Oznaczanie reaktywności i miana surowicy za pomocą testu hemaglutynacji

Podsumowanie

Hemagglutynacja to forma aglutynacji, w której przeciwciała wiążą się z czerwonymi krwinkami. Czerwone krwinki są zarówno łatwo dostępne, jak i wyniki można łatwo zaobserwować gołym okiem. Ten film pokazuje etapy testu hemaglutynacji, interpretację wyników i określenie miana.

Streszczenie

Hemagglutynacja jest specyficzną formą aglutynacji i jest stosowana, gdy przeciwciała wiążą się z czerwonymi krwinkami, które działają jak antygen cząsteczkowy. Czerwone krwinki są szczególnie użytecznym celem, ponieważ są łatwo dostępne, a aglutynację można zaobserwować gołym okiem. Technika ta jest powszechnie stosowana do określania miana przeciwciała (Ab) do oznaczania grupy krwi i oznaczania ilościowego wirusa. W tym filmie pokazano etapy przygotowania i przeprowadzenia testu hemaglutynacji przy użyciu przeciwciał specyficznych dla antygenów grupy A krwi dodanych do czerwonych krwinek (Revercells). Surowicę odpornościową rozcieńcza się seryjnie w 96-dołkowej tacce do mikromiareczkowania z dnem w kształcie litery U, do której dodaje się zawiesinę Revercells. Próbki miesza się, a następnie inkubuje w temperaturze 37°C przez 60 minut. Po tym czasie próbki można łatwo ocenić pod kątem ve, +ve i pośrednich (-/+) reakcji hemaglutynacji. Takie podejście pozwala na ocenę reaktywności i miana próbki surowicy przy użyciu szybkiej i prostej techniki. Film będzie obejmował teorię stojącą za testem, sposób odczytywania i interpretowania wyników, sposób oznaczania miana, sposób modyfikacji testu oraz wszelkie kwestie związane ze stosowaniem tej techniki.

Protokół

Przygotowanie 5x soli fizjologicznej buforowanej weronalem (VBS)

1. Aby przygotować sól fizjologiczną buforowaną weronalem (VBS), należy przygotować trzy oddzielne roztwory.
2. Przygotuj roztwór 1, rozpuszczając 21,25 g NaCl i 0,94 g barbitonu sodu w 350 ml wody destylowanej. Końcowe stężenia NaCl i barbitonu sodu wynoszą odpowiednio 1,02 M i 13 mM.
3. Przygotuj roztwór 2, rozpuszczając 1,44 g barbitonu w 125 ml gorącej wody destylowanej. Końcowe stężenie barbitonu wynosi 62,5 mM.
4. Przygotować roztwór 3, rozpuszczając 20,33 g MgCl₂ i 4,41 g CaCl₂ w 100 ml wody destylowanej. Końcowe stężenie MgCl₂ i CaCl₂ wynosi odpowiednio 2,18 M i 440 mM.
5. Wymieszaj roztwory 1 i 2 i ostudź do temperatury pokojowej.
6. Po ostygnięciu połączonego roztworu dodać 1,25 ml roztworu 3 i dostosować pH do 7,3-7,5 za pomocą 1M HCl.
7. Dostosuj końcową objętość do 500 ml z wodą destylowaną, aby przygotować 5x roztwór podstawowy.
8. Aby przygotować 1x roztwór roboczy, rozcieńczyć bulion 1:5 wodą destylowaną.

Rozcieńczenie Revercells

1. Delikatnie zawiesić roztwór podstawowy Revercells przez odwrócenie, a następnie usunąć 1 ml komórek i odwirować przez 5 minut w 600 g w temperaturze 4°C.
2. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej weronalem.
3. Ogniwa można teraz przechowywać w temperaturze 4°C do czasu użycia.

