jest odpowiednio wolna od istotnych zanieczyszczeń fenolowych lub węglowodanowych. Próbki analizowane metodą elektroforezy w żelu agarozowym z późniejszym barwieniem EtBr powinny wykazywać trzy wyraźne prążki dla RNA 25S, 18S i 5S (Rysunek 1). Określenie stechiometrii 28S do 18S na żelach agarozowych jest w pewnym stopniu subiektywne, a czynniki takie jak warunki prowadzenia żelu, barwienie i ilość naniesionej próbki mogą mieć wpływ na wynik. Generalnie stosunek 28S:18S wydaje się być > 1,5. Jednak niektóre próbki z drzew iglastych wykazują niższe wartości. Na przykład w analizach za pomocą Agilent 2100 odnotowano kilka przypadków próbek z różnych typów tkanek drzew iglastych, w których stechiometria była bliższa 1,2:1. Zatem pozornie niska stechiometria 28S:18S w elektroforezie żelowej nie musi oznaczać niskiej jakości próbki. Próbki liści, pędów i szyszek często wykazują dodatkowe wyraźne prążki ze względu na obecność rybosomalnych RNA chloroplastowych. Materiały barwione EtBr, które nie migrują z dołka startowego lub prążki o wysokiej masie cząsteczkowej (>8-10 kb), zazwyczaj wskazują na zanieczyszczenie genomowym DNA (Rysunek 2). Rozmycia o niskiej masie cząsteczkowej w okolicy lub poniżej prążka 5S, słabsze barwienie prążków rybosomalnych lub pozorna stechiometria 18S > 28S są dobrymi wskaźnikami zajścia degradacji RNA (Rysunek 3). W analizie elektroferogramu Agilent 2100 linia bazowa powinna być niska i stosunkowo gładka, z głównymi pikami odpowiadającymi rybosomalnym RNA 18S i 28S, przy stosunkach 28S:18S w zakresie od 1,2 do 2,0. Wartość RNA Integrity Number (RIN) z systemu Agilent może być lepszym predyktorem jakości RNA i powinna wynosić co najmniej 7 lub więcej dla RNA przeznaczonego do przygotowania celów do mikromacierzy. Rysunek 4 przedstawia typowy elektroferogram Agilent 2100 dla RNA z ksylemu ze stosunkiem 28S:18S równym 1,4 i wartością RIN wynoszącą 8,6, natomiast Rysunek 5 przedstawia słaby preparat RNA z ksylemu z bardzo wysoką linią bazową i wyraźną degradacją, o czym świadczy stosunek 28S:18S równy 0,65 i wartość RIN wynosząca 3,4.

Rysunek 1. Analiza żelu agarozowego wysokiej jakości RNA sosny. Ścieżka 1: standard NEB 1 kb; ścieżka 2 przedstawia typową izolację całkowitego RNA z ksylemu wtórnego sosny loblolly z charakterystycznymi prążkami rybosomalnymi 28S, 18S i 5S oraz widocznym stosunkiem 28S:18S >1.

Rycina 2.Analiza żelu agarozowego próbki RNA sosny zanieczyszczonej DNA genomicznym. Ścieżka 1, standard NEB 1 kb, ścieżka 2, próbka RNA z ksylemu wykazująca zanieczyszczenie DNA genomicznym.

Rycina 3.Analiza żelu agarozy próbki sosny wykazująca degradację RNA i kontaminację genomowym DNA. Ścieżka 1, marker NEB 1 kb, ścieżka 2, próbka RNA z ksylemu wykazująca kontaminację genomowym DNA i silną degradację RNA.

Rycina 4. Elektroferogram Agilent 2100 całkowitego RNA z ksylemu wyizolowanego opisaną metodą z ksylemu sosny loblolly. Stosunek 28S:18S wynosi 1,4, wartość RIN wynosi 8,6

Rysunek 5.Elektroferogram Agilent 2100 całkowitego RNA z wierzchołka apikalnego, wykazujący silną degradację oraz zanieczyszczenie genomowe. Stosunek 28S:18S wynosi 0,65, wartość RIN wynosi 3,4

Dyskusja

Uzyskanie wysokiej jakości RNA z gatunków iglaków może być trudnym zadaniem ze względu na wysoką zawartość związków fenolowych i polisacharydów występujących w tkankach zdrewniałych. Opierając się na protokole opracowanym przez Chang i wsp. (1), stwierdziliśmy, że bardziej rygorystyczne etapy ekstrakcji i oczyszczania prowadzą do spójnej izolacji całkowitego RNA bardzo wysokiej jakości z różnych tkanek zdrewniałych i niezdrewniałych pobranych od szerokiej gamy gatunków iglaków. W tym filmie zaprezentowano nie tylko nasz ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do izolacji RNA			2% CTAB (bromek heksadecylotrimetylammonium), 2% PVP (poliwinylo-pirolidon; Mw 30-40 000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L espermidyny
Chloroform	Fisher Scientific	C298-4
Fenol, Ultrapure	Invitrogen	15509-037
10M LiCl			Przygotowano z wody traktowanej DEPC
Bufor SSTE			1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
Octan sodu (NaOAc) 3M pH4.8			Przygotowano z wody traktowanej DEPC
Fenol-chloroform (pH8.0)			120mL fenolu, 160mL chloroformu miareowanego wielokrotnymi zmianami 0.5M Tris-Cl pH 8.0
Teflonowe probówki do wirowania wysokich prędkości Oak Ridge	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-16B
Polipropylenowe probówki do wirowania wysokich prędkości 50mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#05-562-10K
BD Falcon, sterylne, zakręcane stożkowe probówki jednorazowe 50mL	VWR international	#21008-939
Phase Lock Gel Heavy, 2mL	Thermo Fisher Scientific, Inc.	#2302830
Probówki do mikrowirowarki wolne od RNaz Ambion, 2mL	Ambion	#AM12425