Oznaczanie reaktywności i miana surowicy za pomocą testu hemaglutynacji

Podsumowanie

Hemaglutynacja jest rodzajem aglutynacji, w której przeciwciała wiążą się z erytrocytami. Erytrocyty są łatwo dostępne, a wyniki można łatwo zaobserwować gołym okiem. Ten film prezentuje etapy przeprowadzania testu hemaglutynacji, interpretację wyników oraz wyznaczanie miana.

Streszczenie

Hemaglutynacja jest specyficzną formą aglutynacji, stosowaną w przypadku wiązania przeciwciał z erytrocytami, które pełnią rolę antygenu cząsteczkowego. Erytrocyty są szczególnie użytecznymi celami, ponieważ są łatwo dostępne, a aglutynację można zaobserwować gołym okiem. Technika ta jest powszechnie wykorzystywana do określania miana przeciwciał (Ab), w określaniu grup krwi oraz w miareczkowaniu wirusów. W niniejszym filmie zaprezentowano etapy przygotowania i przeprowadzenia testu hemaglutynacji z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla antygenów grupy krwi A dodanych do erytrocytów (Revercells). Antyserum poddaje się rozcieńczeniom seryjnym w 96-dołkowej mikro płytce titracyjnej z wypukłym dnem (U-bottom), do której dodawana jest zawiesina Revercells. Próbki są mieszane, a następnie inkubowane w temperaturze 37°C przez 60 minut. Po tym czasie próbki można łatwo ocenić pod kątem reakcji hemaglutynacji ujemnych (-ve), dodatnich (+ve) oraz pośrednich (-/+). Podejście to pozwala na ocenę reaktywności i miana próbki surowicy przy użyciu szybkiej i prostej techniki. Film obejmuje teorię stojącą za testem, sposób odczytu i interpretacji wyników, metodę wyznaczania miana, możliwości modyfikacji testu oraz problemy związane z zastosowaniem tej techniki.

Protokół

Przygotowanie 5x soli fizjologicznej z buforem weronalowym (VBS)

1. W celu przygotowania soli fizjologicznej buforowanej weronalem (VBS) należy przygotować trzy oddzielne roztwory.
2. Roztwór 1 przygotowujemy poprzez rozpuszczenie 21.25gm NaCl i 0.94gm barbitonianu sodu w 350ml wody destylowanej. Końcowe stężenia NaCl i barbitonianu sodu wynoszą odpowiednio 1.02M oraz 13mM.
3. Roztwór 2 przygotowujemy poprzez rozpuszczenie 1.44gm barbitonianu w 125ml gorącej wody destylowanej. Końcowe stężenie barbitonianu wynosi 62.5mM.
4. Roztwór 3 przygotowujemy poprzez rozpuszczenie 20.33gm MgCl₂ i 4.41gm CaCl₂ w 100ml wody destylowanej. Końcowe stężenia MgCl₂ i CaCl₂ wynoszą odpowiednio 2.18M oraz 440mM.
5. Wymieszać roztwory 1 i 2, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.
6. Po ochłodzeniu połączonego roztworu dodać 1.25 ml roztworu 3 i dostosować pH do wartości 7.3-7.5 za pomocą 1M HCl.
7. Dopełnić objętość końcową wody destylowaną do 500ml, aby przygotować 5-krotny roztwór zapasowy.
8. Aby przygotować 1-krotny roztwór roboczy, należy rozcieńczyć roztwór zapasowy w stosunku 1:5 wodą destylowaną.

Rozcieńczanie Revercells

1. Delikatnie resuspenduj roztwór stokowy Revercells poprzez odwracanie probówki, a następnie pobierz 1ml komórek i wiruj przez 5 min przy 600g w temperaturze 4°C.
2. Po wirowaniu ostrożnie usuń nadsącz i resuspenduj komórki w 3ml 1x Veronal Buffered Saline.
3. Komórki można teraz przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia.