Procedura

1. Przenieś 50 ml 1x VBS do rzędów A1-A12 96-dołkowej płytki dolnej U.
2. Do dołka A1 dodaj 50 μl surowicy anty-A i dokładnie wymieszaj za pomocą pipety.
3. Za pomocą świeżej końcówki do pipety usuń 50 μl płynu z dołka A1 i przenieś go do dołka A2. Dokładnie wymieszaj i powtarzaj ten proces, aż osiągniesz dołek A11, a następnie wyrzuć ostatnie 50 μl z tego dołka.
4. Próbka surowicy została teraz seryjnie rozcieńczona 2-krotnie od 1:2 do 1:2048. Do dołka A12 nie dodaje się surowicy, ponieważ jest to kontrola ujemna VBS.
5. Jeżeli ma zostać oceniona więcej niż jedna próbka surowicy, należy powtórzyć kroki 4.1-4.4 dla rzędu B itd.
6. Po wykonaniu wszystkich rozcieńczeń dodaj 50 μl 1% Revercells do wszystkich studzienek. Uwaga: Revercells z czasem osiądzie i należy je delikatnie zawiesić przed dozowaniem do studzienek.
7. Wymieszać próbki, delikatnie stukając w bok tacki do mikromiareczkowania, przykryć i pozostawić reakcję hemaglutynacji na 1 godzinę w temperaturze 37°C. Można zastosować inkubator lub odpowiednio ogrzewane pomieszczenie.
8. Po inkubacji ostrożnie wyjąć tackę z inkubatora i zbadać płytkę pod kątem hemaglutynacji. Studzienka kontrolna VBS powinna być pierwszą zbadaną studnią. Jeśli reakcja jest negatywna, wyniki są ważne. Jeśli próbka VBS wykaże dodatni wynik hemaglutynacji, wyniki nie mogą być wykorzystane i proces należy powtórzyć. Pozytywna reakcja hemaglutynacji pojawi się jako szeroki arkusz na dnie studzienki, podczas gdy negatywna reakcja pojawi się jako mała skoncentrowana osada komórek w środku studzienki. Wynik pośredni będzie miał aureolę komórek dodatnich z centralnym rdzeniem komórek granulowanych. Wynik ten występuje, ponieważ surowica ma pewną ilość Ab, która może reagować, ale niewystarczającą ilość Ab, aby wywołać pełną reakcję.
9. Sekcja reprezentatywnych wyników zawiera dwie diagramowe reprezentacje oczekiwanych wyników. Podano przykład nieprawidłowego i prawidłowego zestawu wyników. Zostanie również określone miano surowicy anty-surowicy.

Reprezentatywne wyniki:

Film zawiera przykład reprezentatywnych wyników. Poniżej (Rys. 1 i Rys. 2) znajdują się dwa przykłady pokazane w schematyczny sposób. Pierwszy przykład dotyczy reakcji, której nie można zinterpretować jako dodatniej kontroli VBS, podczas gdy drugi jest prawidłowym testem, który pozwala na określenie miana.

Rysunek 1. Przykład hemaglutynacji, w której wynik dodatni nie powiódł się. Na powyższym schemacie nie można zaakceptować reakcji hemaglutynacji. Ujemna kontrola surowicy VBS wykazuje dodatnią reakcję hemaglutynacji, o czym świadczy tworzenie się arkusza u podstawy odwiertu. Oznacza to, że wystąpił błąd i nie można zaakceptować wyników. W takim przypadku proces należy powtórzyć.

Rysunek 2. Przykład hemaglutynacji, w której pozytywny wynik zadziałał prawidłowo. W przedstawieniu schematycznym reakcja hemaglutynacji jest prawidłowa. Kontrola ujemna VBS wykazuje ujemną reakcję hemaglutynacji, o czym świadczy osad, który utworzył się u podstawy studni. Ostatnim dodatnim dołkiem jest wiersz 7, co wskazuje, że miano dla tej próbki surowicy wynosi 128 (tj. odwrotność 1/128). Byłby to przykład przeciwciała, które jest obecne w umiarkowanych ilościach w surowicy.

Dyskusja

Test hemaglutynacji jest bardzo prostą techniką, która pozwala na ocenę dużej liczby próbek surowicy w krótkim czasie. Ma również tę zaletę, że można go czytać bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu, a oko jest odpowiednie. Technika ta może być również zmodyfikowana w celu wykrywania ludzkiego hormonu gonadotropiny kosmówkowej obecnego w moczu, w ramach testu hamowania hemaglutynacji. W porównaniu ze standardowym testem hemaglutynacji istnieje kilka obszarów, w których należy zachować ostrożność, aby test ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Revercells	CSL	02490201	Stosować w 1% końcowej
surowicy anty-A	CSL	02611305
96-dołkowa dolna płytka U	TRP	92097	Musi to być
sól fizjologiczna			Stosować w 1x
końcowej 37° Pomieszczenie C/inkubator
Rękawiczki