Disekcja i hodowla neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego

Podsumowanie

W tym filmie zaprezentowano metodę preparowania i hodowli neuronów komisuralnych z grzbietowej części rdzenia kręgowego szczura w 13. dniu embrionalnym (E13). Dysocjowane neurony komisuralne są użyteczne w badaniu komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów.

Streszczenie

Neurony komisuralne są szeroko wykorzystywane do badania mechanizmów leżących u podstaw prowadzenia aksonów podczas embrionalnego rozwoju rdzenia kręgowego. Ciała komórkowe tych neuronów znajdują się w grzbietowej części rdzenia kręgowego, a ich aksony podążają stereotypowymi trajektoriami w trakcie rozwoju embrionalnego. Aksony komisuralne początkowo kierują się brzusznie w stronę płyty dna. Po przekroczeniu linii środkowej aksony te skręcają przednio i kierują się w stronę mózgu. Każdy z tych etapów jest regulowany przez działanie kilku sygnałów prowadzących. Kultury silnie wzbogacone w neurony komisuralne są idealnie dostosowane do wielu eksperymentów dotyczących mechanizmów wyznaczania drogi przez aksony, w tym testów skrętu, immunochemii i biochemii. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji i hodowli neuronów komisuralnych z grzbietowej części rdzenia kręgowego szczura w 13. dniu embrionalnym (E13). Najpierw izoluje się rdzeń kręgowy i wycina paski tkanki grzbietowej. Następnie tkankę grzbietową dysocjuje się do postaci zawiesiny komórkowej poprzez trypsynizację i rozbicie mechaniczne. Neurony wysiewa się na szkiełka podstawowe lub naczynia hodowlane pokryte poli-L-lizyną. Po 30 godzinachin vitro, większość neuronów wytworzyła akson. Czystość hodowli (Yamet al.2009), zazwyczaj powyżej 90%, można ocenić za pomocą immunoznakowania markerami neuronów komisuralnych DCC, LH2 oraz TAG1 (Helms i Johnson, 1998). Ta preparatka neuronalna stanowi użyteczne narzędzie doin vitrobadania nad komórkowymi i molekularnymi mechanizmami wzrostu i prowadzenia aksonów komisuralnych podczas rozwoju rdzenia kręgowego.

Protokół

1. Disekcja grzbietowej części rdzenia kręgowego zarodka szczura

Ogólne zalecenia

Pożywkę L-15 należy przechowywać w lodzie i często wymieniać w naczyniu do sekcji, aby utrzymać niską temperaturę embrionów. Pomaga to zachować integralność tkanek. Wszystkie etapy są wykonywane za pomocą dwóch par pęset Dumont #5, chyba że zaznaczono inaczej. Aby uniknąć kontaminacji, należy spryskać wszystkie narzędzia i powierzchnie robocze 70% etanolem oraz utrzymywać zamkniętą butelkę z pożywką do sekcji. Do przenoszenia embrionów między naczyniami należy użyć uciętej plastikowej pipety lub dziurawatej łyżki. Kluczowe dla powodzenia sekcji jest uniknięcie uszkodzenia rdzenia kręgowego (nacięcia, naciągnięcia).

Przygotowanie

• Zimna pożywka L-15
• 50 mL pożywki L-15 + 10% inaktywowanej termicznie surowicy konia (HiHS). Przechowywać w lodzie.

Disekcja rdzenia kręgowego

1. Uśmierć szczura w 13. dniu ciąży (E13, gdzie E0 to pierwszy dzień po kopulacji) w komorze z CO₂ zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Spryskać brzuch 70% etanolem. Chwycić i unieść skórę w dolnej części brzucha pęsetą i rozciąć nożyczkami chirurgicznymi. Powtórzyć czynność, przecinając warstwy mięśni i otrzewnej, aby dotrzeć do jamy brzusznej. Wykonać nacięcie w kształcie litery V, rozcinając tkankę wzdłuż boków brzucha aż do klatki piersiowej. Unieść i odsunąć tkankę, aby odsłonić jamę brzuszną.
3. Macica jest przytwierdzona w trzech miejscach: w dolnej części środka brzucha oraz w obu górnych rogach bocznych. Unieść macicę, chwytając tkankę pomiędzy workami zarodkowymi. Przeciąć tkankę łączną, aby usunąć macicę i umieścić ją w szalce Petriego wypełnionej pożywką L-15 na lodzie.
4. Kolejne kroki wykonuje się pod mikroskopem sekcyjnym. Aby oddzielić embrion od tkanek pozazarodkowych i błon zarodkowych, chwycić tkankę między workami macicznymi jedną pęsetą. Drugą pęsetą ucisnąć bardziej przezroczystą stronę worka, aby przeciąć błony powierzchowne (ciemniejsza strona to łożysko). Wysunąć embrion, delikatnie uciskając stronę łożyska worka. Usunąć wszystkie embriony i umieścić je w szalce Petriego wypełnionej pożywką L-15 na lodzie.
5. Umieścić jeden embrion w 10 cm szalce Petriego wypełnionej lodowatą pożywką L-15. Za pomocą mikronożyczek odciąć głowę oraz części tylne pod kątami pokazanymi na rysunku 1a.
   