Procedura

1. Przenieś 50ml 1x VBS do dołków A1-A12 płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U.
2. Do dołka A1 dodaj 50μl surowicy anty-A i wymieszaj dokładnie za pomocą pipety.
3. Używając nowej końcówki do pipety, pobierz 50μl cieczy z dołka A1 i przenieś ją do dołka A2. Wymieszaj dokładnie i powtarzaj ten proces, aż dojdziesz do dołka A11, a następnie odrzuć ostatnie 50μl z tego dołka.
4. Próbka surowicy została w ten sposób rozcieńczona seryjnie 2-krotnie, od 1:2 do 1:2048. Do dołka A12 nie dodaje się surowicy, ponieważ służy on jako ujemna kontrola VBS.
5. Jeśli do oceny przeznaczono więcej niż jedną próbkę surowicy, powtórz kroki 4.1-4.4 dla rzędu B itd.
6. Po przygotowaniu wszystkich rozcieńczeń dodaj 50μl 1% Revercells do wszystkich dołków. Uwaga: Revercells z czasem osiadają i powinny zostać delikatnie zawieszone przed dozowaniem do dołków.
7. Wymieszaj próbki, delikatnie stukując w bok płytki mikrotitracyjnej, przykryj i pozostaw reakcję hemaglutynacji na 1h w temperaturze 37°C. Można użyć inkubatora lub odpowiednio ogrzanego pomieszczenia.
8. Po inkubacji ostrożnie wyjmij płytkę z inkubatora i sprawdź obecność hemaglutynacji. Pierwszym sprawdzanym dołkiem powinien być dołek kontrolny VBS. Jeśli reakcja jest ujemna, wyniki są prawidłowe. Jeśli próbka VBS wykazuje pozytywny wynik hemaglutynacji, wyniki nie mogą zostać wykorzystane i należy powtórzyć cały proces. Pozytywna reakcja hemaglutynacji objawia się jako szeroka warstwa na dnie dołka, natomiast reakcja ujemna jako mały, skoncentrowany osad komórek w centrum dołka. Wynik pośredni będzie charakteryzował się obecnością pierścienia komórek pozytywnych z centralnym rdzeniem osadzonych komórek. Wynik ten występuje, gdy surowica zawiera pewną ilość Ab zdolnych do reakcji, ale jest ich zbyt mało, aby wywołać pełną reakcję.
9. Sekcja wyników reprezentatywnych zawiera dwa schematyczne przedstawienia oczekiwanych wyników. Podano przykład nieprawidłowego oraz prawidłowego zestawu wyników. Wyznaczone zostanie również miano dla antysurowicy.

Reprezentatywne wyniki:

Film zawiera przykład reprezentatywnych wyników. Poniżej (Ryc. 1 i Ryc. 2) przedstawiono dwa przykłady w formie schematycznej. Pierwszy przykład przedstawia reakcję, której nie można zinterpretować, ponieważ kontrola VBS jest dodatnia, natomiast drugi jest prawidłowym testem, który pozwala na oznaczenie miana.

Rycina 1. Przykład hemaglutynacji, w której wynik dodatni jest błędny. Na powyższej reprezentacji schematycznej reakcja hemaglutynacji nie może zostać zaakceptowana. Negatywna kontrola surowicy VBS wykazuje dodatnią reakcję hemaglutynacji, o czym świadczy powstanie warstwy (sheet formation) u podstawy dołka. Wskazuje to na wystąpienie błędu i brak możliwości zaakceptowania wyników. W takim przypadku proces należy powtórzyć.

Rysunek 2. Przykład hemaglutynacji, w której wynik pozytywny został uzyskany prawidłowo. W przedstawieniu schematycznym reakcja hemaglutynacji jest prawidłowa. Kontrola negatywna VBS wykazuje negatywną reakcję hemaglutynacji, o czym świadczy osad utworzony na dnie dołka. Ostatnim pozytywnym dołkiem jest rząd 7, co wskazuje, że miano dla tej próbki surowicy wynosi 128 (tj. odwrotność 1/128). Jest to przykład przeciwciała występującego w surowicy w umiarkowanej ilości.

Dyskusja

Test aglutynacji jest bardzo prostą techniką, która pozwala na ocenę licznej grupy próbek surowicy w krótkim czasie. Zaletą tej metody jest możliwość odczytu bez użycia specjalistycznego sprzętu, gdyż wystarczający jest wzrok obserwatora. Technikę tę można również zmodyfikować w celu wykrywania hormonu gonadotropiny kosmórki ludzkiej w moczu, jako element testu inhibicji aglutynacji. W odniesieniu do standardowego testu aglutynacji istnieje kilka obszarów, w których należy zachować ostrożność, aby badanie zostało przepro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Revercells	CSL	02490201	Stosować w stężeniu końcowym 1%
Surowica przeciwciała anty-A	CSL	02611305
Płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery U	TRP	92097	Musi być z dnem w kształcie litery U
Bufor solny Veronal			Stosować w stężeniu końcowym 1x
Pomieszczenie/inkubator 37°C
Rękawiczki jednorazowe