   Cięcie pod tymi kątami ułatwi ułożenie embrionu po umieszczeniu go „brzuszem do dołu”.
   
   
6. Ułożyć embrion „brzuszem dołu” (przód skierowany od operatora, tył skierowany w stronę operatora) (rys. 1b).
7. Mocno przytrzymać embrion z jednej strony, używając pęsety do „przypięcia” go (rys. 1c). Nie przesuwać pęsety, ponieważ może to rozedrzeć tkankę. Drugą pęsetą odwarstwić skórę pokrywającą grzbiet embrionu, zaczynając od obszaru między pęsetą „trzymającą” (rys. 1d-e). Odsłoni to rdzeń kręgowy, który w tym momencie jest owinięty błonami (oponami).
   
   Chwytać skórę po bokach, a nie bezpośrednio nad rdzeniem kręgowym, aby uniknąć jego uszkodzenia.
   
   
8. fueling Częściowo oddzielić tkankę po prawej stronie rdzenia kręgowego (rys. 1f). Zaczynając od poziomu pęsety trzymającej, nakłuć tkankę zamkniętą pęsetą tak blisko rdzenia kręgowego, jak to możliwe. Następnie powoli rozewrzeć pęsetę, aby przerwać tkankę. Powinno to oddzielić zwoje korzeni grzbietowych (DRGs) od rdzenia kręgowego oraz usunąć organy brzuszne. Pozostawić część tkanki przytwierdzonej na końcach przednim i tylnym. Pozostawienie przytwierdzonej tkanki zwiększa masę embrionu, co zapobiega jego unoszeniu się podczas następnego kroku. Ponadto tkanka ta służy do trzymania embrionu w późniejszych etapach.
9. Zaczynając od końca przedniego, użyć haczykowatej igły wolframowej, aby przeciąć opony i otworzyć rdzeń kręgowy wzdłuż płytki dachowej (rys. 1g).
10. Obrócić embrion o 180 stopni (tył skierowany od operatora, przód skierowany w stronę operatora) (rys. 1h).
    
    Pozwala to operatorowi użyć tej samej ręki do oddzielenia tkanki z drugiej strony embrionu.
    
    
11. Przytrzymać embrion, chwytając za wcześniej oddzieloną stronę, i usunąć tkankę z pozostałej strony tą samą metodą (patrz pkt 1.8.). Po zakończeniu całkowicie oddzielić tkankę po obu stronach rdzenia kręgowego.
    Alternatywnie: Całkowicie oddzielić tkankę pozostałą po lewej stronie, ale pozostawić część tkanki przytwierdzonej na końcach przednim i tylnym po prawej stronie. Może to czasami pomóc w utrzymaniu rdzenia kręgowego w pozycji w kroku 1.12.
12. Położyć rdzeń kręgowy na boku i usunąć większość pozostałej tkanki mezenchymalnej oraz DRGs (rys. 1i).
13. Na tym etapie opony i rdzeń kręgowy stanowią dwie „warstwy” tkanki przylegające do siebie. Przypiąć większą, najbardziej przednią część rdzenia kręgowego i oddzielić krótki odcinek opon od rdzenia (rys. 1j, lewo). Następnie chwycić oba oddzielone segmenty pęsetą i odwarstwić opony płynnym, jednostajnym ruchem (rys. 1j).
    Nierównomierne „odwarstwianie” doprowadzi do przerwania rdzenia kręgowego i/lub warstwy opon. Zazwyczaj nie jest możliwe odzyskanie części rdzenia kręgowego, która pozostała przytwierdzona do opon.
14. Za pomocą plastikowej pipety przenieść wyizolowany rdzeń kręgowy do szalki Petriego zawierającej L-15 + 10% HiHS i pozostawić na lodzie. Zazwyczaj rdzenie kręgowe ze wszystkich embrionów zbiera się przed sekcją części grzbietowych.

Disekcja grzbietnej części rdzenia kręgowego

15. Umieść jeden rdzeń kręgowy w szalce Petriego zawierającej L-15+10% HiHS, kładąc go płasko w konfiguracji „otwartej książki”. Odetnij szerszą, przednią część (która obejmuje część tylnego mózgu) (rys. 1k).
16. Tkanka grzbietowa znajduje się w najbardziej bocznych częściach rdzenia kręgowego (rys. 1l, lewo). Przytrzymując rdzeń prostą igłą wolframową, użyj L-kształtnej igły wolframowej, aby wyciąć pasek o szerokości stanowiącej 1/5 połowy szerokości rdzenia kręgowego (rys. 1l, prawo). Umieść paski grzbietowe w plastikowej probówce o pojemności 15 mL zawierającej L-15 + 10% HiHS na lodzie.
    Przekroje grzbietowej rury nerwowej z około 12 embrionów E13 dostarczą około 3,5-4 milionów komórek do wysiewu po dysocjacji. Więcej komórek można uzyskać, przeprowadzając grubszą dyssekcję grzbietowej części rdzenia kręgowego (wycinając szersze paski grzbietowe), jednak czystość neuronów komisuralnych ulegnie zmniejszeniu.

2. Hodowla neuronów komisuralnych

Ogólne zalecenia

Wszystkie etapy należy przeprowadzać w warunkach sterylnych w komorze do hodowli tkanek, chyba że wskazano inaczej. Należy używać świeżego medium oraz świeżo rozmrożonych suplementów i odczynników. Etapy dysocjacji i tryturacji przeprowadza się w Ca²⁺/Mg²⁺-wolny HBSS w celu zminimalizowania zawartości Ca²⁺/Mg²⁺adhezja zależna od ligandów

Przygotowanie

• szkełek podstawkowych pokrytych warstwą (użyć szkła German Desag) lub płytek do hodowli tkankowej (patrz procedura pokrywania poniżej).
• ciepłej pożywki Neurobasal do wysiewu (patrz poniżej), w naczyniach do hodowli tkankowej, wyrównanej pod kątem CO₂ w inkubatorze do hodowli tkankowej przez co najmniej 1,5 h przed wysiewem.
• 2,5% trypsyny w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C
• 2 butelek HBSS wolnego od Ca²⁺/Mg²⁺, jednej w temperaturze 4 °C, drugiej w 37 °C.
• dwóch wypalanych szklanych pipet Pasteura – jednej o średnicy o połowę mniejszej od standardowej i jednej o średnicy nieco mniejszej niż połowa. Należy używać sterylnych pipet Pasteura. Aby wypalić pipety, użyć palnika Bunsena (górna część jasnoniebieskiego płomienia), aby stopić końcówkę i nieznacznie zmniejszyć średnicę. Ponieważ ten krok jest wykonywany poza komorą do hodowli tkankowej, należy spryskać pipety 70% etanolem przed umieszczeniem ich w komorze. W celu bardziej efektywnego odzyskiwania neuronów, przed rozpoczęciem dysocjacji lub tuż przed etapem trituracji należy pokryć pipety Pasteura pożywką zawierającą serum (napełnić pipety pożywką i odczekać 30 sekund). Zapobiegnie to przywieraniu komórek do wewnętrznej ścianki pipety Pasteura podczas trituracji.
• sterylnej wody milliQ do płukania naczyń lub szkiełek podstawkowych pokrytych PLL
• 12,5% roztworu MgSO₄ w HBSS

Powlekanie poli-L-lizyną

W przypadku stosowania szklanych szkiełek nakrywkowych, należy je poddać myciu kwasowemu przez 24 godziny i wysterylizować przed wysiewaniem (patrz Kaech i Banker, 206). Należy używać szklanych szkiełek nakrywkowych firmy German Desag.

Aby pokryć szkiełka przedmiotowe lub plastikowe naczynia do hodowli tkanek poli-L-lizyną:

• pod dygestorium do hodowli tkanek pokryć powierzchnie niewielką kropelką roztworu PLL o stężeniu 10 ug/ml na 1,75-2 godziny.
• przemyć dwukrotnie wodą milliQ, przez co najmniej 5 minut podczas każdego płukania (można to przeprowadzić podczas poniższego etapu dysocjacji komórek).
• przechowywać w wodzie do momentu użycia. Nie dopuszczać do wyschnięcia powierzchni pokrytej PLL.
  Aby zmniejszyć zużycie PLL podczas pokrywania szkiełek podstawowych, należy umieścić szkiełka w sterylnych bakteriologicznych płytkach Petri. Pokrycie i płukanie szkiełek wykonuje się poprzez nakładanie kropelki cieczy na szkiełka. Płytki Petri są hydrofobowe, dzięki czemu ciecz powinna pozostać na szklanych szkiełkach. Przed samym wysiewaniem komórek należy przenieść szkiełka do naczyń do hodowli tkanek.
  W przypadku neuronów wysiewanych na plastikowe naczynia do hodowli tkanek adhezja jest zazwyczaj wyższa, co może skutkować ograniczonym wydłużaniem się neurytów.

Dysocjacja i wysiewanie

1. Upewnij się, że paski grzbietowe opadły na dno probówki. Usuń większość medium L-15+10% HiHS za pomocą pipety Pasteura. Szybko przemyj paski grzbietowej rurki nerwowej raz, dodając 3 ml zimnego (4 °C) HBSS.
2. Pozostaw paski grzbietowej rurki nerwowej na 2 minuty, aby opadły, a następnie usuń HBSS pipetą Pasteura.
3. Dodaj ciepły (37 °C) HBSS do objętości 4,7 ml. Następnie dodaj 0,3 ml 2,5% trypsyny, aby uzyskać stężenie końcowe 0,15% trypsyny.
4. Inkubuj w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 7 min. W połowie czasu inkubacji delikatnie wymieszaj zawartość raz.
5. Dodaj 30 μl DNAazy (25 0 U/mL), aby uzyskać stężenie końcowe 150 U/mL. Dodaj 60 μl MgSO₄ i krótko wymieszaj, aby uzyskać stężenie końcowe 0,15%.
   W przypadku tkanek z grubszych sekcji, inkubuj dodatkową 1 minutę w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.
   
   Na tym etapie fragmenty grzbietowej rurki nerwowej powinny ulec fragmentacji. Jeśli fragmenty grzbietowej rurki nerwowej nie zaczęły się rozpadać, zazwyczaj oznacza to, że zapas 2,5% trypsyny jest stary i należy rozmrozić nową partię lub przemywanie zimnym HBSS nie usunęło skutecznie HiHS z próbki.
6. Odwiruj fragmenty tkanki przy 20 g przez 4 min.
7. Usuń supernatant pipetą Pasteura, pozostawiając ~50-10 μl cieczy na dnie probówki.
8. Delikatnie uderz w probówkę, aby rozluźnić osad, a następnie przemyj komórki, dodając 5 ml ciepłego HBSS. Pozostaw do opadnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 min.
9. Odwiruj przy 20 g przez 5 min.
10. Usuń supernatant pipetą Pasteura, pozostawiając ~50-10 μl cieczy na dnie probówki.
11. Delikatnie uderz w probówkę, aby rozluźnić osad i częściowo resuspenderć komórki. Następnie dodaj 2 ml ciepłego HBSS.
12. Użyj małej (o połowę mniejszej średnicy) wypalanej szklanej pipety Pasteura, aby rozdzielić komórki, powoli pipetując w górę i w dół 4-6 razy. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza i pipetuj ciecz przy ściance probówki. Nie tryturuj nadmiernie.
13. Użyj najmniejszej wypalanej szklanej pipety Pasteura, aby dalej rozdzielać komórki, powoli pipetując w górę i w dół 3-4 razy. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza i pipetuj ciecz przy ściance probówki. Nie tryturuj nadmiernie.
    W przypadku tkanek z grubszych sekcji dodaj do probówki dodatkowy 1 ml ciepłego HBSS na koniec dysocjacji.
    Podczas dysocjacji komórek nie jest konieczne rozdzielenie wszystkich grudek i agregatów komórkowych. Przestań pipetować w górę i w dół lub zmień pipetę Pasteura na taką o mniejszej średnicy, jeśli zauważysz, że dalsze pipetowanie nie zmniejsza już rozmiaru agregatów komórkowych.
14. Pozostaw wszelkie pozostałe fragmenty tkanki w probówce na 1 min, aby opadły. Przenoszenie komórek do nowej probówki nie jest konieczne.
15. Pobierz 20 μl zawiesiny komórkowej i dodaj 5 μl błękitu trypanu. Policz komórki w komorze countingowej (hemocytometrze).
    Żywotność neuronów powinna wynosić ≥95% na podstawie wykluczenia błękitu trypanu.
16. Wysiej neurony w medium do wysiewania Neurobasal (patrz Przepisy poniżej).
    • Sugerowane gęstości wysiewu w celu uzyskania izolowanych neuronów (kultury o niskiej gęstości, aby uniknąć grudkowania neuronów lub ich nakładania się):
    • 120 0 - 180 0 komórek/dołek dla płytki 6-dołkowej
    • 60 0 - 75 0 komórek/dołek dla płytki 12-dołkowej
17. Po 16-18 godzinach wymień medium na medium wzrostowe Neurobasal (patrz Przepisy poniżej).
    Podczas wymiany medium nie używaj pompy próżniowej do aspiracji medium z naczynia hodowlanego; użyj delikatnie pipety. Zapobiega to odrywaniu się neuronów.

Reprezentatywne wyniki:

Cztery godziny po wysianiu neurony powinny przywrzeć do powierzchni pokrytej poli-L-lizyną (PLL). W świetle kontrastowym przywarte ciała komórkowe są zazwyczaj stosunkowo płaskie i owalne (rys. 2a). Komórki, które nie przywarły prawidłowo, wyglądają jak sfery, które lekko poruszają się podczas bardzo delikatnego stuknięcia w bok naczynia. Wiele czynników może potencjalnie utrudniać adhezję komórek (patrz sekcja dyskusja).

Po 30 godzinach in vitro większość neuronów wytworzyła akson z widocznym stożkiem wzrostu (rys. 2c,d). W przypadku zaobserwowania słabego wzrostu aksonów należy sprawdzić, czy podłoże Neurobasal Growth Media zostało przygotowane ze świeżego medium i suplementów. W tych warunkach neurony pozostają zdrowe przez co najmniej 6 dni. Wykazano, że procedura ta pozwala na niezawodne otrzymanie preparatów silnie wzbogaconych w neurony komisuralne, przy czym ~90% neuronów wykazuje ekspresję DCC (Yam et al. 2009). Szerokość paska grzbietowej części rdzenia kręgowego użytego do przygotowania zawiesiny komórkowej wpływa na czystość hodowli; zastosowanie cieńszych pasków pozwala uzyskać większą czystość. Przykład zastosowania przedstawiono na rysunku 3 (immunofluorescencja). Więcej przykładów znajduje się w artykule Yam et al. (209).

Rycina 1. Schematy etapów preparowania rdzenia kręgowego. D = grzbietowy, V = brzuszny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony schemat.

Rysunek 2.Reprezentatywny wynik dla wyizolowanych neuronów komisuralnych wysianych na szklaną okładkę pokrytą PLL. a,b) 4 godziny po wysianiu neurony przylgnęły do powierzchni. Pasek skali = 20 μmc,d) 30 godzin po wysiewaniu większość neuronów wytworzyła akson z widocznym stożkiem wzrostu. Pasek skali = 20 μm.

Rycina 3. Neuron komisuralny poddany immunostainingowi na gamma-tubulinę (zielony), z aktyną F oznakowaną falloidyną (aktyna F, czerwony) oraz jądrem oznakowanym DAPI (niebieski).

Przepisy i komentarze

Pożywka do wysiewu Neurobasal

• Neurobasal
• 10% heat-inaktywowana FBS (HiFBS)
• 2 mM L-glutamina (z roztworu stokowego 20 mM)
  Opcjonalnie: antybiotyki penicylina/streptomycyna (stosować w połowie normalnego stężenia)

Pożywka wzrostowa Neurobasal

• Neurobasal
• B27 (rozcieńczenie 1/50 z roztworu macierzystego)
• 2 mM L-glutamina (z 20 mM roztworu macierzystego)
• Opcjonalnie: antybiotyki penicylina/streptomycyna (użyć połowy standardowego stężenia)
  
  Po przygotowaniu pożywka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie. Aby wyrównać temperaturę i pH pożywki przed wysiewaniem komórek, należy przelać ją do szalek Petri do hodowli tkankowych i umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych na co najmniej 1,5 godziny.

Neurobasal

Po otwarciu butelki medium Neurobasal można je przechowywać przez miesiąc w temperaturze 4 °C w ciemności. Należy zutylizować medium Neurobasal, które było otwarte przez ponad miesiąc, w przeciwnym razie przeżywalność komórek będzie niższa.

Krowia surowica płodowa inaktywowana ciepłem (HiFBS) lub surowica konia (HiHS)

Aby termicznie dezaktywować FBS lub HS, podgrzewać je w kąpieli wodnej w temperaturze 56 °C przez 30 minut. Butelkę należy delikatnie obracać w przybliżeniu co 10 minut. (W celu zapewnienia dokładności należy użyć butelki o podobnej wielkości wypełnionej wodą. W butelce z wodą należy umieścić termometr, aby stwierdzić moment osiągnięcia 56 °C. Od tego momentu należy rozpocząć odliczanie czasu). Dezaktywowany termicznie FBS może wymagać wirowania w celu usunięcia osadów; można go rozdzielić na alykwoaty i ponownie zamrozić w temperaturze -20 °C.

L-glutamina

Zawsze rozmrażaj nową alikwot L-glutaminy do każdego eksperymentu.

B27

Aliquoty B27 można przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego magazynowania lub w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.

Dyskusja

Opisaliśmy metodę wyizolowania i hodowli neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego szczura. Procedura ta jest rutynowo stosowana w naszym laboratorium do niezawodnego przygotowywania neuronów w celu badania komórkowych i molekularnych mechanizmów prowadzenia aksonów. W przypadku eksperymentów z zakresu biologii komórki i immunochemii, preparaty z jednego miotu dostarczają wystarczającej liczby neuronów. Gdy wymagana jest większa liczba komórek, na przykład w wielu eksperymentach biochemicznych, konieczne m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pożywka Neurobasal, płyn	Invitrogen	21103-049	Zobacz przepisy i komentarze
suplement B27 50X	Invitrogen	17504	Zobacz przepisy i uwagi
0,01% roztwór poli-L-lizyny	Sigma-Aldrich	P4707
pożywka L-15, proszek	Invitrogen	41300-070
Trypsyna 2,5% (10X)	Invitrogen	15090-046
DNaza I, 25000 U/mL	Worthington Biochemical
MgSO₄4	Sigma-Aldrich	M2643
HBSS, Ca2+/Mg2+-wolny	Invitrogen	14170-112
L-glutamina 200 mM, roztwór	Invitrogen	25030-081	Zobacz przepisy i uwagi
Disekcja grzbietowej części rdzenia kręgowego embrionalnego szczura (patrz również Tabela I) szczur w 13. dniu ciąży (E13) Etanol 70% Nożyczki chirurgiczne, Fine Science Tools Pinceta, Dumont #5, Fine Science Tools Szalki Petriego pożywka L-15 Mikroskop stereoskopowy, Leica Plastikowe pipety transferowe Mikronożyczki, Fine Science Tools Igły wolframowe i uchwyty do pinów (jedna igła w kształcie haczyka, jedna igła w kształcie litery L, jedna igła prosta), Fine Science Tools surowica konia inaktywowana termicznie (HiHS) plastikowe probówki 15 ml Kultura neuronów komisuralnych (patrz również Tabela I) Inkubatory do hodowli tkankowych (37°C, 5% CO2, z kontrolowaną wilgotnością) szklane laminki German Desag i/lub plastikowe szalki do hodowli tkankowych Poly-L-lizyna, Sigma Sterylna woda Milli-Q2O Neurobasal, Invitrogen inaktywowana ciepłem płodowa surowica bydlęca (HiFBS) L-glutamina B27, Invitrogen antybiotyki penicylina/streptomycyna 37°łaźnia wodna C Sterylne pipety Pasteura Palnik Bunsena HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen DNaza, Worthington MgSO₄4 Wirówka Hemacytometr Roztwór błękitu trypanu